Summary
Este protocolo fornece um método simples e confiável para a produção de fatias hepáticas de corte de precisão viável de camundongos. As amostras de tecido ex vivo podem ser mantidas condições de cultura de tecidos de laboratório por vários dias, fornecendo um modelo flexível para examinar a patobiologia hepática.
Abstract
Compreender os mecanismos de lesão hepática, fibrose hepática e cirrose que sustentam doenças hepáticas crônicas (ou seja, hepatite viral, doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática metabólica e câncer de fígado) requer manipulação experimental de modelos animais e culturas de células in vitro. Ambas as técnicas possuem limitações, como a exigência de um grande número de animais para manipulação in vivo. No entanto, as culturas celulares in vitro não reproduzem a estrutura e a função do ambiente hepático multicelular. O uso de fatias hepáticas cortadas com precisão é uma técnica na qual fatias uniformes de fígado de rato viável são mantidas na cultura de tecidos de laboratório para manipulação experimental. Essa técnica ocupa um nicho experimental que existe entre estudos em animais e métodos de cultura celular in vitro. O protocolo apresentado descreve um método simples e confiável para isolar e cultivar fatias hepáticas cortadas com precisão de camundongos. Como aplicação desta técnica, as fatias de fígado ex vivo são tratadas com ácidos biliares para simular lesão hepática colestática e, finalmente, avaliar os mecanismos da fibrogênese hepática.
Introduction
A patogênese da maioria das doenças hepáticas crônicas (ou seja, hepatite viral, esteatohepatite não alcoólica, lesão hepática colestática e câncer de fígado) envolve interações complexas entre vários tipos diferentes de células hepáticas que impulsionam inflamação, fibrogênese e desenvolvimento do câncer1,2. Para entender os mecanismos moleculares subjacentes a essas doenças crônicas baseadas no fígado, as interações entre múltiplos tipos de células hepáticas devem ser investigadas. Embora múltiplas linhas de células hepáticas (e, mais recentemente, organóides) possam ser cultivadas in vitro, esses modelos não emulam com precisão a complexa estrutura, função e diversidade celular do microambiente hepático3. Além disso, células hepáticas cultivadas (em particular, linhas celulares transformadas) podem desviar-se de sua biologia de origem original. Modelos animais são usados experimentalmente para investigar as interações entre múltiplos tipos de células hepáticas. No entanto, eles podem se tornar significativamente reduzidos no escopo para manipulação experimental, devido a efeitos significativos fora do alvo em órgãos extrahepáticos (por exemplo, ao testar potenciais terapêuticas).
O uso de fatias hepáticas cortadas com precisão (PCLS) na cultura tecidual é uma técnica experimental usada pela primeira vez em estudos de metabolismo de drogas e toxicidade, e envolve o corte de fatias hepáticas viáveis, ultrafinas (cerca de 100-250 μm de espessura). Isso permite a manipulação experimental direta do tecido hepático ex vivo4. A técnica faz uma ponte entre os estudos em animais in vivo e os métodos de cultura celular in vitro, superando muitas desvantagens de ambos os métodos (ou seja, limites práticos na gama de experimentos que podem ser realizados em animais inteiros, bem como perda de estrutura/função e diversidade celular com métodos de cultura celular in vitro).
Além disso, o PCLS aumenta consideravelmente a capacidade experimental em comparação com estudos em animais inteiros. Como um rato pode produzir mais de 48 fatias de fígado, isso também facilita o uso de grupos de controle e tratamento do mesmo fígado. Além disso, a técnica separa fisicamente o tecido hepático de outros sistemas de órgãos; portanto, remove potenciais efeitos fora do alvo que podem ocorrer em animais inteiros ao testar os efeitos de estímulos exógenos.
Neste protocolo, os PCLS são gerados usando um vibratome com uma lâmina vibratória lateral. Outros estudos têm usado com sucesso um cortador de tecido krumdieck, como descrito em Olinga e Schuppan5. No vibratomo, a vibração lateral da lâmina evita o rasgo do tecido ultrafino causado pelo estresse da cisalhamento, pois a lâmina é empurrada para dentro do tecido. Tanto o vibratome quanto o cortador de tecido krumdieck funcionam efetivamente sem incorporação estrutural de tecido hepático, o que agiliza o procedimento de corte. Esta técnica também pode ser usada para criar PCLS a partir de fígados doentes, incluindo os de modelos de camundongos de fibrose/cirrose6 e esteatose hepática7.
Além de demonstrar as técnicas necessárias para a preparação e cultura tecidual do PCLS, este relatório também examina a viabilidade desses tecidos ex vivos medindo os níveis de tofosfato de adenosina (ATP) e examinando a histologia tecidual para avaliar necrose e fibrose. Como procedimento experimental representativo, os PCLS são tratados com concentrações fisiopatológicas de três ácidos biliares diferentes (ácidos glicólico, taurocholic e célico) para simular lesão hepática colestática. No contexto da lesão hepática colestática, o ácido taurochólico, em particular, mostrou-se significativamente aumentado tanto no soro quanto na bile de crianças com fibrose cística associada à doença hepática8.
As células progenitoras hepáticas também foram tratadas in vitro com ácido taurochólico para simular os níveis elevados de ácido taurochólico observados em pacientes, e este tratamento causou aumento da proliferação e diferenciação das células progenitoras hepáticas em direção a um fenótipo biliar (colangiocito)9. Posteriormente, os PCLS foram tratados ex vivo com níveis elevados de ácido taurochólico, e foram observados marcadores de colangiocito aumentados. Isso suporta a observação in vitro de que o ácido taurochólico impulsiona a proliferação biliar e/ou diferenciação no contexto da doença hepática cística pediátrica9.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o código australiano para o cuidado e uso de animais para fins científicos no QIMR Berghofer Medical Research Institute com aprovação do comitê de ética animal do instituto. Os camundongos C57BL/6 machos (15-20 semanas de idade) foram obtidos do Centro de Recursos Animais, WA, Austrália.
NOTA: Todas as soluções, mídia, instrumentos, hardware e tubos que contactam as amostras devem ser esterilizadas ou completamente desinfetadas com uma solução de 70% de etanol e tratadas com técnicas estéreis para minimizar o risco de contaminação da cultura.
1. Configuração do vibratome
- Preparar solução tampão Krebs-Henseleit estéril com glicose de 2 g/L(Tabela de Materiais). Verifique se o pH do buffer é de 7.4. Se o pH for maior, saturar o tampão com carbógênio (95% O2 + 5% CO2) ou incubar dentro de uma incubadora de cultura tecidual de 5% co2 para corrigir o sistema de tampão de bicarbonato. Leve à geladeira a solução de tampão estéril selado a 4 °C.
- Insira a lâmina vibratome no braço de corte. Certifique-se de que a lâmina está bem fixada no braço de corte, pois as vibrações podem fazer com que a lâmina se solte.
- Desinfete a lâmina e o braço de corte com uma solução de 70% de etanol.
ATENÇÃO: Evite o contato com a lâmina. - Desinfete a bandeja tampão com uma solução de 70% de etanol e limpe-a com um tecido estéril.
- Insira a bandeja de tampão no vibratome e aperte o mecanismo de montagem.
- Ajuste o braço de corte para a altura máxima disponível.
- Coloque o ângulo da lâmina a 10° abaixo da horizontal, inclinando-se para baixo para baixo para a amostra. Certifique-se de que o ângulo da lâmina está bem fixado.
NOTA: O ângulo ideal da lâmina pode diferir dependendo do modelo de vibratomo e das características do tecido. - Desinfete o suporte da amostra com uma solução de 70% de etanol.
- Conecte a água de resfriamento para o refrigerador termoelétrico Peltier localizado a bandeja de tampão.
NOTA: Alguns modelos de vibratome usam um banho de gelo para resfriamento. - Fixar o tubo de saída de água em um dreno e ligar a água. Coloque o refrigerador em 4 °C. Executar água de resfriamento a uma taxa de >400 mL/min.
- Encha a bandeja de tampão quase até o topo com tampão Krebs-Henseleit estéril (com glicose de 2 g/L). Deixe uma solução tampão Krebs-Henseleit adicional no gelo.
2. Remoção e preparação do fígado
- Esterilizar ou desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo fórceps curvos, fórceps de ponta quadrada plana, pinças, grampos cirúrgicos e tesouras usando autoclaving.
- Antes da remoção do fígado, os camundongos anestesiam profundamente usando uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina.
NOTA: Outros anestésicos podem ser usados, ou2 os camundongos podem ser eutanizados por asfixia por CO 2/luxação cervical se o fígado for rapidamente removido para evitar danos induzidos por hipóxia. - Desinfetar superfícies da pele em camundongos, mumando com uma solução de 70% de etanol. Proteja maquetes com todas as extremidades presas a uma tábua dissecada.
- Faça uma incisão vertical na linha média na pele desde a base da cavidade abdominal até um pouco acima do diafragma.
NOTA: As incisões em direção às extremidades são feitas para facilitar a retração da pele. - Puxe a pele para trás enquanto corta qualquer tecido conjuntivo entre a pele e a cavidade abdominal. Evitar que o cabelo seja transferido para a cavidade abdominal tanto quanto possível. Pino ou fixar a pele para longe da cavidade abdominal.
- Usando fórceps e tesouras limpas, abra a cavidade abdominal e a cavidade torácica inferior.
- Removendo o fígado rapidamente sem danificar os lóbulos
- Usando ferramentas contundentes (por exemplo, fórceps de ponta quadrada plana), guie os lóbulos do fígado superior para baixo em direção ao abdômen. Corte o tecido conjuntivo ao redor dos lóbulos do fígado superior usando uma tesoura.
- Guie os lóbulos do fígado para cima em direção ao diafragma. Segure o feixe vascular central do fígado com fórceps.
NOTA: Não afetará o procedimento se o feixe vascular central estiver danificado. - Puxe o feixe vascular central para longe do camundongo e corte o tecido conjuntivo restante, vasos sanguíneos, etc. para remover o fígado. Tome cuidado para não danificar os lóbulos do fígado e 2) cortar no trato gastrointestinal, pois isso pode contaminar o fígado com microrganismos.
- Coloque o fígado removido em um prato estéril de cultura de tecido de 10 cm meio cheio com solução tampão Krebs-Henseleit gelada. Usando um instrumento contundente para guiar os lóbulos, corte o centro do fígado para dividi-lo em lóbulos separados.
- Selecione um lobo hepático (use o maior primeiro), e coloque-o de lado plano para baixo em um novo prato estéril de 10 cm. Mantenha todos os outros lóbulos de fígado no prato da solução tampão Krebs-Henseleit armazenados no gelo para uso subsequente.
- Corte cerca de 10% do material da borda mais alta do lóbulo do fígado enquanto estiver deitado.
NOTA: O corte é importante, pois esta borda tecidual entrará em contato com a lâmina de corte primeiro; portanto, uma borda tecidual relativamente perpendicular à lâmina de corte evitará a compressão tecidual que pode ocorrer devido a ângulos rasos nos lóbulos do fígado sem cortes. - Apare as outras três bordas teciduais.
NOTA: Isso remove parte da cápsula fibrosa de Glisson e facilitará a separação das fatias de tecido. - Montagem do lóbulo do fígado no suporte do espécime
- Coloque uma fina camada de cola cianoacrilato (supercola ou cola cianoacrilato de grau médico/veterinário) sobre o suporte da amostra em direção à frente, tamanho ligeiramente maior que o lobo hepático aparado.
NOTA: Verifique se a cola cianoacrilato não contém aditivos não cianoacrilato. - Pegue suavemente o lóbulo do fígado com fórceps estéreis usando um canto longe da borda de corte, em seguida, seque qualquer tampão residual do lado plano do lóbulo do fígado usando material absorvente estéril.
- Coloque o grande lado plano do lóbulo do fígado sobre a mancha de cola cianoacrilato com a maior borda voltada para a frente. Deixe-o curar no ar por 1-2 min.
NOTA: Os adesivos cianoacrilato curam rapidamente (~2 min) em resposta à umidade residual e proteínas teciduais, e eles vão fixar firmemente o tecido ao suporte da amostra.
- Coloque uma fina camada de cola cianoacrilato (supercola ou cola cianoacrilato de grau médico/veterinário) sobre o suporte da amostra em direção à frente, tamanho ligeiramente maior que o lobo hepático aparado.
3. Produção de fatias de fígado
- Coloque o suporte do espécime com o lóbulo do fígado anexado na bandeja tampão de vibratome. Certifique-se de que o lobo do fígado está totalmente coberto por tampão.
NOTA: Se necessário, cubra o nível da solução tampão Krebs-Henseleit gelada. Se o nível de buffer obscurecer o processo de corte, aumente ou diminua o nível. - Defina a velocidade de corte.
NOTA: Isso pode precisar ser empiricamente determinado dependendo do modelo de vibratome e características da lâmina. Como guia de partida, use uma velocidade de 57 Hz/3.420 rpm. A velocidade do vibratome pode ser medida usando um aplicativo analisador de espectro de áudio em um smartphone. - Abaixe a lâmina de corte até que esteja localizada logo acima do lóbulo do fígado usando o mostrador de altura. Execute o braço de corte vibrante sobre a amostra.
- Devolva a lâmina usando a manivela ao contrário. Ative as vibrações enquanto devolve a lâmina. Depois que a lâmina voltar e não estiver acima da amostra, abaixe a altura da lâmina em 250 μm.
- Repita o processo de corte até que a parte superior do tecido seja removida. Descarte a primeira ou duas fatias, pois estas conterão a cápsula de Glisson e, portanto, não contêm muito tecido hepático funcional em comparação com outras fatias.
- Para cortar as fatias de fígado, avance lentamente a lâmina vibratória para dentro do tecido girando a pega. Use um pincel pequeno (desinfetado com uma solução de 70% de etanol) para guiar suavemente o tecido durante o processo de corte.
- Use o pincel para levantar as fatias de tecido cortadas e coloque a fatia de tecido em um tubo estéril de tampão Krebs-Henseleit gelado. Quando não estiver em uso, mantenha este tubo no gelo entre as fatias.
NOTA: Às vezes, o tecido rasga durante o processo de corte, mas para a maioria dos propósitos o tecido ainda é utilizável. - Repita o processo de corte até que a base do lóbulo do fígado seja atingida. Descarte quaisquer fatias de fígado que tenham cola curada visível.
NOTA: A cola curada é visível como áreas brancas nas fatias de tecido. Um lobo hepático típico só terá uma espessura utilizável de cerca de 2 mm. Portanto, apenas cerca de oito fatias de fígado de 250 μm são produzidas a partir de cada lobo. - Corte as fatias de tecido até perto da cola cianoacrilato. Não corte na cola.
- Repita todo o processo com outros lóbulos hepáticos até obter o número necessário de fatias de tecido.
- Para limpar a cola de cianoacrilato curada e tecido do suporte da amostra, use uma lâmina para raspar a mistura de cola/tecido curada, ou amoleça e limpe a mistura com acetona ou sulfóxido de dimetila.
4. Cultura tecidual
NOTA: Todo o trabalho de cultura de tecidos deve ser realizado em uma capa de fluxo laminar estéril.
- Em uma capa de fluxo laminar de cultura tecidual, pipeta 1 mL do meio E de William contendo glicose de 2,0 g/L, 10% de soro bovino fetal (FBS), suplemento de L-glutamina de 2 mM MM, penicilina de 100 U/mL e 100 μg/mL de estreptomicina em 12 placas de cultura de tecido.
NOTA: Outros antibióticos e agentes antifúngicos também podem ser adicionados. Alguns estudos têm usado aditivos no meio de incubação tecidual (ou seja, dexametasona e insulina10),mas estes podem interferir na sinalização celular. - Coloque o tubo contendo fatias de fígado de gelo na capa de cultura de tecidos. Para remover as fatias de tecido, gire suavemente a mistura e levemente coloque em um prato estéril de 10 cm enquanto gira.
- Usando fórceps estéreis de ponta afiada e bisturi, corte as fatias de tecido em tamanhos aproximadamente uniformes (por exemplo, 15 mm2).
NOTA: Esta etapa é realizada para garantir uma área de superfície consistente. Como os lóbulos do fígado do rato são significativamente diferentes em tamanho e algumas fatias de tecido vão rasgar, isso produzirá uma gama de PCLS com diferentes áreas de superfície. Os tamanhos finais da área de superfície do PCLS dependem de quanto material é necessário em aplicações de análise subseqüentes e quantas réplicas são necessárias. Cortar pcls grandes em pedaços múltiplos menores do mesmo tamanho aproximado permitirá inatamente um número maior de réplicas experimentais. - Com fórceps estéreis ou um pincel pequeno, transfira as fatias de tecido cortado para os poços de uma placa de 12 poços contendo 1 mL de meio.
NOTA: Tome cuidado para confirmar a consistência da espessura e forma das fatias de tecido. Seções mais escuras que a média sugerem que a espessura do tecido é maior e precisa ser descartada. Fatias mais leves sugerem a presença de cola de cianoacrilato curada e precisam ser descartadas. - Incubar as fatias de fígado a 37 °C e 5% co2 abaixo de 95% de umidade.
NOTA: Outros grupos têm usado métodos para melhorar a entrega de oxigênio ao PCLS, que parecem prolongar o tempo de sobrevivência do tecido6,,10,,11,,12,13 (ver seção de discussão). - No dia seguinte, mude o meio de cultura usando uma pipeta manual (em vez de sucção) para evitar a perda de tecido através de erros de sucção. Posteriormente, altere o meio no PCLS diariamente. O PCLS está agora pronto para uso experimental.
5. Exemplo de aplicação do PCLS
- Às 16 h pós-geração, trate o PCLS com três ácidos biliares diferentes: ácido glicêlico (GCA), ácido taurochólico (TCA) e ácido célico (CA) (como sais de sódio, todos com concentração de 150 μM) por 2 dias.
- Após 2 dias de tratamento com ácido biliar, extraia mRNA colocando fatias de tecido no tampão de lyse de RNA frio e homogeneiza rapidamente usando contas com um homogeneizadorde contas (Tabela de Materiais).
- Purifique o RNA usando um kit de isolamento de RNA (Tabela de Materiais) e crie cDNA a partir do RNA purificado.
- Realize a reação em cadeia quantitativa de polimerase(Tabela de Materiais)utilizando primers específicos(Tabela 1)no cDNA para examinar a expressão genética.
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Representative Results
Para determinar a viabilidade celular do PCLS ao longo do tempo, foram medidos os níveis de ATP do tecido. Os níveis de ATP são tipicamente proporcionais à viabilidade. Os PCLS (cerca de 15 mm2 na área) foram cultivados no meio E normal de William com 10% de FBS, depois em pontos de tempo específicos, as fatias de fígado foram removidas da cultura tecidual e homogeneizadas com concentrações de ATP e proteína (para normalização)(Tabela de Materiais)sendo medida(Figura 1A). Para ensaios bioquímicos como este, a normalização é importante, pois as fatias de fígado cortadas não são necessariamente idênticas em dimensões. Os níveis de ATP (relativos à proteína) foram suprimidos imediatamente após o isolamento e após 1h(Figura 1A),sugerindo estresse metabólico de curto prazo dos procedimentos de resfriamento e corte. No entanto, os níveis de ATP recuperados por 3 h. Os níveis de ATP permaneceram elevados em até 5 dias de cultura tecidual, indicando nenhuma diminuição significativa na viabilidade. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de fatias hepáticas sugeriu que a necrose tecidual limitada (caracterizada pelo pleomorfismo nuclear) ocorreu na cultura nos dias 2 e 3. Os níveis de necrose tecidual progrediram para graves até o dia 5 (Figura 1B). Considerando esses dados morfológicos, obtidos juntamente com os resultados da ATP, recomenda-se o uso deste modelo de tecido experimental por até 3 dias.
O PCLS também apresentou aumento do acúmulo de colágeno em pontos de tempo de cultura posteriores, como mostrado pelo espessamento das fibras de colágeno manchadas de picro-sirius no dia 5(Figura 2). Este espessamento das fibras de colágeno sugere que os processos fibrogênicos espontâneos estão ativos no PCLS obtido usando este método. Este processo parece independente da metodologia de isolamento do PCLS com o espessamento das fibras de colágeno6 e expressão genética profibrogênica14 ocorrendo tanto de cortadores de tecido vibratome quanto krumdieck, respectivamente, ao longo do tempo. O desenvolvimento desses processos fibrogênicos espontâneos precisa ser levado em conta na interpretação da biologia do PCLS, particularmente com experimentos associados a processos fibrosos.
Já mostramos anteriormente a indução significativa da connexina genética específica do colangiocyte 43(Cx43)e da secreção da proteína glutamyl transpeptidase(Ggt1)por TCA no PCLS9. A expressão de genes específicos de coleangiocitto em relação aos controles de limpeza (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase [Gapdh] e hipoxantina fosforibosyltransferase 1 [Hprt1]) em PCLS tratados com TCA, GCA ou CA foram examinados por qPCR usando primers específicos. Consistente com um relatório anterior, uma indução significativa na expressão de genes específicos do colangiocyte citoqueratina 19 (CK19; Figura 3A) e connexina 43(Cx43; Figura 3B) foram observadas tanto pela GCA quanto pelo TCA. A expressão ggt1 foi aumentada por ambos os ácidos biliares; embora isso não tenha alcançado significância estatística, possivelmente devido à variação experimental(Figura 3C). A expressão de AC não foi afetada por qualquer ácido biliar. A indução de genes específicos do colangiocyte sugere que a GCA também pode estar envolvida em lesão hepática colestática, como relatado anteriormente para TCA8,9.
Figura 1: Viabilidade tecidual de fatias hepáticas cortadas com precisão (PCLS). (A) Os níveis de ATP e proteína no PCLS foram medidos imediatamente (T + 0) e em 1h, 3h, 6h e 1-5 dias após o isolamento. (B) Para examinar a morfologia celular, os PCLS foram fixados, incorporados à parafina, seccionados e manchados com H&E imediatamente (dia 0) e a 1, 2 e 5 dias de pós-isolamento. Um teste de Kruskal-Wallis com o teste de múltiplas comparações de Dunn foi realizado em relação a T + 0. Todos os dados são representados como média ± SEM (n = 2-3 ratos) com *p < 0,05. As barras de escala representam 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação da deposição de colágeno no PCLS. Os PCLS foram fixados, incorporados à parafina, seccionados e manchados com vermelho Picro-Sirius para visualizar fibras de colágeno nos dias 0, 1, 2 e 5 pós-isolamento. As barras de escala representam 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os ácidos biliares induzem a expressão genética específica do colangiocyte. Às 16 h pós-isolamento, o meio no PCLS foi alterado, e o novo meio foi adicionado juntamente com 150 μM glicocholic (GCA), taurocholic (TCA) ou ácidos célicos (CA) (sais de sódio). Os PCLS foram colhidos após 2 dias, e a expressão de citoqueratina 19 (CK19; A), connexin a 43(Cx43; B), e γ-glutamyl transpeptidase 1 (Ggt1; C) foi examinado em relação à média geométrica de Gapdh e Hprt1. O teste de múltiplas comparações de Dunnett foi realizado em relação às fatias de tecido de controle não tratadas (n = 15). Todos os dados são representados como média ± SEM (n = 4 ratos, fatias de triplicado; *p < 0,05, **p < 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: primers qPCR.
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Discussion
O protocolo demonstra a aplicação do isolamento murina PCLS e cultura tecidual, e os procedimentos são projetados para avaliar tanto a viabilidade quanto a utilidade, bem como examinar os impactos de mediadores exógenos da patobiologia hepática usando ensaios bioquímicos, histologia e qPCR. A utilidade experimental da cultura de tecidos PCLS em roedores e humanos tem sido demonstrada em uma ampla gama de aplicações, incluindo investigações experimentais em microRNA15/RNA9/expressão proteica16, metabolismo17, dinâmica de infecção viral10,18, sinalização de infecção19, invasão de tumor12, estudos de toxicidade4,13,15,20, dano de DNA estudos21, biologia celular14, e estudos de secreção9.
Enquanto os níveis de ATP indicam viabilidade celular em PCLS até 5 dias na cultura, a coloração de H&E sugere que a necrose grave estava ocorrendo em 5 dias na cultura. O principal fator que parece limitar a viabilidade do PCLS é a disponibilidade de oxigênio6,11. Vários estudos incluíram maior disponibilidade de oxigênio e, consequentemente, aumento do tempo de viabilidade do PCLS na cultura tecidual. Os métodos utilizados para aumentar a disponibilidade de oxigênio incluem a incubação de tecidos em atmosferas ricas em oxigênio10,11, uso da perfluorodecalína do transportador de oxigênio12,agitando/rolando a cultura durante a incubação6,,10,,13,e placas de cultura de tecido projetadas para maximizar a oxigenação6.
Recentemente, um inovador sistema de cultura de tecido de interface ar-líquido foi descrito com utilidade funcional declarada em mais de 7 dias na cultura14. Este protocolo usa oxigênio atmosférico ambiente em uma incubadora de cultura de tecido normal. O método permite que o PCLS seja acessível a laboratórios que não possuem equipamentos personalizados altamente especializados para melhorar com segurança a entrega de oxigênio. No entanto, se tais métodos para melhorar a entrega de oxigênio estiverem disponíveis, eles podem melhorar a viabilidade de PCLS a longo prazo na cultura.
O acúmulo de colágeno no PCLS após o dia 3 na cultura sugere que os processos fibrogênicos espontâneos estão ativos dentro desse modelo. A fibrose espontânea também foi observada anteriormente nos PCLS6,,14,,22,,23,,24 e possivelmente é mediada por padrões moleculares associados a danos (DAMPs) liberados pelo processo de corte ou necrose tecidual. Os DAMPs atuam como moléculas de sinalização que posteriormente ativam vias de sinalização pró-fibrosas25,26. Além disso, a fibrose espontânea no PCLS pode ser mediada por quimiocinas liberadas a partir da ativação de células estelares e/ou células Kupffer (ou seja, transformando o fator de crescimento beta [TGF-β]). Nesse contexto, um artigo recente de Bigaeva et al.24 sugere que a fibrose espontânea no PCLS é parcialmente mediada pela sinalização TGF-β, pois a incubação de PCLS com inibidor de TGF-β Galunisertib inibiu alterações de expressão genética associadas à fibrose hepática espontânea. Outro mecanismo possível é que o procedimento de corte induz inicialmente a proliferação celular de vias de sinalização e entrada de hepatócitos no ciclo celular; no entanto, esse mecanismo falha e resulta na detenção do ciclo celular na fase27do G1 . A parada do ciclo celular está associada à fibrose hepática em vez da regeneração hepática28.
No procedimento experimental representativo, os PCLS são tratados com três ácidos biliares diferentes (GCA, TCA e CA) durante 2 dias para simular lesão hepática cholestatic. Dois dos ácidos biliares (GCA e TCA) induzem expressões significativas de CK19 e Cx43, que são genes associados à função de colangiocito. Isso sugere a expansão ou diferenciação das células para uma linhagem de colangiocitos em PCLS tratados com esses ácidos biliares. Isso é consistente com o nosso trabalho anterior mostrando um efeito semelhante usando TCA9 no PCLS. Além disso, também é consistente com observações in vivo que mostram que a alimentação taurocholato a ratos aumenta o número de colangiocitos29. O tratamento de fatias de tecido hepático com ácidos biliares simula colestase hepática, e especula-se que o aumento na expressão de genes associados à função de colangiocyte é uma tentativa do tecido hepático de criar ductules biliares adicionais para aumentar a secreção biliar. Dada a indução específica desses genes é produzida pelos ácidos biliares conjugados (GCA e TCA), mas não pelo AC não conjugado, suspeita-se que esses efeitos sejam mediados pelo receptor esfinge-1-fosfato 2, um receptor de superfície celular com ativação preferencial por ácidos biliares conjugados30.
Uma das principais limitações da aplicação do PCLS é a variabilidade individual da replicação. Como o fígado não é homogêneo e há variabilidade na produção, as fatias de fígado tendem a ter maior variação biológica do que a experimentação da cultura celular. Em estudos experimentais com poucas variáveis, como o procedimento representativo demonstrado acima, isso é superado pelo aumento do número de réplicas. No entanto, isso pode se tornar um problema para estudos de triagem maiores. Em resumo, o protocolo descrito é um método simples e confiável para estudar aspectos da patobiologia hepática ex vivo, exigindo pouco equipamento especializado, exceto o vibratome.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa do National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália (Grant No. APP1048740 e APP1142394 para G.A.R.; APP1160323 para J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm é apoiado por uma Bolsa de Pesquisa Sênior do NHMRC da Austrália (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo foi apoiado pelo programa TALENTO de Madrid, Espanha (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
