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Photostimulation par Femtosecond Laser Actives Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photo

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59661
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 3
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai Sixth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Ultrafast Laser Laboratory, College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University

Summary

Le laser femtoseconde étroitement focalisé peut fournir la stimulation précise aux cellules en étant couplé dans une microscopie confocale permettant l'observation et la photostimulation en temps réel. La photostimulation peut activer des événements moléculaires cellulaires, y compris la voie de signalisation ERK et les éclairs mitochondriaux des espèces réactives d'oxygène.

Abstract

Le contrôle direct des événements moléculaires définis cellulaires est important pour les sciences de la vie. Récemment, des études ont démontré que la stimulation laser femtoseconde peut simultanément activer plusieurs voies de signalisation moléculaire cellulaire. Dans ce protocole, nous montrons qu'en couplant le laser femtoseconde dans un microscope confocal, les cellules peuvent être stimulées précisément par le laser étroitement focalisé. Certains processus moléculaires qui peuvent être observés simultanément sont ensuite activés. Nous présentons des protocoles détaillés de la photostimulation pour activer la voie de signalisation de kinase réglée de signal extracellulaire (ERK) dans les cellules de Hela. Les éclairs mitochondriaux des espèces réactives d'oxygène (ROS) et d'autres événements mitochondriaux peuvent également être stimulés si la focalisation de l'impulsion laser de femtoseconde sur une certaine structure tubulaire mitochondriale. Ce protocole comprend le prétraitement des cellules avant la photostimulation, la livraison de la photostimulation par un flash laser femtoseconde sur la cible, et l'observation / l'identification des changements moléculaires par la suite. Ce protocole représente un outil tout optique pour les recherches biologiques connexes.

Introduction

La technologie de contrôle des molécules de signalisation cellulaire est une partie importante du développement des sciences de la vie. Traditionnellement, la méthode la plus couramment utilisée est le traitement biochimique par des médicaments ou des matériaux biologiques1,2,3. Au cours de la dernière décennie, l'invention de l'optogénétique ouvre une nouvelle ère pour la modulation des signaux moléculaires cellulaires. La transfection avec des protéines sensibles à la lumière par génie génétique fait de la lumière un outil puissant pour moduler diverses activités protéiques dans les cellules cibles. Cette technologie a fait des progrès encourageants tels que l'excitation et l'inhibition du signal neuronal, la promotion de l'expression des gènes, la manipulation des modèles de signal cellulaire, menant différents destins cellulaires et la recherche pathologique4,5 ,6,7,8,9. Cependant, la lumière ne peut fonctionner qu'en transfectant les cellules avec des protéines optogénétiques. Au stade actuel, il existe des méthodes rares qui permettent à la lumière de contrôler les molécules cellulaires directement en plus de l'optogénétique.

Le laser Femtosecond a fait progresser les recherches biologiques en fournissant une excitation multiphoton efficace tout en maintenant une bonne sécurité biologique. En déployant diverses stratégies de traitement photo, il a réalisé de nombreuses réalisations telles que la microscopie multiphoton, les microsurgeries et les applications optogénétiques multiphoton10,11,12,13 ,14,15,16. Des études récentes montrent que la stimulation laser femtoseconde a été démontrée comme une méthode optique très efficace pour induire directement des événements de signalisation moléculaire. Il a été constaté que l'irradiation laser femtoseconde étroitement focalisée sur le réticulum endoplasmique (ER) est capable d'épuiser le calcium dans les urgences et d'activer les canaux de calcium activé par le calcium (CRAC) pour former des signaux de calcium dans les cellules17. Ce signal de calcium photo-activé peut se propager entre plusieurs types de cellules18,19,20. En outre, il a également la capacité d'activer les voies de signalisation cellulaire telles que le facteur nucléaire des cellules T activées (NFAT) et la voie de signalisation ERK21,22. En ajustant l'intensité et la localisation de l'exposition au laser femtoseconde dans les cellules, par exemple, en concentrant le laser sur les mitochondries, il peut influencer la morphologie mitochondriale et les événements moléculaires23,24, 25. Plus précisément, les éclats de la génération mitochondriale de ROS peuvent être excités par la photostimulation, qui est marquée comme clignotements fluorescents dans les mitochondries (mitoflashes).

Par conséquent, la technologie de photostimulation est d'un bon potentiel pour être largement appliquée dans la recherche biologique connexe. C'est également une bonne chance d'étendre les applications laser femtoseconde dans le contrôle des molécules de signalisation cellulaire et des fonctions en plus de la microscopie. Ici, nous fournissons les détails techniques de la photostimulation. La photostimulation est réalisée en couplant un laser femtoseconde à un microscope confocal pour fournir une cellule cible unique avec une photostimulation flash courte. Il peut initier une activation ERK efficace et contrôlable dans la cellule. Si la photostimulation est située sur la structure tubulaire mitochondriale, le potentiel de membrane mitochondriale, la morphologie, le ROS, et les pores de transition de perméabilité, peuvent tous être commandés par la photostimulation. Basé sur ce schéma de photostimulation, nous fournissons une méthode détaillée d'activer la voie de signalisation ERK et d'influencer les événements mitochondriaux multiples dans les cellules Hela. Ce protocole élucide le processus de la prestation de la stimulation laser femtoseconde dans les cellules cibles.

Le système de photostimulation est établi sur un microscope confocal avec un électrocouple laser femtoseconde en elle pour la stimulation simultanée et la microscopie continue. Le laser femtoseconde (longueur d'onde : 1 040 nm, taux de répétition : 50 MHz, largeur d'impulsion : 120 fs, puissance moyenne de sortie maximale : 1 W) est divisé en deux faisceaux avant le couplage. L'un est guidé à travers un télescope relais composé d'une paire de lentilles. Il est ensuite directement reflété dans l'ouverture arrière d'un objectif (60x, N.A. 1.2, immersion dans l'eau) pour former un focus diffraction-limite (Stim-A). L'autre est reflétée dans la trajectoire optique de balayage du microscope confocal pour fonctionner comme un mode de balayage à deux photons (Stim-B). Stim-A présente un point de focalisation fixe au centre du champ de vision (FOV). Stim-B est une zone de balayage confocal partiel pré-conçue dans le FOV. Stim-A et Stim-B sont représentés à la figure 1A. Une caméra CCD sous le miroir dichroique (DM) fournit l'imagerie de champ lumineux pour surveiller le foyer du laser de femtoseconde.

Il y a quelques éléments essentiels cruciaux pour les expériences suivantes. Dans ce protocole, une source laser en fibre femtoseconde (1040 nm, 50 MHz, 120 fs) est utilisée comme exemple. Dans la pratique, la plupart des oscillateurs commerciaux femtoseconde peuvent être utilisés tant que la largeur de l'impulsion est plus courte que 200 fs et la densité de puissance maximale devrait être au-dessus du niveau de 1011 - 1012 W/cm2. Par exemple, un laser Ti: Sapphire habituellement utilisé pour la microscopie multiphoton est capable de remplacer le laser femtoseconde montré dans la figure 1B. La puissance du laser et d'autres paramètres de photostimulation doivent être réglés parce que les paramètres optiques (largeur d'impulsion, longueur d'onde et taux de répétition) varient beaucoup dans différents lasers femtosecondes qui induisent ainsi différentes excitations d'efficacité multiphoton.

En plus de la stimulation laser femtoseconde, la microscopie confocale fournit une imagerie cellulaire continue pour surveiller la dynamique moléculaire en temps réel dans les deux modes Stim-A et Stim-B. Les deux schémas de photostimulation (Stim-A et Stim-B) sont contrôlés par un obturateur mécanique à résolution milliseconde (figure 1).

En mode Stim-A, la position de mise au point laser est fixée au centre de FOV. Un télescope relais est utilisé pour assurer la mise au point du laser femtoseconde à être situé sur le plan d'imagerie confocale en admettant la distance entre deux lentilles dans la direction verticale (la direction de propagation laser, verticale au plan d'imagerie confocale, comme indiqué dans Figure 1). Grâce à l'imagerie sur le terrain lumineux de la caméra CCD, le diamètre de la mise au point laser peut être mesuré (2 m, figure 2B). Les durées de stimulation et les temps d'exposition sont contrôlés par un obturateur pendant le processus d'imagerie confocale.

En mode Stim-B, la zone de stimulation peut être pré-attribuée manuellement dans le logiciel de contrôle de l'imagerie confocale à n'importe quelle forme comme la ligne, le polygone ou le cercle. L'obturateur est synchronisé avec le processus de numérisation confocale. Il s'ouvre à l'heure pré-conçue qui est fixé par le logiciel de contrôle d'imagerie confocale. Ensuite, la zone de stimulation est numérisée par laser femtoseconde comme microscopie confocale. Ainsi, l'échantillon n'est stimulé par le laser femtoseconde que lorsque le processus de balayage confocal entre dans un cadre d'imagerie donné.

Le système de photostimulation peut être établi sur les microscopes métallurgiques inversés et droits selon les sujets de l'expérience. Les cellules in vitro cultivées dans les plats Petri sont préférables de travailler avec des microscopes inversés. Les animaux, en particulier les cerveaux des animaux vivants, sont plus appropriés avec des microscopes droits. Dans cette étude, nous prenons le microscope inversé comme exemple. Il convient de noter que la couverture du plat Petri n'est pas ouverte pendant l'ensemble des expériences.

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Protocol

MISE EN GARDE: Le protocole présenté ci-dessous implique l'utilisation du laser NIR femtoseconde et des produits chimiques toxiques. S'il vous plaît prêter attention à tous les dommages possibles induits par les procédures d'expérience. Veuillez lire les fiches de sécurité de tous les produits chimiques ou autres matériaux pertinents avant utilisation. S'il vous plaît suivre les instructions de sécurité des installations laser ou consulter les professionnels pour obtenir des conseils avant d'utiliser source laser.

1. Préparation expérimentale

  1. Mise en place du système de photostimulation
    REMARQUE: Le système se compose d'un laser femtoseconde et d'un laser (à portée visible pour l'excitation de fluorescence) scannant le microscope confocal. Dans la figure 1, un laser femtoseconde fibre (1 040 nm, 50 MHz, 120 fs, 1 W) est utilisé pour le couplage. Les paramètres ne sont pas fixes ou nécessaires. Il peut être remplacé par un laser Ti: Sapphire ou d'autres oscillateurs commerciaux femtoseconde dans la gamme NIR.
    1. Accordez-vous sur le laser femtoseconde et le microscope confocal.
      REMARQUE: S'il vous plaît définir la puissance laser femtoseconde à un faible niveau (50 mW) dans le processus d'ajustement de la trajectoire optique.
    2. Utilisez des miroirs réfléchissants (RM1 et RM2 indiqués dans la figure 1B) pour diriger le faisceau laser femtoseconde à travers un obturateur mécanique. Ouvrez l'obturateur.
    3. Définir un séparateur de faisceau 50/50 (BS, Figure 1B) pour diviser le faisceau laser femtoseconde en deux faisceaux distincts (faisceau de transmission et faisceau de réflexion). Dirigez RM2 et BS pour faire le faisceau laser femtoseconde coïncident avec le faisceau laser de balayage.
      REMARQUE: (1) Un iris de référence (Iris 1, Figure 1B) derrière le miroir dichroïque à longue passe (DM, 700 nm de longueur d'onde coupée, Figure 1B) est utilisé pour le positionnement de la trajectoire laser de balayage. (2) Le système ne peut fonctionner qu'en mode Stim-A ou Stim-B, respectivement. Pour le mode Stim-A, le BS peut être supprimé. Pour Stim-B, le BS peut être remplacé par un RM.
    4. Définir un télescope de relais composé d'une paire de lentilles pour augmenter la largeur du faisceau de transmission, qui est composé de l'ouverture arrière de l'objectif.
      REMARQUE: (1) Les iris de référence 2 et 3 (Figure 1B) sont réglés pour collimate le faisceau laser femtoseconde (Figure 1B). (2) Le grossissement du télescope relais dépend du diamètre d'origine du faisceau laser femtoseconde et du diamètre de l'ouverture arrière de l'objectif.
    5. Steer RMs (RM 3-5, Figure 1B) pour aligner le faisceau élargi dans le microscope. Dirigez RM 4 et RM 5 pour régler le focus du laser femtoseconde au centre de FOV.
    6. Mesurer l'efficacité de transmission de l'objectif du laser femtoseconde.
      REMARQUE: S'il vous plaît mesurer la puissance laser à Stim-A et Stim-B respectivement en raison des différentes trajectoires de pénétration du laser dans ces deux modes. Il utilisera la puissance au spécimen pour illustrer les procédures d'expérience connexes ci-dessous.
    7. Accordez l'obturateur, le laser femtoseconde et le microscope confocal jusqu'à ce que les expériences commencent.
      REMARQUE: Dans les expériences suivantes, Stim-A et Stim-B ne travaillent pas ensemble. Si vous utilisez Stim-A, le faisceau laser femtoseconde de Stim-B doit être bloqué. D'autre part, le faisceau de Stim-A doit être bloqué si le système fonctionne en mode Stim-B.
  2. Préparer le milieu de culture : le glucose élevé du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin foetal (FBS).
  3. Préparer le plasmide de l'ADN ERK2-GFP, le plasmide de l'ADN Mito-GFP et le plasmide à l'ADN de la matrice mitochondriale permuté circulairement permuté (mt-cpYFP) d'ADN plasmide. Garder les plasmides à -20 oC jusqu'à l'utilisation.
  4. Préparer la tétramétyrhodamine (TMRM, 100 M) et la polyéthylénimine (PEI 1 mg/mL). Gardez-les à -20 oC jusqu'à utilisation.
  5. Préparer 5 % de paraformaldéhyde, 0,5 % Triton X-100, anti-eIF4E (facteur d'initiation à la traduction eucaryotique 4E), anticorps (phosphore S209, 1 mg/mL), anticorps anti-Bax (1 mg/mL), anticorps c anticytochromes (1 mg/mL), anticorps secondaires (anti-Rabbit IgG H-L, Alexa Fluor 488, 1 mg/mL), et 1% BSA avec 0.1% Tween20. Gardez ces réactifs à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
  6. Préparer des matériaux stériles : bouteilles de culture cellulaire, plats Petri avec fond coulien en verre (figure 3A), plats avec fond de verre, grille de localisation de cellules de 500 m (figure3B, pour localiser les cellules photostimulées), tubes de 1,5 ml et 10 ml, et 1 mL, 100 l et 10 ttes et pointes.
  7. Préparer l'équipement standard de laboratoire de culture cellulaire : un incubateur de culture cellulaire fixé à 5 % de CO2 et 37 oC, et un coffret de sécurité biologique.

2. Culture cellulaire et transfection

REMARQUE: La cellule Hela (lignée cellulaire dérivée de cellules cancéreuses cervicales prélevée le 8 février 1951 chez Henrietta Lacks)26 est utilisée comme exemple dans ce protocole.

  1. Passage cellulaire
    1. Retirez le milieu de culture de la bouteille de culture cellulaire contenant suffisamment de cellules.
    2. Laver la bouteille avec 2 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS). Retirez le PBS.
    3. Ajouter 1 ml de trypsine lentement et taper légèrement sur la bouteille. Remettre la bouteille dans l'incubateur et incuber les cellules 3 min à 37 oC.
    4. Retirez la trypsine. Ajouter 2-3 ml de milieu de culture. Pipette le milieu plusieurs fois pour aider les cellules à se détacher. Transférer le milieu avec les cellules dans un tube de 10 ml.
    5. Prenez 10 l'échantillon de l'échantillon du tube pour le comptage cellulaire.
    6. Semencer 25 000 cellules dans un plat Petri (figure 3A) et ajouter un milieu de culture jusqu'à 1 ml.
    7. Remettre le plat contenant des cellules dans l'incubateur. Incuber les cellules à 24 h à 37 oC avant la transfection.
  2. Transfection cellulaire
    1. Utilisez 0,5 g de plasmide d'ADN (ERK2-GFP, Mito-GFP ou mt-cpYFP) pour la transfection par plat. Ajouter 0,5 g de plasmide et 2,5 g de l'Ile-du-Prince-Édouard dans 50 L de DMEM dans un tube de 1,5 ml. Incuber les supports mélangés 10 min à température ambiante.
    2. Prenez le plat avec les cellules de l'incubateur. Remplacer le milieu de culture par 1 ml de DMEM.
    3. Ajouter les médias mixtes ADN/PEI dans les cellules goutte à goutte. Remettez les cellules dans l'incubateur.
    4. Incuber les cellules à 3 h à 37 oC et remplacer les milieux mixtes DMEM DNA/PEI par 1 ml de milieu de culture.
    5. Incuber les cellules transfectées à 24 h à 37 oC avant les expériences de photostimulation.

3. Activation d'ERK2 par Photostimulation de Femtosecond Laser

  1. Allumez le laser femtoseconde et assurez-vous que l'obturateur est fermé.
  2. Allumez le microscope confocal à balayage laser et ouvrez le logiciel de microscope. Définir le laser d'excitation à 488 nm. Définir le niveau de puissance de 488 nm laser à 0,1 mW. Définir la taille de l'imagerie de 512 x 512 pixels. Définir le temps d'intervalle de chaque pixel en tant que 2,4 degrés. Définir le temps d'intervalle entre deux images à 6 s pour minimiser le photoblanchiment et les photodommages aux cellules. Définir des cadres d'imagerie totaux à environ 300 images pour fournir une microscopie continue de 30 min dans une expérience individuelle.
    REMARQUE: L'intervalle de deux cadres adjacents, les cadres d'imagerie totaux et le temps d'imagerie de la microscopie continue peuvent être ajustés en fonction des exigences expérimentales. Si une expérience individuelle dure plus de 2 h, veuillez définir le système d'incubation du CO2 (indiqué à la figure 4) pour le microscope tel qu'il est présent à l'étape 3.3 afin de fournir un environnement de 5 % de CO2 et 37 oC pour le maintien de la viabilité cellulaire. Si une expérience individuelle est limitée dans un rayon de 2 h, le système d'incubation du CO2 n'est pas nécessaire.
  3. Allumez le système d'incubation du CO 2, allumez tout le chauffe-eau et fixez la température de travail à 37 oC. Attendez que la température monte jusqu'à 37 oC et la concentration de CO2 à 5 %. Placez l'étape de l'incubateur sur la scène du microscope comme le montre la figure 4A.
  4. Préparer les cellules Hela transfectées avec ERK2-GFP comme décrit à l'étape 2.
    REMARQUE: Dans une expérience individuelle, le système Stim-A ou Stim-B est appliqué pour fournir la photostimulation aux cellules. Les étapes 3.5 et 3.6 présentent des étapes détaillées sous Stim-A et Stim-B respectivement.
  5. Fournir la stimulation laser femtoseconde dans les cellules cibles en utilisant le mode Stim-A
    REMARQUE: Avant la procédure de photostimulation, s'il vous plaît assurez-vous que le diamètre de la mise au point est d'environ 2 m. Ce processus est décrit à l'étape 3.5.1 et 3.5.2.
    1. Prenez le plat contenant des cellules transfectées avec ERK2-GFP de l'incubateur et mettez le plat sur la scène du microscope.
    2. Démarrer le mode de numérisation rapide à travers le logiciel de fonctionnement du microscope. Tune l'objectif d'acquérir des images fluorescentes claires des cellules. Arrêtez la numérisation rapide. Passez au mode d'imagerie à champ lumineux par la caméra CCD (Figure 2A). Ouvrez l'obturateur et ajustez la distance entre deux lentilles du télescope relais pour assurer le diamètre de la mise au point laser femtoseconde à 2 m (figure2B). Fermez l'obturateur pour terminer l'ajustement.
      REMARQUE: Une flèche de référence peut être étiquetée pour indiquer la mise au point laser (Figure 2). En attendant, une flèche de référence peut également être placée au centre de la fenêtre d'imagerie fluorescente pour indiquer la position du foyer du laser femtoseconde.
    3. Définir la puissance du laser femtoseconde à 15-40 mW (810 nm, 65 fs, 80 MHz), ou 20-60 mW (1040 nm, 120 fs, 50 MHz) au spécimen. Définir l'heure d'ouverture de l'obturateur à 0.05-0.2 s.
    4. Utilisez le mode de numérisation rapide pour sélectionner une cellule cible bien exprimée ERK2-GFP.
    5. Déplacer la scène afin de localiser la zone cytosol de la cellule cible sélectionnée au centre de FOV sous l'imagerie de champ lumineux de la caméra CCD (Figure 2A).
    6. Cliquez sur le bas Démarrer pour démarrer les progrès continus d'imagerie par microscopie.
    7. Ouvrez l'obturateur à n'importe quel créneau horaire prédéfini pour fournir la stimulation laser femtoseconde conçue à l'étape 3.5.3 dans la cellule cible.
      REMARQUE: (1) La photostimulation peut être effectuée à tout moment dans la séquence de microscopie confocale contrôlée par l'obturateur. (2) La photostimulation peut être livrée plusieurs fois dans la même position pendant la séquence de microscopie confocale.
    8. Attendez que le processus d'imagerie soit terminé. Enregistrer les données d'imagerie pour une analyse plus poussée des données.
  6. Fournir la stimulation laser femtoseconde dans les cellules cibles en utilisant le mode Stim-B
    1. Définir la puissance du laser femtoseconde à 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1040 nm) au spécimen.
    2. Prenez le plat contenant des cellules transfectées avec ERK2-GFP de l'incubateur et mettez-le sur la scène du microscope.
    3. Utilisez le mode de numérisation rapide pour sélectionner une cellule cible bien exprimée ERK2-GFP.
    4. Définir le processus d'imagerie confocale comme étape 3.2. Définissez un cadre de balayage spécial comme le cadre de stimulation dans le processus d'imagerie. Définir le paramètre du cadre de simulation.
      1. Définir une région de balayage (2 x 2-3 x 3 m2) à la zone cytosol près du noyau de la cellule cible.
      2. Définir le temps total de numérisation à 0.1-0.2 s. Synchroniser l'obturateur du laser femtoseconde avec le balayage confocal selon la zone de photostimulation prédéfinie, qui n'est ouverte que lorsque le balayage laser tombe dans le cadre de stimulation et se ferme immédiatement quand il sort.
        REMARQUE: (1) La région photostimulaion peut être réglé à n'importe quelle taille. (2) La photostimulation peut être effectuée à n'importe quel créneau horaire prédéfini dans la séquence de microscopie confocale. (3) La photostimulation peut être réalisée plusieurs fois sur les mêmes zones prédéfinies ou différentes dans le FOV dans cette séquence de microscopie confocale.
    5. Cliquez sur le bas Démarrer pour démarrer les progrès continus d'imagerie par microscopie.
    6. Attendez que le processus d'imagerie soit terminé. Enregistrer les données d'imagerie pour une analyse plus poussée des données.
  7. Éteignez le laser femtoseconde et le microscope confocal après l'expérience.

4. Activation de eIF4E (Substrate of ERK) par Femtosecond Laser Simulation

  1. Préparation des cellules Hela
    1. Suivez les étapes 2.1.1-2.1.5.
    2. Semencer 20 000 cellules dans un plat Petri avec des grilles de localisation cellulaire (figure 3B) pour localiser les cellules photostimulées. Ajouter le milieu de culture jusqu'à 1 ml.
    3. Remettre le plat avec les cellules dans l'incubateur. Incuber les cellules 24 h à 37 oC avant le traitement au laser femtoseconde.
  2. Allumez le laser femtoseconde et assurez-vous que l'obturateur est fermé.
  3. Allumez le microscope confocal à balayage laser et ouvrez le logiciel de microscope.
  4. Préparer le système d'incubation du CO2 comme déclaration à l'étape 3.3.
  5. Fournir la stimulation laser femtoseconde dans les cellules cibles en utilisant le mode Stim-A
    1. Définir la puissance du laser femtoseconde à 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1 040 nm) au spécimen. Définir l'heure d'ouverture de l'obturateur à 0.05-0.2 s.
    2. Prenez le plat avec les cellules de l'incubateur et montez-le dans l'incubateur CO2 sur le stade du microscope.
    3. Déplacez l'objectif dans la direction verticale pour localiser le plan d'imagerie sous l'imagerie de champ lumineux de la caméra CCD. Déplacez l'étape du spécimen dans la direction horizontale pour s'assurer qu'aucune cellule ne se situe au centre de FOV. Ouvrez l'obturateur et ajustez la distance entre deux lentilles du télescope relais pour assurer le diamètre de la mise au point laser femtoseconde à 2 m. Fermez l'obturateur pour terminer l'ajustement.
    4. Déplacez l'étape du microscope pour sélectionner au hasard 5 à 10 grilles. Il peut être indiqué et localisé par les grilles dans le bas de la vaisselle Petri sous l'imagerie de champ lumineux de la caméra CCD. Marquer/enregistrer les coordonnées des grilles sélectionnées dans le plat.
    5. Stimulez toutes les cellules situées dans les grilles sélectionnées une par une manuellement sous l'imagerie en champ lumineux de la caméra CCD.
  6. Remettre le plat dans l'incubateur. Incuber les cellules à 24 h à 37 oC avant la microscopie d'immunofluorescence. Éteignez le laser femtoseconde et le microscope confocal après la procédure de phototimualtion.
  7. Microscopie d'immunofluorescence de l'eIF4E phosphorylé dans les cellules avec photostimulation pour la confirmation de l'activation d'ERK
    1. Retirez le plat contenant des cellules avec un traitement de photostimulation à l'étape 4.5 de l'incubateur. Retirez le support de culture. Laver les cellules avec PBS une fois. Supprimer PBS.
    2. Ajouter 1 ml de paraformaldéhyde de 5 % (4 oC) dans le plat. Fixer les cellules avec 5% de paraformaldéhyde pendant 10 min. Retirez le tampon de paraformaldéhyde. Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min deux fois. Supprimer PBS.
    3. Ajouter 1 ml de 0,5 % de Triton X-100 dans le plat. Incuber les cellules 15 min à température ambiante. Retirez le tampon Triton X-100. Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min deux fois. Supprimer PBS.
    4. Ajouter 1 ml de tampon BSA de 1 % dans le plat. Incuber les cellules 30 min à température ambiante. Retirez le tampon BSA.
    5. Diluer l'anticorps anti-eIF4E (phosphore S209) dans 1 ml de PBS avec 1% de BSA à une concentration finale de 1 g/mL. Ajouter le tampon dans le plat. Incuber les cellules de 10 à 12 h à 4 oC. Retirez le tampon.
    6. Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min deux fois. Supprimer PBS.
    7. Diluer l'anticorps secondaire anti-Rabbit IgG H-L dans 1 ml de PBS avec 1% de BSA à une concentration finale de 2 'g/mL. Ajouter le tampon dans le plat. Incuber les cellules 2 h à température ambiante. Retirez le tampon.
    8. Laver les cellules avec du PBS. Supprimer PBS.
    9. Ajouter 1 ml de PBS dans le plat.
    10. Allumez le microscope confocal à balayage laser. Ouvrez le logiciel de microscope. Définir le laser d'excitation à 488 nm. Définir le niveau de puissance de 488 nm laser à 0,1 mW. Définir la taille de l'imagerie de 512 x 512 pixels. Définir le temps d'intervalle de chaque pixel en tant que 2,4 degrés.
    11. Mettez le plat avec des cellules de coloration immunofluorescentes sur le stade du microscope. Localiser les boîtes sélectionnées sous l'imagerie en champ lumineux de la caméra CCD.
    12. Démarrer la numérisation confocale à cadre unique. Enregistrez les images fluorescentes des cellules de photostimulation.
    13. Déplacez la scène au hasard pour localiser les zones sans stimulation laser femtoseconde. Démarrer la numérisation confocale à cadre unique. Enregistrez les images fluorescentes d'aucune cellule de stimulation comme données de contrôle.
  8. Éteignez le microscope confocal après l'expérience.

5. Activation de Mitoflashes et autres événements mitochondriaux par photostimulation

REMARQUE: Pour observer la dynamique morphologique mitochondriale, les cellules de Hela sont transfected avec Mito-GFP dans l'étape 5.1 pour indiquer fluorescentement des mitochondries. Pour observer les mitoflashes, les cellules Hela sont transfectées avec mt-cpYFP dans l'étape 5.1.

  1. Préparer les cellules Hela transfectées avec Mito-GFP ou mt-cpYFP après l'étape 2.
  2. Allumez le laser femtoseconde et assurez-vous que l'obturateur est fermé.
  3. Allumez le microscope confocal à balayage laser. Définir le laser d'excitation à 488 nm. Définir le niveau de puissance de 488 nm laser à 0,1 mW. Définir la taille de l'imagerie de 512 x 512 pixels. Définir le temps d'imagerie total de chaque image en tant que 2,2 s. Définir le temps d'intervalle entre deux images à 0 s. Définir les images totales comme 200 images pour fournir une microscopie continue de 440 s dans une expérience individuelle.
    REMARQUE: L'intervalle de deux cadres adjacents, les cadres d'imagerie totaux et le temps d'imagerie de la microscopie continue peuvent être ajustés en fonction des exigences expérimentales.
  4. Préparer le système d'incubation du CO2 tel que décrit à l'étape 3.3 si nécessaire.
  5. Fournir la stimulation laser femtoseconde dans la mitochondrie cible en utilisant le mode Stim-A
    1. Prenez le plat contenant des cellules transfectées avec Mito-GFP ou mt-cpYFP de l'incubateur et mettez le plat sur la scène du microscope.
    2. Vérifiez l'état du laser femtoseconde comme étape 3.5.2. Assurez-vous que le foyer du laser femtoseconde est situé dans le centre de FOV. Placez une flèche de référence au centre de la fenêtre d'imagerie fluorescente pour indiquer la position de la mise au point.
    3. Définir la puissance du laser femtoseconde à 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) au spécimen. Définir l'heure d'ouverture de l'obturateur à 0.05-0.1 s.
    4. Utilisez le mode de numérisation rapide pour sélectionner une cellule cible bien exprimée Mito-GFP ou mt-cpYFP.
    5. Sélectionnez une mitochondrie au hasard dans la cellule cible comme sujet expérimental. Déplacez l'étape du microscope afin de localiser la structure tubulaire mitochondriale cible au centre de FOV (indiquer par la flèche de référence) par mode de balayage rapide.
    6. Cliquez sur le bas Démarrer pour démarrer les progrès continus d'imagerie par microscopie.
    7. Ouvrez l'obturateur à n'importe quel moment prédéfini pour délivrer la stimulation laser femtoseconde conçue à l'étape 5.5.3 dans la structure tubulaire mitochondriale cible.
      REMARQUE: (1) L'exposition au laser femtoseconde sur la structure tubulaire mitochondriale peut être contrôlée par l'obturateur à tout moment pendant la microscopie confocale. (2) Effectuer une seule exposition au laser femtoseconde dans une expérience parce qu'une stimulation laser femtoseconde peut perturber le statut mitochondrial sur une longue période.
    8. Attendez que le processus d'imagerie soit terminé. Enregistrer les données d'imagerie pour une analyse plus poussée des données.
  6. Éteignez le laser femtoseconde et le microscope confocal après l'expérience.

6. Oscillation du potentiel de membrane mitochondriale sur des mitochondries cibles dans les cellules hela par stimulation laser de Femtoseconde

  1. Préparer les cellules Hela en suivant les étapes 2.1.1-2.1.6.
  2. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC avant l'expérience.
  3. Préparer la solution de coloration TMRM : diluer le TMRM en 1 ml de DMEM avec 10% de FBS à une concentration finale de 100 nM.
  4. Retirez le plat avec des cellules préparées à l'étape 5.2.1 et 5.2.2 de l'incubateur. Retirez le support de culture. Ajouter la solution de coloration TMRM préparée à l'étape 6.3 dans le plat. Tache de 15 à 20 min à 37 oC dans l'incubateur. Retirez la solution de coloration. Laver les cellules avec PBS une fois. Ajouter 1 ml de milieu de culture dans le plat.
  5. Allumez le laser femtoseconde et assurez-vous que l'obturateur est fermé.
  6. Allumez le microscope confocal à balayage laser. Ouvrez le logiciel de microscope. Définir le laser d'excitation à 532 nm. Définir le niveau de puissance du laser de 532 nm à 0,1 mW. Définir la taille de l'imagerie à 512 x 512 pixels et le temps de génération d'images à 2,2 s. Définir le temps d'intervalle entre deux images à 0 s. Définir les images totales en 200 images pour fournir une microscopie continue de 440 s dans une expérience individuelle.
    REMARQUE: L'intervalle de deux cadres adjacents, les cadres d'imagerie totaux et le temps d'imagerie de la microscopie continue peuvent être ajustés en fonction des exigences expérimentales.
  7. Préparer le système d'incubation du CO2 décrit à l'étape 3.3 si nécessaire.
  8. Utilisez le mode Stim-A pour fournir la stimulation laser femtoseconde dans la mitochondrie cible. Suivez les étapes 5.5.1-5.5.8 pour terminer l'expérience.
    REMARQUE: Dans l'étape 6.8, sélectionnez une mitochondrie qui est bien tachée avec TMRM comme mitochondrie cible.
  9. Éteignez le laser femtoseconde et le microscope confocal après l'expérience.

7. Changements de Bax et Cytochrome C sur les mitochondries cibles dans les cellules Hela par la stimulation laser Femtoseconde

REMARQUE: Dans cette expérience, ensemencer les cellules dans les plats Petri avec des grilles de localisation cellulaire (Figure 3B) pour localiser la cellule qui est traitée par laser femtoseconde. Tachez les cellules avec TMRM pour localiser la mitochondrie qui est sélectionnée pour être stimulée par le laser femtoseconde.

  1. Préparer les cellules Hela dans un plat Petri avec des grilles de localisation cellulaire (Figure 3B) tel que décrit à l'étape 4.1.
  2. Tachez les cellules avec TMRM comme décrit dans les étapes 6.3 et 6.4.
  3. Allumez le laser femtoseconde et assurez-vous que l'obturateur est fermé.
  4. Allumez le microscope confocal à balayage laser. Ouvrez le logiciel de microscope. Définir le laser d'excitation à 532 nm. Définir le niveau de puissance du laser de 532 nm à 0,1 mW. Définir la taille de l'imagerie à 512 x 512 pixels et le temps de génération d'images à 2,2 s. Définir le temps d'intervalle entre deux images à 0 s. Définir les images totales en 50 images pour fournir une microscopie continue de 110 s dans une expérience individuelle.
  5. Fournir la stimulation laser femtoseconde dans la mitochondrie cible en utilisant le mode Stim-A
    1. Définir la puissance du laser femtoseconde à 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) au spécimen. Définir l'heure d'ouverture de l'obturateur à 0.05-0.1 s.
    2. Prenez le plat contenant des cellules tachées de l'incubateur et mettez le plat sur la scène du microscope.
    3. Utilisez le mode de numérisation rapide pour sélectionner la cellule cible qui est bien tachée avec TMRM.
    4. Déplacez la scène afin de localiser la structure tubulaire mitochondriale cible au centre de FOV en utilisant le mode de balayage rapide. Marquez le coordonnées de la grille que la cellule sélectionnée est située sous imagerie de champ lumineux.
    5. Cliquez sur le bas Démarrer pour démarrer les progrès continus d'imagerie par microscopie.
    6. Ouvrez l'obturateur à n'importe quel moment prédéfini de l'imagerie par microscopie progresse manuellement pour délivrer la stimulation laser femtoseconde conçue à l'étape 7.5.1 dans la structure tubulaire mitochondriale cible.
    7. Attendez que le processus d'imagerie soit terminé. Marquez la mitochondrie sélectionnée qui est simulée par laser femtoseconde. Enregistrer les données d'imagerie pour une analyse plus poussée des données.
    8. Éteignez le laser femtoseconde et le microscope confocal après l'expérience. Préparer la microscopie immunofluorescence de Bax ou cytochrome C sur les cellules expérimentales.
  6. Microscopie immunofluorescence de Bax ou cytochrome C sur le laser femtoseconde mitochondndrion traitée.
    1. Prenez le plat de l'étape du microscope.
    2. La coloration immunofluorescente complète de Bax ou cytochrome C suit les étapes 4.7.1-4.7.9.
      REMARQUE: Utilisez anti-Bax ou anticytochrome C au lieu de l'anti-eIF4E à l'étape 4.7.5 pour terminer la coloration immunofluorescente de Bax ou cytochrome C à l'étape 7.6.2.
    3. Allumez le microscope confocal à balayage laser et ouvrez le logiciel de microscope. Définir le laser d'excitation à 488 nm et 532 nm. Définir le niveau de puissance de 488 nm et 532 nm laser à 0,1 mW. Définir la taille de l'imagerie à 512 x 512 pixels et le temps de génération d'images à 2,2 s.
    4. Mettez le plat avec des cellules de coloration immunofluorescentes sur le stade du microscope. Localiser la grille sélectionnée sous l'imagerie en champ lumineux de la caméra CCD. Localiser la cellule qui est traitée par laser femtoseconde.
    5. Démarrer la numérisation confocale à cadre unique. Localiser la mitochondrie qui est stimulée par le laser femtoseconde. Enregistrer l'image fluorescente de la cellule de photostimulation pour une analyse plus approfondie des données.
  7. Éteignez le microscope confocal après l'expérience.

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Representative Results

La photostimulation peut être effectuée simultanément avec la microscopie continue de balayage confocal. La photostimulation peut commencer à n'importe quel créneau horaire prédéfini dans la séquence de microscopie confocale en time-lapse. La microscopie confocale peut surveiller les molécules cellulaires par imagerie fluorescente. Les réponses moléculaires à la photostimulation et à d'autres dynamiques peuvent être identifiées de cette façon. Théoriquement, si ERK est activé, il sera phosphorylé se déplacer du cytoplasme au noyau cellulaire27. Le destin spécifique de la cellule peut être réglé par certains modèles de ce signal ERK28. Dans des études récentes, la modulation optique basée sur l'optogénétique a fourni un contrôle précis élevé du signal ERK dans la durée et l'ampleur et a révélé que la dynamique perturbée de transmission de signal ERK conduit la prolifération incorrecte dans les cellules cancéreuses7, 8. Ici, nous démontrons la translocation D'ERK2 dans le noyau après traitement de la cellule avec un court flash de laser de femtoseconde en utilisant la méthode présentée dans ce protocole. Comme le montre la figure 5A, la fluorescence ERK2-GFP atteint le maximum après plusieurs minutes de simulation laser femtoseconde. Les molécules ERK2 seront déphosphorylées après l'activation des substrats en aval dans le noyau, puis l'ERK2 revient au cytoplasme indiqué par la diminution de la fluorescence nucléaire du GFP. ERK2 peut être activé plusieurs fois par plusieurs photostimulations (figure 5B). Par conséquent, il est capable de manipuler le modèle de signal ERK2 précisément en contrôlant le temps d'intervalle entre plusieurs stimuli. En outre, ERK2 peut être activé dans les cellules adjacentes autour de la cellule stimulée de temps en temps (Figure 5C). Cette observation indique que certaines molécules diffusibles peuvent être libérées par la cellule traitée avec le laser femtoseconde pour activer ERK2 dans les cellules adjacentes. La phosphorylation de la protéine eIF4E en aval erK2 peut être confirmée et visualisée par microscopie d'immunofluorescence (Figure 5D). Ce résultat indique que la stimulation laser femtoseconde peut activer avec succès la voie de signalisation ERK. Les résultats plus détaillés sont dans Wang S., et autres22.

Les flashs oxydatifs mitochondriaux (mitoflashes) sont des éclats oxydatifs dans les mitochondries qui s'enracinent dans la dynamique moléculaire mitochondriale complexe. Au cours de la dernière décennie, les mitoflashes sont réalisés comme un événement de signalisation des mitochondries élémentaires et prennent une part importante dans les fonctions cellulaires multitudinous29,30,31. Traditionnellement, les mitoflashes sont habituellement observés par hasard lors du traitement des cellules avec des produits chimiques pour fournir un stress indirect aux mitochondries29,30. En mettant en œuvre ce système de photostimulation, nous atteignons une manière contrôlable et précise d'exciter les mitoflashes au niveau tubulaire mitochondrial unique. L'excitation mitoflash réussie est montrée dans la figure 6A. Fait intéressant, les propriétés des mitoflashes tels que le pic d'impulsion, la largeur et les durées de réponse32 sont étroitement liées à la puissance laser femtoseconde. Une analyse quantitative plus détaillée des mitoflashes excités par la stimulation laser femtoseconde est dans Wang S., et autres32. Cette photostimulation aux mitochondries montre également des variétés de dynamique moléculaire mitochondriale, y compris la fragmentation et la restauration de la morphologie mitochondriale (Figure 6B), et l'oscillation du potentiel de membrane mitochondriale ( Figure 6C). Semblables aux mitoflashes photo-activés, ces événements de mitochondries ont des exécutions différentes avec différentes intensités de puissance de la photostimulation. Il est différent de l'activation de la voie de signalisation ERK. L'influence du laser femtoseconde est fortement limitée sur un seul tube mitochondrial. Des résultats plus détaillés sont dans Wang Y., et al. 24 et Shi F., et al. 25.

Figure 1
Figure 1 : Le système de photostimulation établi sur un couplage laser femtoseconde dans un microscope confocal. (A) Chemins optiques de (B) le système de photostimulation et d'imagerie confocale. Le laser femtoseconde est d'abord divisé par un splitter de faisceau 50/50 en deux faisceaux. La transmission est étendue par un télescope relais, puis réfléchie dans l'objectif de former Stim-A. Le faisceau de réflexion est aligné à travers le système de balayage au microscope pour former Stim-B. Une caméra CCD est utilisée pour fournir une imagerie brillante pour surveiller les cellules et le foyer du laser femtoseconde en mode Stim-A. Stim-A - une mise au point fixe dans le centre de FOV; Stim-B - un cadre de numérisation spécial à la zone pré-conçue. DM - miroir dichroic, BS - fendeur de faisceau, RM - miroir réfléchissant. La longueur d'onde du laser à balayage confocal est de 488 nm/532 nm/635 nm, et l'intervalle de longueur d'onde typique de la collection de fluorescence est de 560 nm/560-625 nm/gt; 625 nm. Le laser femtoseconde en fibre (1 040 nm, 120 fs, 50 MHz, 1 W) peut être remplacé par un laser Ti et Saphir (810 nm, 80 MHz, 65 fs, 1 W) ou d'autres oscillateurs laser femtosecondes commerciaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : En mode Stim-A, la localisation et la taille du laser femtoseconde se concentrent sur la cellule cible du plan d'imagerie confocale sous imagerie brillante. (A) Laser Femtoseconde est bloqué par l'obturateur. (B) Laser Femtoseconde est allumé. Flèche : la flèche de référence est placée au centre de FOV pour confirmer que la mise au point laser femtoseconde localise la position correcte. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Le plat Petri utilisé pour la culture cellulaire, la transfection et les expériences de photostimulation. (A) Le plat Petri de 35 mm avec un fond de verre de 15 mm de diamètre et 0,17 mm d'épaisseur. (B) Le plat Petri de 35 mm avec un fond en verre et une grille de localisation de cellules de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Le système d'incubation du CO 2. (A) L'étape de l'incubateur CO2 et (B) le panneau de contrôle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Photoactivation ERK en utilisant le mode Stim-A. (A) Stimulus photo unique (1 040 nm, 40 mW, 0,1 s) induit la translocation ERK2-GFP dans le noyau, puis de nouveau au cytoplasme. (B) Modèle de signal ERK2 médié par une seule exposition au laser femtoseconde (flèche rouge, 1 040 nm, 40 mW, 0,1 s) et deux photostimulations (flèches vertes, 810 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) activation ERK dans les cellules environnantes par une seule exposition au laser femtoseconde courte dans la cellule cible (flèche blanche, 810 nm, 24 mW, 0,2 s). (D) L'immunofluorescence de eIF4E-P montre une augmentation significative de 24 h après une photosimulation unique (810 nm, 25 mW, 0,2 s). Barre d'échelle de 10 m (A) et de 20 m (B, C). La fluorescence d'ERK2-GFP et eIF4E-P est excitée par 488 nm excitation laser et recueillidans le canal de 560 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Événements mitochondriaux multiples induits par la photostimulation sous le mode Stim-A. (A) Excitation de mitoflash sur le tubule mitochondrial stimulé par stimulus simple (810 nm, 16 mW, 0.1 s). (B) La fragmentation et la restauration morphologiques des mitochondries induites par une seule photostimulation (1 040 nm, 30 mW, 0,1 s). (C) Oscillation du potentiel de la membrane mitochondriale par stimulation laser femtoseconde unique (1040 nm, 20 mW, 0,1 s). Les flèches dans (A) (B) et (C) indiquent la position des photostimulations. Barre d'échelle de 10 m. La fluorescence de Mito-GFP ou mt-cpYFP est excitée par 488 nm excitation laser et recueillis dans le canal de 560 nm. La fluorescence de TMRM est excitée par 532 nm excitation laser et recueillidans 560-625 nm canal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 fs, 80 MHz 20 à 65 mW 10 à 60 mW 5 à 50 mW 5 à 40 mW
1040 nm, 120 fs, 50 MHz 30 à 100 mW 20 à 80 mW 15 à 70 mW 10 à 60 mW

Tableau 1 : Durée de stimulation recommandée et puissance moyenne du laser femtoseconde en mode Stim-A.

0,05 s 0,1 s 0,2 s 0,5 s
810 nm, 65 fs, 80 MHz 25 à 40 mW 20 à 30 mW 15 à 25 mW 10 à 25 mW
1040 nm, 120 fs, 50 MHz 40 à 60 mW 30 à 50 mW 25 à 40 mW 20 à 30 mW

Tableau 2 : Durée de stimulation recommandée et puissance moyenne du laser femtoseconde en mode Stim-A à 2 x 2-3 x 3 m 2 (en) en cellule.

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Discussion

Nous démontrons une stratégie de photostimulation en combinant un laser femtoseconde avec un système de microscope confocal de balayage laser. La photostimulation peut fonctionner directement comme une microscopie à deux photons en définissant Stim-B en conséquence. Nous fournissons un protocole détaillé pour l'utilisation d'un court flash de laser femtoseconde pour déclencher la signalisation ERK ou mitoflashes dans les cellules cibles. Les différents modes de stimulation peuvent être exécutés selon différents objectifs et systèmes expérimentaux. Stim-A peut être facilement mis en place à partir d'un microscope confocal. Le laser femtoseconde peut être focalisé au niveau de la limite de diffraction au centre FOV. La cible subcellulaire doit être déplacée à la position de mise au point laser femtoseconde manuellement et peut être stimulée pour des durées arbitraires, totalement indépendant de la microscopie confocale. Par conséquent, Stim-A peut protéger l'échantillon qui est hors de la zone de mise au point parfaitement et convient à la photostimulation de longue durée. La région de stimulation de Stim-B peut être prédéfinie comme n'importe quelle zone dans le FOV. Il peut être exécuté automatiquement. Mais la durée de stimulation et le temps d'exposition ne peuvent suivre avec le balayage confocal. Après avoir réglé le temps d'arrêt de chaque pixel et la taille totale du cadre, la durée de stimulation dans un seul cadre de microscopie est en fait fixée. La photostimulation peut également être effectuée périodiquement image par image. Il peut également être utilisé pour activer les photosensitoizers et les protéines optogénétiques qui nécessite moins de durée d'exposition, mais une grande superficie.

Une considération critique dans ce protocole est comment déterminer les paramètres de la stimulation laser de femtoseconde. Selon nos études précédentes, l'activité moléculaire cellulaire est principalement induite par l'exaction multiphoton17,21,22,23,24,25. Généralement l'efficacité d'exaction de multiphoton est liée à tous les paramètres laser de femtoseconde comprenant la longueur d'onde, la largeur d'impulsion, le taux de répétition. La réponse cellulaire est également liée à la puissance laser, la position/région de stimulation, et la durée d'exposition simultanément. En principe, l'efficacité de stimulation entre en conflit avec la sécurité cellulaire. Une photostimulation plus forte, comme une puissance moyenne plus élevée, une durée de stimulation plus longue et une plus grande énergie laser totale, contribue à une plus grande efficacité de stimulation, mais entraîne des risques plus élevés de dommages cellulaires. Étant donné que ces paramètres sont également relatifs les uns aux autres et contribuent tous à l'effet de stimulation et de dommages, il est impossible d'utiliser un seul paramètre, comme l'énergie laser incident total, ou la puissance moyenne laser, pour le définir est sûr ou non. Compte tenu de l'efficacité de l'activation du signal et de la sécurité cellulaire, nous fournissons ici la puissance moyenne recommandée et la durée de stimulation de deux sources laser femtoseconde pour référence dans le tableau 1 et le tableau 2. En outre, les paramètres de la stimulation laser femtoseconde devraient être modifiés en fonction du système optique réel et de l'échantillon biologique.

Selon les discussions ci-dessus, nous avons l'intention de présenter des gammes efficaces plus détaillées de paramètres de photostimulation. La longueur d'onde du laser femtoseconde peut être modifiée à la gamme NIR utilisée pour la photostimulation. La largeur de l'impulsion doit être courte pour fournir une puissance de pointe élevée et une efficacité d'exaction non linéaire élevée. La longue durée de l'impulsion n'est pas recommandée pour ce protocole. Habituellement, la largeur typique de l'impulsion pour la microscopie à deux photons (lt;200 fs) est le bon choix. Le taux de répétition du laser n'est pas un facteur clé. Le taux de répétition jusqu'à MHz est adapté à ce protocole. Le facteur le plus critique pour les réponses moléculaires cellulaires est la puissance laser et la durée de stimulation du laser femtoseconde. Pour activer ERK, selon nos travaux précédents22, la puissance moyenne à 15 mW (810 nm) ou 20 mW (1 040 nm) et la durée d'exposition à 0,2 s sont suffisantes pour fournir une stimulation suffisante pour activer la signalisation ERK tout en maintenant la viabilité des cellules ultraélevées dans Cellules Hela. Au contraire, la puissance moyenne de plus de 80 mW (810 nm) ou 120 mW (1 040 nm) et la durée d'exposition supérieure à 1 s peuvent induire des dommages irréversibles aux cellules. Les mitochondries sont généralement plus sensibles à la photostimulation. La stimulation avec une puissance moyenne supérieure à 40 mW (810 nm) ou 80 mW (1 040 nm) et la durée d'exposition de plus de 0,2 s peut induire des dommages significatifs comme la fragmentation irréversible dans la mitochondrie stimulée ou même dans toutes les mitochondries à travers la cellule entière. Il convient de noter que la photosensibilité des mitochondries à la photostimulation varie beaucoup selon les types de cellules. Par exemple, dans les cellules HeLa, la puissance laser n'a besoin que d'environ 6 mW (810 nm, durée de 0,1 s). Toutes les mitochondries peuvent réagir à la photostimulation sous forme de fragmentation, de mitoflashes et d'oscillations MMP. Mais dans les cellules souches mésenchymales humaines, la puissance doit être augmentée à environ 15 mW (810 nm, 0,1 s durée), et encore environ la moitié stimulée mi-mi-mitochondries ne montrent aucune réponse à la photostimulation. En mode Stim-B, un autre facteur peut affecter l'efficacité de l'activation de la photo et les dommages cellulaires est la zone de stimulation. La photostimulation peut causer des dommages cellulaires en livrant sur une petite zone de stimulation. Mais la même stimulation peut ne pas activer ERK en livrant sur une plus grande zone de stimulation. Nous recommandons que la zone de stimulation dans la cellule cible est d'environ 2 x 2-3 x 3 m2 et ne dépasse pas 25 m2.

La localisation de la région de stimulation est également importante pour l'application de ce protocole. Selon les travaux précédents17,22, la photostimulation dans ce domaine peut épuiser le magasin Ca2 à ER efficacement et activer le canal CRAC. Ensuite, l'afflux de Ca2 peut activer la voie de signalisation ERK par la suite. Par conséquent, nous recommandons de fournir la photostimulation sur la région des urgences dans les cellules Hela pour atteindre une efficacité d'activation ERK élevée. La région des urgences peut être facilement distinguée du cytoplasme ou du noyau sous microscopie de champ lumineux par un objectif de contraste de phase. Afin d'introduire des événements de signalisation mitochondriale, l'accent du laser femtoseconde peut être facilement monté sur la structure mitochondriale sélectionnée suivant les procédures connexes.

Les méthodes de photostimulation décrites dans ce protocole peuvent également être utilisées pour affecter d'autres événements cellulaires multiples tels que l'induire des signaux Ca2 et ROS17,20,21. Il convient de noter que tous ces travaux précédents ont fourni l'évaluation de la sécurité cellulaire après la photostimulation. Par exemple, des changements morphologiques significatifs des cellules, le bouillonnement, la fragmentation mitochondriale et l'enflure de la cellule entière, la diminution du taux de prolifération des cellules, et certains autres changements inhabituels de la fluorescence pendant la microscopie confocale impliquent tous des dommages cellulaires. Il devrait être très prudent de surveiller l'état de la cellule. Néanmoins, avec un contrôle bien de la puissance laser et les paramètres de stimulation, la viabilité de la cellule pourrait être maintenue à un niveau très élevé simultanément avec une efficacité de stimulation élevée. Par conséquent, cette méthode de phototimualtion du laser femtoseconde est d'un bon potentiel pour s'étendre davantage à plus de domaines et appliquée dans les applications pertinentes.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Les travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (81571719 et 81661168014, 81673014 et 81870055), le Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 et 16XD1403100), et national Key R-D Plan (2017YFA0104000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus
Femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
Petri dish NEST 801002
Petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
Paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

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References

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Biologie Numéro 149 laser femtoseconde photostimulation kinase extracellulaire-signal-régulée (ERK) mitoflash biophotonique
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Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

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