Summary
Этот протокол обеспечивает простой и надежный метод для производства жизнеспособных точных ломтиков печени от мышей. Образцы тканей ex vivo могут поддерживаться в условиях культуры лабораторных тканей в течение нескольких дней, обеспечивая гибкую модель для изучения патобиологии печени.
Abstract
Понимание механизмов повреждения печени, фиброза печени и цирроза печени, лежащих в основе хронических заболеваний печени (т.е. вирусный гепатит, безалкогольные жировые заболевания печени, метаболические заболевания печени и рак печени) требует экспериментальных манипуляций животных моделей и культур клеток in vitro. Оба метода имеют ограничения, такие как требование большого количества животных для манипуляции in vivo. Однако культуры клеток in vitro не воспроизводят структуру и функцию многоклеточной печеночной среды. Использование точно вырезанных ломтиков печени является методом, в котором единые ломтики жизнеспособной печени мыши поддерживаются в культуре лабораторных тканей для экспериментальных манипуляций. Этот метод занимает экспериментальную нишу, которая существует между исследованиями на животных и методами культуры клеток in vitro. Представленный протокол описывает простой и надежный метод изоляции и культуры точно вырезанных ломтиков печени от мышей. Как применение этого метода, ex vivo ломтики печени обрабатываются желчных кислот для имитации холестатической травмы печени и в конечном итоге оценить механизмы фиброгенеза печени.
Introduction
Патогенез большинства хронических заболеваний печени (т.е. вирусный гепатит, безалкогольный стеатогепатит, холестатическая травма печени и рак печени) включает в себя сложные взаимодействия между несколькими различными типами клеток печени, которые приводят к воспалению, фиброгенезу и развитию рака1,2. Чтобы понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этих хронических заболеваний на основе печени, взаимодействия между несколькими типами клеток печени должны быть исследованы. В то время как несколько линий печеночных клеток (и в последнее время, органоиды) могут быть культивированы в пробирке, эти модели не точно эмулировать сложную структуру, функцию и клеточное разнообразие печеночной микросреды3. Кроме того, культивированные клетки печени (в частности, преобразованные клеточные линии) могут отклоняться от исходной биологии источника. Модели животных используются экспериментально для исследования взаимодействий между несколькими типами клеток печени. Тем не менее, они могут значительно сократить возможности для экспериментальных манипуляций, в связи со значительными внецелевых эффектов в внепеченных органов (например, при тестировании потенциальных терапевтических).
Использование точно вырезанных ломтиков печени (PCLS) в культуре тканей является экспериментальной техникой, впервые используемой в исследованиях метаболизма и токсичности наркотиков, и включает в себя резки жизнеспособных, ультратонких (около 100-250 мкм толщиной) ломтиков печени. Это позволяет прямое экспериментальное манипулирование ткани печени ex vivo4. Техника мосты экспериментальный разрыв между in vivo исследований на животных и in vitro клеточной культуры методов, преодоление многих недостатков обоих методов (т.е., практические ограничения на диапазон экспериментов, которые могут быть выполнены в целых животных, а также потеря структуры / функции и клеточного разнообразия с методами культуры in vitro клеток).
Кроме того, PCLS значительно увеличивает экспериментальные возможности по сравнению с целыми исследованиями на животных. Как одна мышь может производить более 48 ломтиков печени, это также облегчает использование как контроль и лечение групп из той же печени. Кроме того, методика физически отделяет ткани печени от других систем органов; Таким образом, он удаляет потенциальные вне целевых эффектов, которые могут возникнуть у целых животных при тестировании эффектов экзогенных стимулов.
В этом протоколе PCLS генерируется с помощью вибратом с боковой вибрирующим лезвием. Другие исследования успешно использовали слайсер ткани Krumdieck, как описано в Olinga и Schuppan5. В вибратоме боковая вибрация лезвия предотвращает разрыв ультратонкой ткани, вызванный стрессом сдвига, так как лезвие заталкивается в ткань. Оба вибратоми и Krumdieck ткани слайсер эффективно работать без структурного встраивания ткани печени, которая упрощает процедуру нарезки. Этот метод также может быть использован для создания PCLS из больной печени, в том числе из мышиных моделей фиброза / цирроза6 и печеночного стеатоза7.
В дополнение к демонстрации методов, необходимых для подготовки и культуры тканей PCLS, в этом докладе также рассматривается жизнеспособность этих экс-виво тканей путем измерения аденозин трифосфата (АТФ) уровней и изучения гистологии тканей для оценки некроза и фиброза. В качестве репрезентативной экспериментальной процедуры, PCLS лечатся патофизиологическими концентрациями трех различных желчных кислот (гликохобол, таурочич и холич) для имитации холестатической травмы печени. В контексте холестатической травмы печени, таурочохолная кислота, в частности, было показано, что значительно увеличилось как в сыворотке и желчи детей с муковисцидозом связанных заболевания печени8.
Клетки-прародители печени также лечились в пробирке с таурочольной кислотой для имитации повышенных уровней таурочоличной кислоты, наблюдаемых у пациентов, и это лечение вызвало повышенную пролиферацию и дифференциацию клеток-прародителей печени в сторону желчного (холангиоцита) фенотипа9. Впоследствии, PCLS были обработаны ex vivo с повышенным уровнем таурочоличной кислоты, и повышенные маркеры холангиоцита наблюдались. Это поддерживает наблюдения in vitro, что таурочохоловая кислота приводит к распространению и/или дифференциации в контексте детской муковисцидозной болезни печени9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Австралийским кодексом по уходу и использованию животных в научных целях в Медицинском научно-исследовательском институте «ИМР Бергхофер» с одобрения комитета по этике животных института. Мышей C57BL/6 (15–20 недель) получили в Центре ресурсов животных, штат Вашингтон, Австралия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения, средства массовой информации, инструменты, аппаратные средства и трубки, которые контактируют с образцами, должны быть стерилизованы или тщательно дезинфицированы с помощью 70% раствора этанола и обработаны с использованием стерильных методов, чтобы свести к минимуму риск загрязнения культуры.
1. Установка вибратом
- Подготовка стерильного буферного раствора Krebs-Henseleit с глюкозой 2 г/л(Таблица материалов). Убедитесь, что рН буфера составляет 7,4. Если рН выше, насытите буфер карбогеном (95% O2 и 5% CO2)или инкубировать в 5% CO2 ткани культуры инкубатора для коррекции бикарбоната буферизации системы. Охладите герметичную стерильный буферный раствор при 4 градусах Цельсия.
- Вставьте лезвие вибратомва в режущей руку. Убедитесь, что лезвие плотно крепится к режущей руке, так как вибрации могут привести к тому, что лезвие может оторваться.
- Дезинфицировать лезвие и разрезать руку 70% раствором этанола.
ВНИМАНИЕ: Избегайте контакта с лезвием. - Дезинфекция буфер лоток с 70% этанола раствор и протрите его стерильной ткани.
- Вставьте буферный лоток в вибратом и затяните монтажный механизм.
- Установите режущую руку на максимально доступную высоту.
- Установите угол лезвия на 10 градусов ниже горизонтальной, наклоняясь вниз к образцу. Убедитесь, что угол лезвия плотно зафиксирован.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный угол лезвия может отличаться в зависимости от модели вибратом и характеристик тканей. - Дезинфекция образца держателя с 70% этанола раствор.
- Подключите охлаждающую воду для термоэлектрического охладителя Peltier, расположенного под буферным подносом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые модели вибратом используют ледяную ванну для охлаждения вместо. - Закрепите водопроводную трубу в канализацию и включите воду. Установите кулер до 4 градусов по Цельсию. Запуск охлаждающей воды со скоростью 400 мл/мин.
- Заполните буферный лоток почти до верха стерильным ледяным буфером Кребс-Хенселейт (с глюкозой 2 г/л). Оставьте дополнительный буферный раствор Krebs-Henseleit на льду.
2. Удаление печени и подготовка
- Стерилизовать или дезинфицировать все хирургические инструменты, включая изогнутые щипцы, плоские квадратные щипцы, пинцеты, хирургические зажимы и ножницы с помощью автоклавирования.
- Перед удалением печени глубоко обезвреждают мышей с помощью интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг кетамина и 12,5 мг/кг ксилазина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие анестезии могут быть использованы, или мышей может быть усыплен CO2 асфиксии / шейки дислокации, если печень быстро удаляется для предотвращения гипоксии индуцированного повреждения. - Дезинфекция поверхностей кожи на мышах путем смачивания с 70% этанола раствора. Безопасные мыши на спине со всеми конечностями прижаты к рассекающей доске.
- Сделайте вертикальный разрез средней линии в кожу от основания брюшной полости до чуть выше диафрагмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрезы к конечностям сделаны для облегчения опрокидкления кожи. - Потяните кожу обратно, разрезая любые соединительные ткани между кожей и брюшной полости. Предотвратить волосы от передачи в брюшную полость как можно больше. Прикрепите или зажим кожи от брюшной полости.
- Используя чистые щипцы и ножницы, откройте брюшную полость и нижнюю грудную полость.
- Удаление печени быстро, не повреждая доли
- Используя тупые инструменты (например, плоские щипцы квадратного верхука), направляя верхние доли печени вниз к животу. Вырезать соединительной ткани, окружающие верхние доли печени с помощью ножниц.
- Руководство печени долей вверх к диафрагме. Держите центральный сосудистый пучок печени с помощью щипц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не повлияет на процедуру, если центральный сосудистый пучок поврежден. - Вытяните центральный сосудистый пучок от мыши и вырезать оставшуюся соединительную ткань, кровеносные сосуды и т.д., чтобы удалить печень. Позаботьтесь о том, чтобы 1) повредить доли печени и 2) нарезать желудочно-кишечного тракта, так как это может загрязнять печень микроорганизмами.
- Поместите удаленную печень в стерильный 10 см ткани культуры блюдо наполовину заполнены ледяной Кребс-Хенселейт буферный раствор. Используя тупой инструмент для руководства долей, вырезать центр печени, чтобы разделить его на отдельные доли.
- Выберите одну доли печени (использовать самый большой первый), и поместите его плоской стороной вниз на новый стерильный 10 см блюдо. Храните все другие доли печени в блюде буферного раствора Кребс-Хенселейт, хранящегося на льду для последующего использования.
- Обрезать около 10% материала от самого высокого края доли печени, лежа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка имеет важное значение, так как этот край ткани свяжется с резкой лезвие в первую очередь; Таким образом, край ткани, который является относительно перпендикулярно резке лезвие предотвратит сжатие тканей, которые могут произойти из-за мелких углов в необрезанных долей печени. - Обрезать три другие края ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это удаляет некоторые из волокнистой капсулы Глиссона и сделает разделение ткани ломтиками легче. - Установка доли печени на держатель образца
- Поместите тонкий слой клея цианоакрилат (суперклей или медицинского/ ветеринарного класса cyanoacrylate клей) на образец держателя к передней, размером немного больше, чем обрезанная доли печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клей цианоакрилат не содержит добавок, не связанных с цианоакрилатом. - Аккуратно подобрать доли печени с стерильными щипцы с помощью угла от передний край, а затем погладить сухой любой остаточный буфер с плоской стороны доли печени с использованием стерильного абсорбцие.
- Поместите большую плоскую сторону доли печени на цианоакрилат клея патч с наибольшим краем, обращенным к передней. Позвольте ему вылечить в воздухе в течение 1'2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Cyanoacrylate клеи вылечить быстро (2 мин) в ответ на остаточной влаги и тканей белков, и они будут твердо прикрепить ткани к образцу держателя.
- Поместите тонкий слой клея цианоакрилат (суперклей или медицинского/ ветеринарного класса cyanoacrylate клей) на образец держателя к передней, размером немного больше, чем обрезанная доли печени.
3. Производство ломтиков печени
- Поместите держатель образца с прикрепленной долей печени в буферный лоток вибратом. Убедитесь, что доли печени полностью покрыты буфером.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости пополнить уровень ледяного буферного решения Krebs-Henseleit. Если уровень буфера заслоняет процесс резки, увеличьте или уменьшите уровень. - Установите скорость резки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребоваться эмпирически определяется в зависимости от модели вибратом и характеристик лезвия. В качестве стартового ориентира используйте скорость 57 Гц/3420 об/мин. Скорость вибратомможноет можно измерить с помощью приложения для анализаля аудиоспектра на смартфоне. - Опустите резку, пока он не расположен чуть выше доли печени, используя высотный циферблат. Выполнить вибрирующие резки руку над образцом.
- Вернуть лезвие обратно, используя рукоятку коленчатого рукоятки в обратном направлении. Активируйте вибрации, возвращая лезвие. После того, как лезвие вернулось и не находится выше образца, опустите высоту лезвия на 250 мкм.
- Повторите процесс резки до тех пор, пока верхняя часть ткани не будет удалена. Откажитесь от первого одного или двух ломтиков, так как они будут содержать капсулу Глиссона и, следовательно, не содержат много функциональной ткани печени по сравнению с другими ломтиками.
- Чтобы сократить ломтики печени, медленно заранее вибрирующих лезвие в ткани, повернув ручку. Используйте небольшую кисть (дезинфицированную 70% раствором этанола), чтобы аккуратно направлять ткани во время процесса резки.
- Используйте кисть, чтобы поднять нарезанные ломтики ткани и поместить нарезку ткани в стерильную трубку ледяного буфера Кребс-Хенселейт. Когда он не используется, держите эту трубку на льду между ломтиками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, ткань разрывает во время процесса резки, но для большинства целей ткани по-прежнему можно поть. - Повторите процесс резки, пока основание доли печени не будет достигнуто. Откажитесь от любых ломтиков печени, которые имеют видимые вылечить клей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вылеченный клей виден в виде белых областей на срезах ткани. Типичная доли печени будет иметь только использовать толщину около 2 мм. Таким образом, только около восьми 250 мкм ломтиками печени производятся из каждой доли. - Вырезать кусочки ткани, пока вблизи cyanoacrylate клей. Не нарезать клей.
- Повторите весь процесс с другими долей печени, пока необходимое количество ломтиков ткани не будет получено.
- Для очистки вылеченного клея цианоакрилата и ткани от держателя образца, либо используйте лезвие, чтобы соскребать вылеченный клей /ткань смеси, или смягчить и очистить смесь с ацетоном или диметил сульфоксид.
4. Культура тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы культуры ткани должны быть выполнены в стерильных ламинарных капот потока.
- В ламинарной капоте культуры тканей, пипетке 1 мл среды Уильяма E, содержащей 2,0 г/л глюкозы, 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 2 мМ L-глютамин дополнение, 100 U/mL пенициллин, и 100 мкг /мл стрептомицина в 12 хорошо ткани культуры пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие антибиотики и противогрибковые агенты также могут быть добавлены. Некоторые исследования использовали добавки в среде инкубации тканей (т.е. дексаметазон и инсулин10),но они могут мешать сигнализации клеток. - Поместите трубку, содержащую кусочки печени из льда, в капюшон культуры тканей. Чтобы удалить кусочки ткани, аккуратно закружить смесь и осторожно наконечник в стерильные 10 см блюдо во время закрученного.
- Используя стерильные остроточечные щипцы и скальпель, разрежьте кусочки ткани примерно однородными размерами (например, 15 мм2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для обеспечения согласованной площади поверхности. Потому что доли печени мыши значительно отличаются по размеру и некоторые части ткани будет рвать, это будет производить ряд PCLS с различными участками поверхности. Окончательные размеры площади поверхности PCLS зависят от того, сколько материала необходимо в последующих приложениях анализа и сколько репликатов необходимо. Резка больших PCLS на более мелкие несколько частей одного и того же приблизительного размера врожденно позволит увеличить количество экспериментальных репликаток. - Используя стерильные щипцы или небольшую кисть, перенесите нарезанные кусочки ткани в колодцы 12 хорошо пластины, содержащей 1 мл средней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы подтвердить консистенцию толщины и формы ломтиков ткани. Разделы, которые темнее, чем в среднем предложить толщину ткани больше и должны быть отброшены. Более легкие ломтики предполагают наличие вылеченного клея цианоакрилата и должны быть отброшены. - Инкубировать ломтики печени при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 при 95% влажности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие группы использовали методы для повышения доставки кислорода к PCLS, которые, как представляется, продлить время выживания тканей6,10,11,12,13 (см. раздел обсуждения). - На следующий день измените среду культуры с помощью ручного пипетки (а не всасывания), чтобы предотвратить потерю ткани из-за ошибок всасывания. Впоследствии, изменение среды на PCLS ежедневно. PCLS теперь готовы к экспериментальному использованию.
5. Пример применения PCLS
- На 16 h пост-поколения, лечить PCLS с тремя различными желчных кислот: гликохоловая кислота (GCA), таурочохоловая кислота (TCA), и холовая кислота (CA) (как соли натрия, все в концентрации 150 мкм) в течение 2 дней.
- После 2 дней лечения желчных кислот, экстракт мРНК путем размещения ломтиков ткани в ледяной РНК-лизбуфер и быстро гомогенизации с помощью бисера гомогенизатор(Таблица материалов).
- Очистите РНК с помощью комплекта изоляции РНК(Таблица материалов)и создайте кДНК из очищенной РНК.
- Выполните количественную реакцию цепи полимеразы (Таблица материалов) с помощью конкретных грунтовок (Таблица 1) на cDNA для изучения экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для определения жизнеспособности клеток PCLS с течением времени измерялись уровни аТС тканей. Уровни АТС, как правило, пропорциональны жизнеспособности. PCLS (около 15 мм2 в области) были культивированы в нормальном Уильяма E среде с 10% FBS, то в определенные точки времени, печени ломтики были удалены из культуры тканей и однородные как АТФ и белка (для нормализации) концентрации (Таблица материалов) измеряется(Рисунок 1A). Для биохимических анализов, как это, нормализация имеет важное значение, так как нарезанные ломтики печени не обязательно идентичны по размерам. Уровни АТФ (относительно белка) были подавлены сразу после изоляции и после 1 ч(рисунок 1А),предлагая краткосрочный метаболический стресс от охлаждения и резки процедур. Тем не менее, уровни АТФ восстановились на 3 ч. Уровни АТФ оставались повышенными на уровне до 5 дней культуры тканей, что свидетельствует об отсутствии значительного снижения жизнеспособности. Гематоксилин и эозин (Н И Е) окрашивание ломтиков печени показали, что ограниченный некроз тканей (характеризуется ядерным плеоморфизмом) произошел в культуре примерно со 2 и 3 дней. Уровни некроза тканей прогрессировали до тяжелой к 5-му дню(рисунок 1В). Учитывая эти морфологические данные, взятые вместе с результатами АТС, рекомендуется использовать эту экспериментальную модель тканей на срок до 3 дней.
PCLS также отображается увеличение накопления коллагена на более поздних временных точках культуры, как показано путем утолщения Picro-sirius красно-окрашенных коллагеновых волокон в день 5(Рисунок 2). Это утолщение коллагеновых волокон свидетельствует о том, что спонтанные фиброгенные процессы активны в PCLS, полученных с помощью этого метода. Этот процесс представляется независимым от методологии изоляции PCLS с утолщением коллагеновых волокон6 и профиброгенной экспрессии генов14, происходящих как от вибратом, так и от срезов тканей Крумдьека, соответственно, с течением времени. Развитие этих спонтанных фиброгенных процессов необходимо принимать во внимание при интерпретации биологии PCLS, особенно с экспериментами, связанными с фиброзными процессами.
Ранее мы показали значительную индукцию холангиоцита конкретных генов connexin 43 (Cx43) и секреция глутамил транспептидаза (Ggt1) белка TCA в PCLS9. Выражение холангиоцитов-специфических генов по отношению к управлению домашним хозяйством (глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназыигипоксанин фосфорибозилтрансферазы 1 -Hprt1)в PCLS, обработанных с Помощью TCA, GCA, или CA, были рассмотрены qPCR с использованием конкретных грунтовок. В соответствии с предыдущим докладом, значительная индукция в экспрессии холангиоцита конкретных генов цитокератин 19 (CK19; Рисунок 3А)и connexin 43 (Cx43; Рисунок 3B) наблюдались как GCA, так и TCA. Выражение Ggt1 было увеличено обеими желчными кислотами; хотя, это не достигло статистической значимости, возможно, из-за экспериментальныхизменений (рисунок 3C). Выражение CA не было затронуто любой желчной кислоты. Индукция холангиоцит-специфических генов предполагает, что GCA также может быть вовлечен в холестатическую травму печени, как сообщалось ранее для TCA8,9.
Рисунок 1: Ткань жизнеспособность точно вырезанных ломтиков печени (PCLS). (A) Уровни АТФ и белка в PCLS были измерены немедленно (Т No 0) и на 1 ч, 3 ч, 6 ч и 1'5 дней после изоляции. (B) Для изучения морфологии клеток, PCLS были исправлены, парафин-встроенный, секционные, и окрашенные с Н И Е сразу (день 0) и на 1, 2, и 5 дней после изоляции. Тест Kruskal-Wallis с тестом данна с несколькими сравнениями был выполнен по отношению к T Q 0. Все данные представлены в виде среднего значения SEM (n no 2'3 мышей) с qp qlt; 0,05. Шкала баров представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оценка осаждения коллагена в ПЦЛС. PCLS были исправлены, парафина встроенных, секционированных и окрашенных с Picro-Sirius Красный визуализировать коллагеновых волокон в дни 0, 1, 2 и 5 после изоляции. Шкала баров представляют 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Желчные кислоты вызывают экспрессию генов, специфичных для холангиоцитов. На 16 ч пост-изоляции, средний на PCLS был изменен, и новая среда была добавлена вместе с 150 ММ гликохолик (GCA), таурочич (TCA), или хольевые (CA) кислоты (соли натрия). PCLS были собраны после 2 дней, и выражение цитокератин 19(CK19; A),connexin 43 (Cx43; B), и З-глутамил транспептидаза 1 (Ggt1; C) был рассмотрен относительно геометрического среднего Gapdh и Hprt1. Тест по множественным сравнениям Даннетта был выполнен по сравнению с необработанными ломтиками контрольной ткани (n No 15). Все данные представлены в виде среднего значения SEM (n - 4 мыши, тройные ломтики; злитроподовые ломтики; 0,05, злипп; 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: праймеры qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол демонстрирует применение изоляции murine PCLS и культуры тканей, а процедуры предназначены для оценки жизнеспособности и полезности, а также для изучения воздействия экзогенных посредников печенской патобиологии с использованием биохимических анализов, гистологии и qPCR. Экспериментальная полезность культуры ткани PCLS у грызунов и людей была продемонстрирована в широком диапазоне применений, включая экспериментальные исследования в микроРНК15/РНК9/белковая экспрессия16, метаболизм17, динамика вирусной инфекции10,18, инфекция сигнализации19, вторжение опухоли12, токсичность исследований4,13,15,20, повреждение ДНК исследования21, клеточной биологии14, и секреции исследований9.
В то время как уровни АТФ указывают на жизнеспособность клеток в PCLS до 5 дней в культуре, Н И E окрашивания предположить, что тяжелый некроз происходит на 5 дней в культуре. Основным фактором, который, как представляется, ограничить жизнеспособность PCLS является наличие кислорода6,11. Несколько исследований включали повышение доступности кислорода и, следовательно, увеличение времени жизнеспособности PCLS в культуре тканей. Методы, используемые для увеличения доступности кислорода включают инкубацию тканей в богатых кислородом атмосфер10,11, использование переносица кислорода перфузии перфтородекалина12, встряхивая / прокатки культуры во время инкубации6,10,13, и ткани культуры пластин, предназначенных для максимизации оксигенации6.
Недавно, инновационный воздух-жидкий интерфейс ткани культуры система была описана с функциональной полезности заявил на более чем 7 дней в культуре14. Этот протокол использует окружающий атмосферный кислород в нормальном инкубаторе культуры тканей. Метод позволяет PCLS быть доступными для лабораторий, которые не имеют узкоспециализированного, специального оборудования для безопасного повышения доставки кислорода. Однако, если такие методы для повышения доставки кислорода доступны, они могут улучшить долгосрочную жизнеспособность PCLS в культуре.
Накопление коллагена в PCLS после 3-го дня в культуре свидетельствует о том, что спонтанные фиброгенные процессы активны в рамках этой модели. Спонтанный фиброз также наблюдался ранее в PCLS6,14,22,23,24 и, возможно, опосредовано повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPs) освобождены процесса резки или некроза ткани. DAMPs выступать в качестве сигнальных молекул, которые впоследствии активировать про-фиброзных сигнальных путей25,26. Кроме того, спонтанный фиброз в PCLS может быть опосредован хемокинами, высвобожденным из активации клеток стеллата и/или клеток Купфера (т.е. трансформирующим фактор роста бета-версии (TGF-) ). В этом контексте недавняя статья Bigaeva et al.24 предполагает, что спонтанный фиброз в PCLS частично опосредован TGF-я сигнализации, как инкубация PCLS с ингибитором TGF-я Galunisertib ингибируется экспрессия генов изменения, связанные с спонтанным фиброзом печеночного. Другим возможным механизмом является то, что процедура нарезки первоначально индуцирует пролиферацию клеток сигнальных путей и вступления гепатоцитов в клеточный цикл; однако, этот механизм терпит неудачу и приводит к аресту клеточного цикла в середине фазы27G1. Сотовый цикл арест связан с печеночным фиброзом, а не печеночной регенерации28.
В репрезентативной экспериментальной процедуре, PCLS обрабатываются с тремя различными желчных кислот (GCA, TCA, и CA) в течение 2 дней, чтобы имитировать холестатическую травму печени. Две желчные кислоты (GCA и TCA) вызывают значительное выражение CK19 и Cx43,которые являются генами, связанными с функцией холангиоцита. Это предполагает расширение или дифференциацию клеток в сторону линии холангиоцитов в PCLS, обработанных этими желчными кислотами. Это согласуется с нашей предыдущей работой, показывающей аналогичный эффект с использованием TCA9 на PCLS. Кроме того, это также согласуется с in vivo наблюдений, которые показывают, кормления таурохолата для крыс увеличивает холангиоцита номера29. Обработка ломтиков ткани печенки с желчных кислот имитирует печеночный холестаз, и он предположил, что увеличение экспрессии генов, связанных с функцией холангиоцита является попыткой ткани печени для создания дополнительных желчных протоков для увеличения секреции желчи. Учитывая специфическую индукцию этих генов производится конъюгированных желчных кислот (GCA и TCA), но не неконъюгированных CA, есть подозрение, что эти эффекты опосредованы сфингозин-1-фосфатный рецептор 2, рецептор поверхности клетки с преференциальной активации конъюгированных желчных кислот30.
Одним из ключевых ограничений применения PCLS является индивидуальная изменчивость репликации. Поскольку печень не является однородной и есть изменчивость в производстве, печени ломтики, как правило, имеют большие биологические изменения, чем клеточная культура экспериментов. В экспериментальных исследованиях с небольшимколичеством переменных, таких как репрезентативная процедура, продемонстрированные выше, это преодолевается с помощью увеличения числа репликаций. Тем не менее, это может стать проблемой для более крупных исследований скрининга. Таким образом, описанный протокол является простым и надежным методом для изучения аспектов печеночной патобиологии ex vivo, требующей небольшого специализированного оборудования, за исключением вибратом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана научно-исследовательскими грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (Grant No. APP1048740 и APP1142394 в Г.А.Р.; APP1160323 в J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Грант А. Рамм поддерживается старшим научным сотрудником от NHMRC Австралии (Грант No. APP1061332). Мануэля Фернандеса-Рохо поддержала программа TALENTO Мадрида, Испания (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
