Summary
緊密に焦点を合わせたフェムト秒レーザーは、共焦点顕微鏡に結合することにより、細胞に正確な刺激を提供し、リアルタイムの観察と光刺激を可能にします。光刺激は、ERKシグナル伝達経路および活性酸素種のミトコンドリアフラッシュを含む細胞分子イベントを活性化することができる。
Abstract
細胞定義分子事象の直接制御は生命科学にとって重要である。近年、フェムト秒レーザー刺激が複数の細胞分子シグナル伝達経路を同時に活性化できることが研究で実証されている。このプロトコルでは、フェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合することで、細胞を密に焦点を合わせたレーザーによって正確に刺激できることを示す。同時に観察することができるいくつかの分子プロセスは、その後活性化されます。我々は、ヘラ細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)シグナル伝達経路を活性化するための光刺激の詳細なプロトコルを提示する。活性酸素種(ROS)および他のミトコンドリア事象のミトコンドリアフラッシュは、特定のミトコンドリア管状構造にフェムト秒レーザーパルスを集当すれば刺激することもできる。このプロトコルには、光刺激の前に細胞を前処理し、フェムト秒レーザーフラッシュによる光刺激をターゲットに送り、その後の分子変化を観察/同定することが含まれます。このプロトコルは、関連する生物学的研究のための全光学ツールを表す。
Introduction
細胞シグナル伝達分子を制御する技術は、生命科学の発展の重要な部分です。伝統的に、最も一般的に使用される方法は、薬物または生物学的材料1、2、3による生化学的治療である。過去10年間にわたり、光遺伝学の発明は、細胞分子信号変調のための新しい時代を開きます。遺伝子工学による光感受性タンパク質によるトランスフェクションは、光が標的細胞内の様々なタンパク質活性を調節する強力なツールになります。この技術は、神経信号の励起と阻害、遺伝子発現の促進、細胞信号パターンの操作、異なる細胞の運命と病理学的調査をリードするなどの進歩を奨励しています 4,5 ,6,7,8,9.しかし、光は光遺伝学的タンパク質で細胞をトランスフェクトすることによってのみ働くことができます。現在の段階では、光遺伝学以外に細胞分子を直接制御できる稀な方法があります。
フェムト秒レーザーは、良好な生物学的安全性を維持しながら、効率的なマルチフォトン励起を提供することにより、高度な生物学的研究を持っています。多様な写真処理戦略を展開することで、多光子顕微鏡、顕微鏡検査、多光子光遺伝学アプリケーション10、11、12、13などの多くの成果を実現しています。 ,14,15,16.最近の研究では、フェムト秒レーザー刺激が分子シグナル伝達事象を直接誘導する高効率光学法として実証されている。小プラズム網膜(ER)に対する緊密に焦点を当てたフェムト秒レーザー照射は、ERでカルシウムを枯渇させ、カルシウム放出活性化カルシウム(CRAC)チャネルを活性化して細胞17内でカルシウムシグナルを形成できることが分かった。この光活性化カルシウムシグナルは、複数のタイプの細胞18、19、20の間に広がりうる。さらに、活性T細胞(NFAT)およびERKシグナル伝達経路21、22の核因子などの細胞シグナル伝達経路を活性化する能力も有する。細胞におけるフェムト秒レーザー曝露の強度と局在化を調整することにより、例えば、レーザーをミトコンドリアに集色すると、ミトコンドリア形態および分子事象23、24、および、25.具体的には、ミトコンドリアROS生成のバーストは、ミトコンドリア(ミトフラッシュ)で蛍光点滅として言及されている光刺激によって興奮することができる。
したがって、光刺激技術は、関連する生物学的研究に広く適用される可能性が高い。また、顕微鏡検査以外の細胞シグナル伝達分子や機能の制御においてフェムト秒レーザー用途を拡張する良い機会でもあります。ここでは、光刺激の技術的な詳細を提供します。光刺激は、フェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合し、短いフラッシュ光刺激を持つ単一の標的細胞を提供することによって達成される。それは細胞の有効で、制御可能なERK活動化を開始できる。光刺激がミトコンドリア管状構造上に位置する場合、ミトコンドリア膜電位、形態、ROS、および透過性遷移毛孔は、すべて光刺激によって制御することができる。この光刺激スキームに基づいて、ERKシグナル伝達経路を活性化し、Hela細胞における複数のミトコンドリア事象に影響を与える詳細な方法を提供する。このプロトコルは、フェムト秒レーザー刺激を標的細胞に送り込むプロセスを解明する。
光刺激システムは同時刺激および連続的な顕微鏡のためのフェムト秒レーザー結合が付いている共焦点顕微鏡で確立される。フェムト秒レーザー(波長:1,040nm、繰り返し速度:50MHz、パルス幅:120fs、最大出力平均電力:1W)は、カップリング前に2つのビームに分割されます。一つは、レンズのペアからなる中継望遠鏡を介して導かれます。次に、回折限界焦点(Stim-A)を形成するために、目的の背面開口部(60x、N.A.=1.2、水浸漬)に直接反射されます。もう一つは、2光子走査モード(Stim-B)として機能する共焦点顕微鏡の走査光学経路に反映される。スティム A は、視野の中心 (FOV) に固定フォーカス ポイントを表示します。Stim-BはFOVであらかじめ設計された部分共焦点スキャン領域である。図 1A にスティム A とスティム B を示します。ダイクロイックミラー(DM)の下のCCDカメラは、フェムト秒レーザーの焦点を監視するための明視野イメージングを提供します。
以下の実験には重要な要素がいくつかあります。このプロトコルでは、フェムト秒ファイバーレーザー光源(1040nm、50MHz、120fs)を例に用いられる。実際には、ほとんどの市販のフェムト秒発振器は、パルス幅が200fsより短く、ピーク電力密度が1011~10 12 W/cm2のレベルを超える必要がある限り使用できます。例えば、Ti:サファイアレーザーは、通常、多光子顕微鏡検査に使用され、図1Bに示すフェムト秒レーザーを置き換えることができる。光学パラメータ(パルス幅、波長、繰り返し速度)は異なるフェムト秒レーザーで大きく異なるため、レーザーパワーやその他の光刺激パラメータは調整する必要があります。
フェムト秒レーザー刺激と共に、共焦点顕微鏡は、スティムAおよびスティムBモードの両方でリアルタイムで分子ダイナミクスを監視する連続的な細胞イメージングを提供します。両方の光刺激方式(Stim-AおよびStim-B)はミリ秒の解像度を持つメカニカルシャッターによって制御される(図1)。
スティムAモードでは、レーザーフォーカスの位置はFOVの中心に固定されます。中継望遠鏡は、2つのレンズ間を垂直方向に調整することにより、フェムト秒レーザーの焦点を高焦点に保つために使用されます(レーザー伝搬方向、共焦点イメージング平面への垂直方向) 図1)CCDカメラの明視野イメージングにより、レーザーフォーカスの直径を測定することができます(約2μm、図2B)。刺激時間および露出時間は共焦点イメージ投射プロセスの間にシャッターによって制御される。
Stim-B モードでは、刺激領域は、共焦点イメージング制御ソフトウェアで、ライン、ポリゴン、または円などの任意の形式に手動で割り当てることができます。シャッターは共焦点スキャンプロセスと同期されます。これは、共焦点イメージング制御ソフトウェアを介して設定された事前に設計された時間に開きます。次いで、刺激領域を共焦点顕微鏡としてフェムト秒レーザーでスキャンする。したがって、試料は、共焦点走査処理が所定の撮像フレームに入るときにのみフェムト秒レーザーによって刺激される。
光刺激システムは、実験対象に応じて反転および直立冶金顕微鏡の両方で確立することができる。ペトリ皿で培養されたインビトロ細胞は、反転顕微鏡で作業する方が良いです。動物、特に生きた動物の脳は、直立顕微鏡でより適しています。本研究では、反転顕微鏡を例にとった。ペトリ皿のカバーは、全体の実験中に開かれていないことに留意すべきです。
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Protocol
注意:以下に示すプロトコルは、NIRフェムト秒レーザーおよび有毒化学物質を使用することを含む。実験手順によって引き起こされる可能性のあるすべての損害に注意してください。使用前に、関連するすべての化学物質またはその他の材料の安全データシートをお読みください。レーザー光源を作動する前に、レーザー設備の安全指示に従うか、専門家に相談してください。
1. 実験準備
- 光刺激システムの設定
注:システムはフェムト秒レーザーおよびレーザー(蛍光励起のための目に見える範囲で)共焦点顕微鏡を走査する。図1では、結合にファイバフェムト秒レーザー(1,040nm、50MHz、120fs、1W)を使用しています。パラメータは固定されていないか、必要ありません。それはTi:サファイアレーザーまたはNIRの範囲の他の商業フェムト秒の発振器によって置き換えることができる。- フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡で調整します。
注:オプティカルパスを調整する過程で、フェムト秒レーザーパワーを低レベル(約50mW)に設定してください。 - 反射ミラー(図1Bに示すRM1およびRM2)を使用して、フェムト秒レーザー光をメカニカルシャッターで導きます。シャッターを開けろ
- フェムト秒レーザービームを2つの別々のビーム(伝送ビームと反射ビーム)に分割するには、50/50ビームスプリッタ(BS、図1B)を設定します。フェムト秒レーザービームを走査レーザレーザビームと一致させるためにRM2とBSを操縦します。
注:(1)ロングパスダイクロイクミラーの背後にある基準虹彩(アイリス1、図1B)(DM、700nmカットオン波長、図1B)は、走査レーパスの位置決めに用いられる。(2) システムは、それぞれ Stim-A モードまたは Stim-B モードでのみ動作できます。スティムAモードの場合、BSを取り外すことができます。Stim-B の場合、BS は RM に置き換えることができます。 - レンズのペアから成る中継望遠鏡を設定して、目的の背面開口部で構成される伝送ビーム幅を拡大します。
注:(1)基準虹彩2及び3(図1B)は、フェムト秒レーザー光をコリメートするように設定されている(図1B)。(2)中継望遠鏡の倍率は、フェムト秒レーザー光の元の直径と目的の背面開口部の直径に依存する。 - 膨張したビームを顕微鏡に合わせるために、MSP(RM 3-5、図1B)を操縦する。フェムト秒レーザーの焦点をFOVの中心に合わせるためにRM 4およびRM 5を操縦する。
- フェムト秒レーザーの目的の伝送効率を測定する。
注:これらの2つのモードでのレーザーの異なる貫通経路のために、それぞれStim-AとStim-Bでレーザーパワーを測定してください。試料の力を利用して、以下の関連する実験手順を説明します。 - 実験が始まるまで、シャッター、フェムト秒レーザー、共焦点顕微鏡を調整します。
注:次の実験では、スティム-AとスティムBは一緒に動作しません。スティムAを使用する場合、スティムBのフェムト秒レーザービームを遮断する必要があります。一方、システムが Stim-B モードで動作する場合は、Stim-A のビームをブロックする必要があります。
- フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡で調整します。
- 培養培地を調用意する:ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)高グルコースと10%の胎児ウシ血清(FBS)を調剤する。
- ERK2-GFP DNAプラスミド、水戸-GFP DNAプラスミドおよびミトコンドリアマトリックスターゲティング円形に透過した黄色蛍光タンパク質(mt-cpYFP)DNAプラスミドを調製する。プラスミドは使用するまで-20 °Cに保ちます。
- テトラメチルロダミン(TMRM、100μM)、およびポリエチレンニミン(PEI 1 mg/mL)を調製する。使用するまで-20°Cに保管してください。
- 5%パラホルムアルデヒド、0.5%トリトンX-100、抗eIF4E(真核翻訳開始因子4E)、抗体(蛍光体S209、1mg/mL)、抗バックス抗体(1mg/mL)、抗シトクロムC抗体(1mg/mL)、二次抗体(抗ウサギアレクサフルーラ488、1 mg/mL)、および0.1%Tween20で1%BSA。これらの試薬は使用するまで4°Cに保ちます。
- 滅菌材料を調製:細胞培養ボトル、ガラススライド底部付きペトリ皿(図3A)、ガラス底部付き料理、500μmセル位置グリッド(図3B、光刺激細胞を局所化する)、1.5mLおよび10mLチューブ、および1mL、100 μLおよび10 μLのピペットおよび先端。
- 標準的な細胞培養実験装置を準備する:5%CO2および37°Cにセットされた細胞培養インキュベーターおよび生物学的安全キャビネット。
2. 細胞培養とトランスフェクション
注:ヘラ細胞(ヘンリエッタ・ラックスから1951年2月8日に採取された子宮頸癌細胞由来の細胞株)26は、このプロトコルの一例として用いられる。
-
細胞通路
- 十分な細胞を含む細胞培養ボトルから培養培地を取り出す。
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS)の2 mLでボトルを洗います。PBS を削除します。
- トリプシンを1mLゆっくりと加え、ボトルを少しタップします。ボトルをインキュベーターに戻し、細胞を37°Cで3分インキュベートします。
- トリプシンを取り除く。培養培地の2〜3 mLを追加します。細胞が切り離すのを助けるために培地を数回ピペット。細胞を含む培地を10mLチューブに移します。
- 細胞計数のチューブからサンプルの10 μLを取ります。
- 25,000個の細胞をペトリ皿(図3A)にシードし、最大1mLの培養培地を添加する。
- 含有細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクションの前に37°Cで細胞を24hインキュベートします。
-
細胞トランスフェクション
- 1皿あたりのトランスフェクションには、0.5 μgのDNAプラスミド(ERK2-GFP、水戸-GFP、mt-cpYFP)を使用します。プラスミド0.5 μg、PEIの2.5 μgを1.5 mLチューブで50 μLのDMEMに加えます。混合媒体を室温で10分インキュベートする。
- インキュベーターから細胞で皿を取ります。培養培地をDMEMの1 mLに置き換えます。
- DNA/PEI混合媒体を細胞にドロップして加えます。細胞をインキュベーターに戻します。
- 細胞を37°Cで3時間インキュベートし、DMEM DNA/PEI混合培地を1mLの培養培地に置き換えます。
- 光刺激実験の前に37°Cでトランスフェクト細胞24hをインキュベートする。
3. フェムト秒レーザーの光刺激によるERK2の活性化
- フェムト秒レーザーをオンにし、シャッターが閉まっていることを確認します。
- レーザー走査共焦点顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡ソフトウェアを開きます。励起レーザーを488nmに設定します。488 nm レーザーの電力レベルを 0.1 mW に設定します。イメージング サイズを 512 x 512 ピクセルに設定します。各ピクセルの間隔時間を 2.4 μs に設定します。2 つのフレーム間の間隔時間を 6 秒に設定して、細胞への光の漂白と光の損傷を最小限に抑えます。総撮像フレームを約300フレームに設定し、個々の実験で約30分の連続顕微鏡検査を行います。
注:2つの隣接するフレームの間隔、連続顕微鏡検査の総撮像フレームおよびイメージ投射時間は実験条件に従って調節することができる。個々の実験が2時間を超える場合は、細胞生存率を維持するために5%CO2および37°Cの環境を提供するために、ステップ3.3に存在する顕微鏡用のCO2インキュベーションシステム(図4に示す)を設定してください。個々の実験が2時間以内に制限されている場合、CO2インキュベーションシステムは必要ありません。 - CO2インキュベーションシステムをオンにし、すべてのヒーターをオンにし、37 °Cに動作温度を設定します。温度が37°Cまで上がり、CO2の濃度が5%になるまで待ちます。図4Aに示すように、インキュベーターステージを顕微鏡ステージに置きます。
- ステップ2で説明するようにERK2-GFPでトランスフェクトヘラ細胞を調製する。
注:個々の実験では、スティムAまたはスティムBのスキームが細胞に光刺激を与えるために適用される。ステップ 3.5 と 3.6 では、それぞれ Stim-A と Stim-B の下で詳細な手順を示します。 - スティムAモードを用いてフェムト秒レーザー刺激を標的細胞に送り込む
注:光刺激手順の前に、焦点の直径が約2μmであることを確認してください。このプロセスについては、手順 3.5.1 および 3.5.2 で説明します。- インキュベーターからERK2-GFPを透過した細胞を含む皿を取り、顕微鏡の段階に皿を置きます。
- 顕微鏡操作ソフトウェアを介して高速スキャンモードを開始します。細胞の明確な蛍光画像を取得する目的を調整します。高速スキャンを停止します。CCDカメラ(図2A)で明視野イメージングモードに切り替えます。シャッターを開き、中継望遠鏡の2つのレンズ間の距離を調整して、フェムト秒レーザーフォーカスの直径を~2μm(図2B)にします。シャッターを閉じて調整を完了します。
注:参照矢印は、レーザーフォーカスを示すためにラベル付けすることができます(図2)。一方、基準矢印は、フェムト秒レーザーの焦点の位置を示すために蛍光画像化ウィンドウの中心に設定することもできる。 - フェムト秒レーザーの電力を15~40m(810nm、65fs、80MHz)、または20~60mW(1040nm、120fs、50MHz)で設定します。シャッターの開口時間を0.05~0.2sに設定します。
- 高速スキャンモードを使用して、ERK2-GFPをよく発現するターゲットセルを選択します。
- CCDカメラの明視野イメージングの下で、選択したターゲットセルのサイトゾル領域をFOVの中心に局所化するためにステージを移動する(図2A)。
- [スタート]下部をクリックして、連続的な顕微鏡検査の進行を開始します。
- あらかじめ定義されたタイムスロットでシャッターを開き、ステップ3.5.3で設計されたフェムト秒レーザー刺激をターゲットセルに届きます。
注:(1)光刺激は、シャッターによって制御される共焦点顕微鏡配列でいつでも行うことができる。(2)光刺激は、共焦点顕微鏡配列中に同じ位置で複数回送達することができる。 - イメージングプロセスが完了するまで待ちます。イメージング データを保存して、さらなるデータ分析を行います。
- Stim-Bモードを用いてフェムト秒レーザー刺激を標的細胞に送り込む
- フェムト秒レーザーの出力を15~40mW(810nm)、20~60mW(1040nm)の試料に設定します。
- インキュベーターからERK2-GFPを透過した細胞を含む皿を取り、顕微鏡の段階に置きます。
- 高速スキャンモードを使用して、ERK2-GFPをよく発現するターゲットセルを選択します。
- 共焦点イメージング プロセスをステップ 3.2 として設定します。イメージング プロセスの刺激フレームとして特殊なスキャン フレームを定義します。シミュレーション フレームのパラメータを定義します。
- 標的細胞の核に近いサイトゾル領域に走査領域(2 x 2-3 x 3 μm 2)を設定します。
- 総スキャン時間を0.1-0.2秒に設定し、あらかじめ定義された光刺激領域に従ってフェムト秒レーザーのシャッターを共焦点スキャンと同期させます。出かける。
注:(1)フォトティミオン領域は任意のサイズに設定できます。(2)光刺激は、共焦点顕微鏡配列内の任意の定義済みのタイムスロットで行うことができる。(3)光刺激は、その共焦点顕微鏡配列におけるFOV内の同じまたは異なる定義された領域に対して複数回行うことができる。
- [スタート]下部をクリックして、連続的な顕微鏡検査の進行を開始します。
- イメージングプロセスが完了するまで待ちます。イメージング データを保存して、さらなるデータ分析を行います。
- 実験後、フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡をオフにします。
4. フェムト秒レーザーシミュレーションによるeIF4E(ERK基板)の活性化
- ヘラ細胞製剤
- 手順 2.1.1-2.1.5 に従います。
- 細胞位置グリッド(図3B)を用いたペトリ皿に20,000細胞をシードし、光刺激細胞を局所化する。培養培地を最大1mLに加えます。
- 細胞を入れた皿をインキュベーターに戻します。フェムト秒レーザー処理の前に37°Cで細胞を24hインキュベートする。
- フェムト秒レーザーをオンにし、シャッターが閉まっていることを確認します。
- レーザー走査共焦点顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡ソフトウェアを開きます。
- 手順 3.3 で、CO2インキュベーション システムをステートメントとして準備します。
- スティムAモードを用いてフェムト秒レーザー刺激を標的細胞に送り込む
- フェムト秒レーザーの出力を15~40mW(810nm)、20~60mW(1,040nm)の試料に設定します。シャッターの開口時間を0.05~0.2sに設定します。
- インキュベーターの細胞で皿を取り、顕微鏡の段階でCO2インキュベーターに取り付けます。
- CCDカメラの明視野イメージングの下で撮像面を見つけるために、目的を垂直方向に動かします。試料ステージを水平方向に動かして、FOVの中心にセルが配置されないようにします。シャッターを開き、中継望遠鏡の2つのレンズ間の距離を調整し、フェムト秒レーザーフォーカスの直径を~2μmで確認します。シャッターを閉じて調整を完了します。
- 顕微鏡ステージを動かして、5~10グリッドをランダムに選択します。CCDカメラの明視野イメージングの下で、ペトリ皿の底部のグリッドによって示され、局在化することができる。料理内の選択したグリッドの座標をマーク/記録します。
- CCDカメラの明視野イメージングの下で、選択したグリッド内にあるすべてのセルを手動で1つずつ刺激します。
- 皿をインキュベーターに戻します。免疫蛍光顕微鏡検査の前に37°Cで細胞を24時間インキュベートする。フォトティミレーション手順の後、フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡をオフにします。
- ERK活性化の確認のための光刺激を有する細胞におけるリン酸化eIF4Eの免疫蛍光顕微鏡
- インキュベーターからステップ4.5で光刺激処理を行った細胞を含む皿を取り出す。培養培地を取り外します。細胞をPBSで一度洗います。PBS を削除します。
- 5%のパラホルムアルデヒド(4°C)の1 mLを皿に加えます。5%のパラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定し、パラホルムアルデヒドバッファーを取り除きます。PBSで細胞を5分間2回洗います。PBS を削除します。
- 0.5%トリトンX-100の1 mLを皿に加えます。細胞を室温で15分インキュベートする。トリトンX-100バッファを取り外します。PBSで細胞を5分間2回洗います。PBS を削除します。
- 1%BSAバッファーの1 mLを皿に追加します。細胞を室温で30分インキュベートする。BSA バッファを削除します。
- 抗eIF4E抗体(蛍光体S209)を1mLのPBSで希釈し、1%BSAを用い、最終的な濃度を1μg/mLにする。皿にバッファーを追加します。4°Cで10-12hの細胞をインキュベートします。バッファを削除します。
- PBSで細胞を5分間2回洗います。PBS を削除します。
- 2 μg/mLの最終濃度に1%BSAでPBSの1 mLで二次抗体抗体IgG H&Lを希釈します。皿にバッファーを追加します。細胞を室温で2時間インキュベートする。バッファを削除します。
- PBSで細胞を洗浄します。PBS を削除します。
- 皿にPBSの1 mLを加えます。
- レーザー走査共焦点顕微鏡をオンにします。顕微鏡ソフトウェアを開きます。励起レーザーを488nmに設定します。488 nm レーザーの電力レベルを 0.1 mW に設定します。イメージング サイズを 512 x 512 ピクセルに設定します。各ピクセルの間隔時間を 2.4 μs に設定します。
- 顕微鏡の段階に免疫蛍光染色細胞で皿を置きます。CCDカメラの明視野イメージングの下で、選択したボックスを見つけます。
- 単一フレーム共焦点スキャンを開始します。光刺激細胞の蛍光写真を保存します。
- フェムト秒レーザー刺激のない領域を見つけるためにランダムにステージを移動します。単一フレーム共焦点スキャンを開始します。刺激のない細胞の蛍光画像をコントロールデータとして保存します。
- 実験後、共焦点顕微鏡をオフにします。
5. 光刺激によるミトフラッシュおよびその他のミトコンドリアイベントの活性化
注:ミトコンドリア形態学的ダイナミクスを観察するために、ヘラ細胞は、ミトコンドリアを蛍光的に示すためにステップ5.1で水戸-GFPとトランスフェクトされる。ミトフラッシュを観察するために、ヘラ細胞はステップ5.1でmt-cpYFPでトランスフェクトされる。
- ステップ2に続いて水戸-GFPまたはmt-cpYFPでトランスフェクトしたヘラ細胞を調製する。
- フェムト秒レーザーをオンにし、シャッターが閉まっていることを確認します。
- レーザー走査共焦点顕微鏡をオンにします。励起レーザーを488nmに設定します。488 nm レーザーの電力レベルを 0.1 mW に設定します。イメージング サイズを 512 x 512 ピクセルに設定します。各フレームの総イメージング時間を 2.2 秒に設定する 2 つのフレーム間の間隔時間を 0 秒に設定し、合計イメージング フレームを 200 フレームに設定し、個々の実験で約 440 秒の連続顕微鏡検査を提供します。
注:2つの隣接するフレームの間隔、連続顕微鏡検査の総撮像フレームおよびイメージ投射時間は実験条件に従って調節することができる。 - 必要に応じて、手順 3.3 に記載されている CO2インキュベーション システムを準備します。
-
スティムAモードを用いてターゲットミトコンドリオンにフェムト秒レーザー刺激を送る
- 水戸-GFPまたはmt-cpYFPをインキュベーターからトランスフェクトした細胞を含む皿を取り、顕微鏡の段階に皿を置きます。
- ステップ 3.5.2 としてフェムト秒レーザーの状態を確認します。フェムト秒レーザーの焦点がFOVの中心にあることを確認します。蛍光イメージングウィンドウの中央に参照矢印を設定し、フォーカスの位置を示します。
- フェムト秒レーザーの出力を5-30mW(810nm)、10~40mW(1040nm)で試料に設定します。シャッターの開口時間を0.05~0.1sに設定します。
- 高速スキャンモードを使用して、水戸-GFPまたはmt-cpYFPをよく表現したターゲットセルを選択します。
- 実験対象として、標的細胞内でランダムに1つのミトコンドリオンを選択します。高速走査モードにより、FOVの中心に標的ミトコンドリア管状構造体(参照矢印で示す)を局所化するために顕微鏡ステージを動かす。
- [スタート]下部をクリックして、連続的な顕微鏡検査の進行を開始します。
- 任意の事前に定義された時間にシャッターを開き、ステップ5.5.3で設計されたフェムト秒レーザー刺激をターゲットミトコンドリア管状構造に提供します。
注:(1)ミトコンドリア管状構造上のフェムト秒レーザー露光は、共焦点顕微鏡の間、いつでもシャッターによって制御することができる。(2)1つのフェムト秒レーザー刺激が長期間にわたってミトコンドリアの状態を乱す可能性があるため、1回の実験でフェムト秒レーザー露光を1回だけ行う。 - イメージングプロセスが完了するまで待ちます。イメージング データを保存して、さらなるデータ分析を行います。
- 実験後、フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡をオフにします。
6. フェムト秒レーザー刺激によるヘラ細胞におけるミトコンドリアの標的ミトコンドリアの振動
- 手順 2.1.1-2.1.6 に従って Hela セルを準備します。
- 実験前に37°Cで24時間細胞をインキュベートします。
- TMRM染色溶液を調出す:TMRMを10%FBSで1mLのDMEMで希釈し、最終的な濃度を100nMにする。
- インキュベーターからステップ5.2.1と5.2.2で調製したセルで皿を取ります。培養培地を取り外します。ステップ6.3で調製したTMRM染色液を皿に加えます。インキュベーターで37°Cで15〜20分間染色する。染色液を取り除きます。細胞をPBSで一度洗います。料理に培養媒体の1 mLを追加します。
- フェムト秒レーザーをオンにし、シャッターが閉まっていることを確認します。
- レーザー走査共焦点顕微鏡をオンにします。顕微鏡ソフトウェアを開きます。励起レーザーを532 nmに設定します。532 nm レーザーの電力レベルを 0.1 mW に設定します。イメージング サイズを 512 x 512 ピクセルに設定し、フレーム生成時間を 2.2 秒に設定します。
注:2つの隣接するフレームの間隔、連続顕微鏡検査の総撮像フレームおよびイメージ投射時間は実験条件に従って調節することができる。 - 必要に応じて、手順 3.3 に記載されている CO2インキュベーション システムを準備します。
- スティムAモードを使用して、ターゲットミトコンドリオンにフェムト秒レーザー刺激を提供します。手順 5.5.1-5.5.8 に従って実験を完了します。
注:ステップ6.8で、標的ミトコンドリオンとしてTMRMでよく染色されたミトコンドリオンを選択する。 - 実験後、フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡をオフにします。
7. フェムト秒レーザー刺激によるヘラ細胞における標的ミトコンドリアにおけるバクスとシトクロムCの変化
注:この実験では、ペトリ皿の細胞を細胞位置グリッド(図3B)で播種し、フェムト秒レーザーで処理された細胞を局所化する。細胞をTMRMで染色し、フェムト秒レーザーで刺激されるミトコンドリオンを局所化する。
- ステップ 4.1 で説明したように、セル位置グリッド (図 3B)を使用してペトリ皿にヘラセルを準備します。
- 手順 6.3 および 6.4 に記載されているように、TMRM で細胞を染色します。
- フェムト秒レーザーをオンにし、シャッターが閉まっていることを確認します。
- レーザー走査共焦点顕微鏡をオンにします。顕微鏡ソフトウェアを開きます。励起レーザーを532 nmに設定します。532 nm レーザーの電力レベルを 0.1 mW に設定します。イメージング サイズを 512 x 512 ピクセルに設定し、フレーム生成時間を 2.2 秒に設定します。
-
スティムAモードを用いてターゲットミトコンドリオンにフェムト秒レーザー刺激を送る
- フェムト秒レーザーの出力を5-30mW(810nm)、10~40mW(1040nm)で試料に設定します。シャッターの開口時間を0.05~0.1sに設定します。
- インキュベーターから染色した細胞を含む皿を取り、顕微鏡の段階に皿を置きます。
- 高速スキャンモードを使用して、TMRMで染色されたターゲットセルを選択します。
- 高速スキャンモードを使用して、FOVの中心にターゲットミトコンドリア管状構造を局所化するためにステージを移動します。選択したセルが明視野イメージングの下にあるグリッドの座標をマークします。
- [スタート]下部をクリックして、連続的な顕微鏡検査の進行を開始します。
- 顕微鏡検査の進行状況が事前に定義された時間にシャッターを開き、ステップ7.5.1で設計されたフェムト秒レーザー刺激をターゲットミトコンドリア管状構造に導きます。
- イメージングプロセスが完了するまで待ちます。フェムト秒レーザーでシミュレートされた選択したミトコンドリオンをマークします。イメージング データを保存して、さらなるデータ分析を行います。
- 実験後、フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡をオフにします。実験細胞上にBaxまたはシトクロムCの免疫蛍光顕微鏡を調作成する。
-
バックスの免疫蛍光顕微鏡またはシトクロムCにフェムト秒レーザーミトコンドリオンを治療した。
- 顕微鏡の段階から皿を取ります。
- BaxまたはシトクロムCの完全な免疫蛍光染色は、手順4.7.1-4.7.9に従います。
注:ステップ4.7.5で抗eIF4Eの代わりに抗バックスまたは抗シトクロムCを使用して、ステップ7.6.2でBaxまたはシトクロムCの免疫蛍光染色を終了します。 - レーザー走査共焦点顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡ソフトウェアを開きます。励起レーザーを488 nmと532 nmに設定します。488 nm および 532 nm レーザーの電力レベルを 0.1 mW に設定します。イメージング サイズを 512 x 512 ピクセルに設定し、フレーム生成時間を 2.2 s に設定します。
- 顕微鏡の段階に免疫蛍光染色細胞で皿を置きます。CCDカメラの明視野イメージングの下で選択したグリッドを見つけます。フェムト秒レーザーで処理されるセルを見つけます。
- 単一フレーム共焦点スキャンを開始します。フェムト秒レーザーで刺激されるミトコンドリオンを見つけます。さらなるデータ分析のために光刺激細胞の蛍光画像を保存します。
- 実験後、共焦点顕微鏡をオフにします。
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Representative Results
光刺激は連続的な共焦点スキャン顕微鏡と共に同時に行うことができる。光刺激は、タイムラプス共焦点顕微鏡シーケンス内の任意の事前定義されたタイムスロットで開始できます。共焦点顕微鏡は蛍光イメージングによって細胞分子を監視できる。光刺激やその他のダイナミクスに対する分子応答は、このようにして同定することができる。理論的には、ERKが活性化されると、細胞質から細胞核27へのリン酸化移動となる。特定の細胞の運命は、このERK信号28の特定のパターンによって調節することができる。最近の研究では、光原性に基づく光学変調は、持続時間と大きさのERK信号の高精度制御を提供し、動揺したERK信号伝達ダイナミクスが癌細胞7における不適切な増殖を駆動することを明らかにしました7、 8.ここでは、本プロトコルで提示した方法を用いて、フェムト秒レーザーの短いフラッシュで細胞を処理した後に、ERK2を核への転移を示す。図5Aに示すように、ERK2-GFP蛍光は、フェムト秒レーザーシミュレーションの数分後に最大値に達する。ERK2分子は、核内の下流基質を活性化した後に脱リン酸化され、その後、ERK2は核GFP蛍光の減少によって示される細胞質に戻ります。ERK2は、複数の光刺激によって複数回アクティブにすることができます(図5B)。従って、複数の刺激間の間隔時間を制御することにより、ERK2信号パターンを正確に操作することができる。また、ERK2は、刺激細胞の周囲の隣接細胞において時折活性化することができる(図5C)。この観察は、フェムト秒レーザーで処理された細胞によって拡散性分子が放出され、隣接する細胞でERK2を活性化する可能性があることを示している。ERK2下流タンパク質eIF4Eのリン酸化は、免疫蛍光顕微鏡検査により確認・可視化することができる(図5D)。この結果は、フェムト秒レーザー刺激がERKシグナル伝達経路を正常に活性化できることを示している。より詳細な結果は、Wang S., et al.22.
ミトコンドリア酸化フラッシュ(ミトフラッシュ)は、複雑なミトコンドリア分子力学から根付くミトコンドリアの酸化バーストです。過去10年間で、ミトフラッシュは元素ミトコンドリアシグナル伝達事象であることが実現され、多量細胞機能29、30、31に重要な役割を果たします。伝統的に、ミトフラッシュは、通常、ミトコンドリア29、30に間接的なストレスを提供するために化学物質で細胞を治療する際に偶然観察される。この光刺激スキームを実装することにより、単一のミトコンドリア管状レベルでミトフラッシュを励起する制御可能かつ正確な方法を達成する。成功したミトフラッシュ励起を図6Aに示す。興味深いことに、パルスピーク、幅および応答持続時間32などのミトフラッシュの特性は、フェムト秒レーザーパワーと密接に関連している。フェムト秒レーザー刺激によって興奮したミトフラッシュのより詳細な定量分析は、Wang S., et32 .ミトコンドリアへのこの光刺激はまた、ミトコンドリア形態の断片化と回復(図6B)、およびミトコンドリア膜電位の振動を含むミトコンドリア分子ダイナミクスの品種を示しています(図6C)。光活性化ミトフラッシュと同様に、これらのミトコンドリアイベントは、光刺激の異なるパワー強度で異なる性能を有する。ERKシグナル伝達経路の活性化とは異なる。フェムト秒レーザーの影響は、単一のミトコンドリアチューブに非常に制限されています。より詳細な結果は、Wang Y., et al.24と Shi F.25.
図1:共焦点顕微鏡へのフェムト秒レーザー結合上に確立された光刺激方式。(A) 光刺激および共焦点イメージングシステムの光経路。フェムト秒レーザーは、最初に50/50ビームスプリッタで2つのビームに分割されます。伝送は中継望遠鏡によって拡大され、その後、スティムAを形成する目的に反映されます。反射ビームは、顕微鏡スキャンシステムを介して整列され、Stim-Bを形成する。CCDカメラは、Stim-Aモードでセルとフェムト秒レーザーの焦点を監視するための明るいフェリドイメージングを提供するために使用されます。スティム-A = FOVの中心に固定フォーカス;Stim-B = あらかじめ設計された領域の特別なスキャンフレーム。DM =ダイクロイックミラー、BS=ビームスプリッタ、RM=反射ミラー。共焦点走査レーザーの波長は488 nm/532 nm/635 nmであり、蛍光の典型的な収集波長間隔は<560 nm/560-625 nm/> 625 nmです。繊維フェムト秒レーザー(1,040 nm、120 fs、50 MHz、1 W)は、Ti = サファイアレーザー(810 nm、80 MHz、65 fs、1 W)または他の市販のフェムト秒レーザー発振器に置き換えることができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Stim-Aモードでは、明るいフェリドイメージング下の共焦点イメージングプレーンにおけるフェムト秒レーザーの局在化およびサイズが標的細胞に焦点を当てる。(A) フェムト秒レーザーはシャッターで遮断される。(B) フェムト秒レーザーがオンである。矢印:基準矢印は、フェムト秒レーザーフォーカスが正しい位置を見つけであることを確認するために、FOVの中心に設定されています。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:細胞培養、トランスフェクション、光刺激実験に用いられるペトリ皿。(A) 直径15mm、厚さ0.17mmのガラス底面の35mmペトリ皿。(B) ガラス底部と500μmセル位置グリッドを含む35mmペトリ皿。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CO2インキュベーションシステム。(A) CO2インキュベーターステージおよび(B)コントロールパネル。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:スティムAモードを使用したERK光活性化。(A) 単一写真刺激(1,040nm、40 mW、0.1s)は、ERK2-GFPを核に転移させ、次に細胞質に戻す。(B) ERK2信号パターンは、単一フェムト秒レーザー露光(赤色矢印、1,040nm、40mW、0.1秒)と2つの光刺激(緑色矢印、810nm、30mW、0.1秒)によって媒介される。(C)標的細胞における単一短フェムト秒レーザー露光による周囲細胞におけるERK活性化(白色矢印、810nm、24mW、0.2秒)。(D) eIF4E-Pの免疫蛍光は、単一光シミュレーション後24時間(810nm、25mW、0.2s)の有意な増加を示す。スケールバー = 10 μm (A)、および 20 μm (B,C)。ERK2-GFPおよびeIF4E-Pの蛍光は488 nm励起レーザーによって励起され、<560 nmチャネルで集められた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:スティムAモード下での光刺激によって誘発される複数のミトコンドリアイベント。(A) 単一刺激による刺激されたミトコンドリア管上のミトフラッシュの励起(810 nm、16 mW、0.1s)。(B) ミトコンドリア形態フラグメンテーションおよび単一光刺激による回復(1,040 nm,30 mW,0.1s)。(C)単一フェムト秒レーザー刺激によるミトコンドリア膜電位の振動(1040nm、20mW、0.1秒)。(A)(B)および(C)の矢印は光刺激の位置を示す。スケールバー = 10 μm.水戸-GFPまたはmt-cpYFPの蛍光は488 nm励起レーザーによって励起され、<560 nmチャネルで集められた。TMRMの蛍光は532 nm励起レーザーによって励起され、560-625 nmチャネルで集められた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 0.05 s | 0.1~ | 0.2~ | 0.5~ | |
| 810 nm、65 fs、80 MHz | 20 - 65 mW | 10 - 60 mW | 5 - 50 mW | 5 - 40 mW |
| 1040 nm、120 fs、50 MHz | 30 ~ 100 mW | 20 - 80 mW | 15 - 70 mW | 10 - 60 mW |
表 1:推奨刺激持続時間とスティムAモードでのフェムト秒レーザーの平均電力。
| 0.05 s | 0.1~ | 0.2~ | 0.5~ | |
| 810 nm、65 fs、80 MHz | 25 - 40 mW | 20 - 30 mW | 15 - 25 mW | 10 - 25 mW |
| 1040 nm、120 fs、50 MHz | 40 ~ 60 mW | 30 - 50 mW | 25 - 40 mW | 20 - 30 mW |
表 2:推奨刺激持続時間と2 x 2-3 x 3 μmのスティムAモードでのフェムト秒レーザーの平均電力2セル内で。
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Discussion
フェムト秒レーザーとレーザー走査共焦点顕微鏡システムを組み合わせることで光刺激戦略を実証する。光刺激は、それに応じてStim-Bを定義することにより、2光子顕微鏡として直接働くことができる。我々は、ターゲット細胞におけるERKシグナル伝達またはミトフラッシュを引き起こすためにフェムト秒レーザーの短いフラッシュを利用するための詳細なプロトコルを提供する。異なる刺激モードは、異なる実験目的およびシステムに従って行うことができる。Stim-Aは共焦点顕微鏡に基づいて容易に置くことができる。フェムト秒レーザーはFOV中心の回折限界レベルで集中することができる。細胞内標的は、フェムト秒レーザーフォーカス位置に手動で移動する必要があり、共焦点顕微鏡から完全に独立した任意の持続時間のために刺激することができます。従って、Stim-Aは焦点区域外にあるサンプルを完全に保護し、長時間の光刺激のために適している。Stim-Bの刺激領域は、FOV内の任意の領域として事前に定義することができる。自動的に実行できます。しかし、刺激持続時間と露光時間は、共焦点スキャンと一緒に行くことができます。各ピクセルの所要時間とフレームサイズの合計を設定した後、1つの顕微鏡フレーム内の刺激持続時間が実際に固定されます。光刺激はまた、フレームごとに定期的にフレームを行うことができる。また、光感度と光遺伝学的タンパク質を活性化するために使用することができます, より少ない露出時間が、大きな面積を必要とします.
このプロトコルの重要な考慮事項は、フェムト秒レーザー刺激のパラメータを決定する方法です。我々の以前の研究によると、細胞分子活性は、主に多光子の排泄17、21、22、23、24、25によって誘発される。一般に、マルチフォトンの吐出効率は、波長、パルス幅、繰り返し速度を含むすべてのフェムト秒レーザーパラメータに関連しています。細胞応答は、レーザーパワー、刺激位置/領域、および露光持続時間と同時にさらに関連しています。原則として、刺激効率は細胞の安全性と競合する。より高い平均電力、より長い刺激持続時間およびより大きい総入射レーザーエネルギーのようなより強い光刺激はより高い刺激効率に貢献するが、細胞損傷のより高い危険をもたらす。これらのパラメータは互いに相対的であり、すべてが刺激と損傷効果に寄与するので、総入射レーザーエネルギー、またはレーザー平均電力のような1つのパラメータだけを使用して、それが安全であるか定義することは不可能です。信号活性化効率と細胞安全性の両方を考慮し、ここでは、表1および表2の参照用に2つのフェムト秒レーザー光源の推奨平均電力および刺激持続時間を提供する。また、フェムト秒レーザー刺激のパラメータは、実際の光学系と生体試料に応じて変更する必要があります。
上記の議論によれば、光刺激パラメータのより詳細な有効範囲を提示する予定です。フェムト秒レーザーの波長は、光刺激に使用されるNIR範囲で変更することができます。パルス幅は、高いピーク電力と高い非線形排泄効率を提供するために短くする必要があります。このプロトコルでは、長いパルス時間はお勧めしません。通常、2フォトン顕微鏡検査(<200 fs)の典型的なパルス幅が適切な選択です。レーザーの繰り返し速度は重要な要因ではありません。MHz までの繰り返しレートは、このプロトコルに適しています。細胞分子応答の最も重要な要因は、フェムト秒レーザーのレーザーパワーと刺激持続時間です。ERKを活性化するために、前作22によれば、平均電力は15mW(810nm)または20mW(1,040 nm)、露光持続時間は0.2sで超高セル生存率を維持しながらERKシグナリングを活性化するのに十分な刺激を与えるのに十分です。ヘラ細胞それどころか、平均出力は80mW(810nm)または120mW(1,040nm)を超え、露光持続時間が1sより長いと細胞に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。ミトコンドリアは、一般的に光刺激に敏感です。40 mW(810 nm)または80mW(1,040 nm)を超える平均電力を有する刺激と0.2s以上の暴露持続時間は、刺激されたミトコンドリアの不可逆的な断片化、あるいは細胞全体のすべてのミトコンドリアに大きな損傷を引き起こす可能性がある。光刺激に対するミトコンドリアの光感受性は、異なる細胞タイプにおいて多大に異なることを留意すべきである。たとえば、HeLa セルでは、レーザーパワーは約 6 mW (810 nm、0.1 s の持続時間) しか必要としないほどです。すべてのミトコンドリアは、断片化、ミトフラッシュ、およびMMP振動の形で光刺激に応答することができます。しかし、ヒト間葉系幹細胞では、電力を約15mW(810nm、0.1sの持続時間)まで増加させる必要があり、まだ約半分の刺激されたミトコンドリアは光刺激に対する応答を示さない。Stim-Bモードでは、別の要因が光活性化効率に影響を与え、細胞損傷が刺激領域である。光刺激は、小さな刺激領域に送ることによって細胞損傷を引き起こす可能性があります。しかし、同じ刺激は、より大きな刺激領域に配信することによってERKを活性化するために失敗する可能性があります。標的細胞の刺激領域は約 2 x 2-3 x 3 μm2であり、25 μm2を超えないことをお勧めします。
刺激領域の局在化は、このプロトコルを適用するためにも重要です。以前の作品17、22によると、その領域の光刺激は、効果的にERでCa2+ストアを枯渇させ、CRACチャネルを活性化することができます。その後、Ca2+流入は、その後ERKシグナル伝達経路を活性化することができる。したがって、高いERK活性化効率を達成するために、Hela細胞のER領域に光刺激を送ることをお勧めします。ER領域は、位相対照目的によって明視野顕微鏡下で細胞質または核と容易に区別することができる。ミトコンドリアシグナル伝達事象を導入するために、フェムト秒レーザーの焦点は、関連する手順に従って選択されたミトコンドリア構造に容易に取り付けることができる。
このプロトコルに記載の光刺激方法は、Ca2+およびROS信号17、20、21を誘導するような他の複数の細胞イベントに影響を与えるためにも使用することができる。なお、これまでの全ての作品は、光刺激後の細胞安全性の評価を提供している。例えば、細胞の有意な形態変化、バブリング、ミトコンドリア断片化および細胞全体の腫脹、細胞の増殖速度の低下、および共焦点顕微鏡検査中の蛍光のいくつかの他の異常な変化はすべて高を意味する細胞の損傷。セルの状態を監視するには、非常に注意する必要があります。それにもかかわらず、レーザーパワーと刺激パラメータをうまく制御して、細胞の生存率は高い刺激効率と同時に非常に高いレベルで維持することができる。したがって、フェムト秒レーザーのこの光威圧法は、より多くの領域にさらに拡張し、関連するアプリケーションに適用される可能性が高い。
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Disclosures
著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81571719および81661168014、81673014、81870055)、上海市科学技術委員会(18QA14023000および16XD1403100)、および国家キーR&プランD00000によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| Petri dish | NEST | 801002 | |
| Petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| Paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
References
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