Summary
מוצג כאן היא גישה זרחנית, כלומר לעצור וללכת מיצוי קצה מבוסס פוספופרוטומית, אשר מספק תפוקה גבוהה כיסוי עמוק של ערבידופסיס phosphoproteome. גישה זו מתווה את הסקירה של איתות מתח אוסמוטי ב Arabidopsis.
Abstract
זרחון חלבונים חיוני לוויסות פעילות אנזימים וביטוי גנים במצב אוסמוטי. ספקטרומטריית מסה (MS) מבוססת פוספופרוטאימיקה שינתה את הדרך לחקר התמרת אותות הצמח. עם זאת, הדרישה של הרבה חומרים התחלתיים וזמן מדידה ממושך של טרשת נפוצה כדי להשיג את עומק הכיסוי הייתה הגורם המגביל למחקר התפוקה הגבוהה של שינויים פוספופרוטאיים גלובליים בצמחים. כדי לשפר את הרגישות והתפוקה של phosphoproteomics הצמח, פיתחנו לעצור וללכת מיצוי (שלב) טיפ מבוסס זרחן גישה בשילוב עם תג מסה טנדם (TMT) תיוג לניתוח מהיר ומקיף של הפרעה זרחון הצמח בתגובה ללחץ אוסמוטי. מינוף הפשטות והתפוקה הגבוהה של טכניקת קצה הבמה, ההליך כולו לוקח כשעה באמצעות שני טיפים כדי לסיים העשרת פוסופפטיד, שברים, וצעדי ניקוי מדגם, מה שמרמז על קל לשימוש ויעילות גבוהה של הגישה. גישה זו לא רק מספקת ניתוח מעמיק של פוספופרוטאימיקה של הצמח (> 11,000 זיהוי פוסופפטיד) אלא גם מדגימה את יעילות ההפרדה המעולה (חפיפה של 5%) בין שברים סמוכים. כמו כן, מולטיפלקסים הושגו באמצעות תיוג TMT כדי לכמת את השינויים הפוספופרוטאיים של צמחים מוטנטים מסוג בר ו snrk2 decuple. גישה זו שימשה בהצלחה כדי לחשוף את אירועי זרחון של קינאזים דמויי רף בתגובה ללחץ אוסמוטי, אשר שופך אור על ההבנה של איתות אוסמוטי מוקדם בצמחים יבשתיים.
Introduction
מליחות גבוהה, טמפרטורה נמוכה ובצורת גורמים ללחצים אוסמוטיים, המהווים גורם סביבתי מרכזי המשפיע על תפוקת הצמח1,2. זרחון חלבונים הוא אחד השינויים המשמעותיים ביותר לאחר התרגום המתווכים את תפיסת האות והתמרה בתגובת הצמח ללחץ אוסמוטי3,4,5. קינאז חלבון הקשורים SNF1 2s (SnRK2s) מעורבים הלחץ אוסמוטי איתות6. תשעה מתוך עשרה בני משפחת SnRK2 מראים הפעלה משמעותית בתגובה ללחץ אוסמוטי7,8. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)מוטציות בכל עשר SnRK2 הציג רגישות יתר ללחץ אוסמוטי. ב מוטציה snrk2-dec, הצטברות אוסמוטית הנגרמת על ידי מתח של אינוזיטול 1,4,5-trisphosphate (IP3),חומצה אבסיסית (ABA) ביוסינתזה, ביטויים גנים מופחתים מאוד, המדגיש את התפקיד החיוני של SnRK2s בתגובות מתח אוסמוטי6. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד SnRK2s kinases לווסת תהליכים ביולוגיים אלה. פרופיל השינויים הפוספופרוטאיים בתגובה ללחץ אוסמוטי הוא דרך יעילה לגשר על פער זה ולתוות את מנגנוני ההגנה המופעלים על ידי מתח אוסמוטי בצמחים.
ספקטרומטריית מסה (MS) היא טכניקה רבת עוצמה למיפוי זרחן צמחי9. אפיון של זרחן הצמח, עם זאת, להישאר אתגר בשל הטווח הדינמי של פרוטאום הצמח ואת המורכבות של הצמח lysate4. כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו זרימת עבודה פוספופרוטאומית צמחית אוניברסלית, המבטלת הפרעות לא רצויות כגון מפיגמנטים פוטוסינתטיים ומטבוליטים משניים, ומאפשרת כיסוי עמוק של זרחן צמחי10. מספר שיטות העשרה זרחן כגון כרומטוגרפיה יון מתכת משותק (IMAC) ו כרומטוגרפיה תחמוצת מתכת (MOC) פותחו להעשרת פוסופפטידים לפני ניתוח MS11,12,13,14,15,16. חומצי שאינו פוסופפטידים שיתוף טיהור עם פוסופפטידים הם ההפרעות העיקריות לגילוי פוסופפטיד. בעבר, תקננו את ערך החומציות החומצות האורגניות ואת ריכוז החומצה האורגנית של מאגר הטעינה של IMAC כדי למנוע את האיגוד של שאינם פוסופפטידים, כדי להשיג יותר מ -90% ספציפיות העשרה לעקוף את שלב טרום השבר11.
אובדן מדגם בתהליך רב-שלבי של העשרת פוסופפטיד ושברים מקשה על הרגישות של זיהוי פוסופפטיד ועומק הכיסוי הזרחני. טיפים לעצירה ומיצוי (טיפים לשלב) הם טיפים פיפטה המכילים דיסקים קטנים כדי לכסות את סוף הקצה, אשר ניתן לשלב עם כרומטוגרפיה עבור שבר פפטיד וניקוי17. אובדן מדגם במהלך הליך קצה הבמה ניתן למזער על ידי הימנעות העברה מדגם בין הצינורות. יישמנו בהצלחה טיפ שלב Ga3 +-IMAC ו Fe3 +-IMAC להפריד פפטידים מרובים פוספורילאטים בשפע נמוך מן פפטידים phosphorylated סינגלינג, אשר שיפר את עומק phosphoproteome אנושי15. בנוסף, השימוש ב- pH גבוה הפוך שלב (Hp-RP) שלב עצה הוכיחה את הכיסוי הרחב יותר של פרוטאום קרום אנושי לעומת זה של חילופי קטיון חזק (SCX) ו חזק חילופי אניון (SAX) כרומטוגרפיה18. לכן, שילוב IMAC וטכניקות קצה שלב Hp-RP יכול להגדיל את כיסוי phosphoproteome הצמח עם פשטות, ספציפיות גבוהה, תפוקה גבוהה. הוכחנו כי אסטרטגיה זו זיהתה יותר מ -20,000 אתרי זרחן משתילי ערבידופסיס, המייצגים עומק משופר של זרחן צמחי19.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול פוספופרוטאיומי מבוסס קצה שלב עבור אפיון זרחני ב Arabidopsis. זרימת עבודה זו הוחלה כדי לחקור את ההפרעה הזרחנית של שתילים מוטנטים מסוג בר ו snrk2-dec בתגובה ללחץ אוסמוטי. הניתוח הזרחני חשף את אתרי הזרחן מעורבים בהפעלת קינאז ואיתות מתח אוסמוטי מוקדם. ניתוח השוואתי של נתוני זרחן מוטנטים מסוג Wild ו-snrk2-dec הוביל לגילוי מפל קינאז דמוי רף (RAF)-SnRK2 קינאז, הממלא תפקיד מפתח באיתות מתח אוסמור בצמחים גבוהים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה לדוגמה
- לקצור את הבקרה ואת הלחץ מטופלים שתילים (1 גרם) בנייר אלומיניום פלאש להקפיא את הדגימות חנקן נוזלי.
הערה: ריכוז חלבון גבוה יותר נצפה בדרך כלל משתילים בני שבועיים מזה של צמחים בוגרים. גרם אחד של שתילים מייצר כ 10 מ"ג של חלבון ליזוי, וזה מספיק לניתוח MS. כל שלבי הצנטריפוגה מתרחשים במהירות של 16,000 x g בשלב 1. - טוחנים שתילים קפואים לאבקה דקה בעזרת מרגמה ועלי מלא בחנקן נוזלי.
- הוסף 1 מ"ל של מאגר תמוגה ((6 M guanidine-HCl ב 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) עם 10 מ"מ טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP), 40 מ"מ 2-כלורואקטמיד (CAA), מעכב פרוטאז וקוקטיילים מעכבי פוספטאז) למרגמה ומערבבים בעזרת עלה.
- מעבירים את הצמח ליזלת לצינור 1.5 מ"ל וחום ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- מניחים את הצינור על קרח במשך 10 דקות. Sonicate הצינור על הקרח במשך 10 s, להשהות במשך 10 s, ולחזור שלוש פעמים.
- צנטריפוגה הצינור במשך 20 דקות aliquot 150 μL של צמח lysate לתוך צינור 1.5 מ"ל.
- הוסף 600 μL של 100% מתנול לתוך הצינור. וורטקס ותסובב את הצינור.
- הוסף 150 μL של 100% כלורופורם לתוך הצינור. וורטקס ותסובב את הצינור.
- הוסף 450 μL של ddH2O לתוך הצינור. וורטקס וצנטריפוגה הצינור במשך 3 דקות.
- השלך את שכבת המים העליונה. הוסף 600 μL של 100% מתנול לתוך הצינור. צנטריפוגה הצינור במשך 3 דקות ולאחר מכן להשליך את הפתרון.
- לשטוף כדורי חלבון עם 600 μL של 100% מתנול. להשליך את הפתרון ואת האוויר לייבש את גלולת החלבון.
- כדורי חלבון resuspend לתוך 600 μL של מאגר עיכול (12 מ"מ נתרן deoxycholate (SDC)/12 mM נתרן לאורויל סרקוסינאט (SLS) ב 100 מ"מ Tris-HCl, pH 8.5). Sonicate הצינור עד ההשעיה היא הומוגנית.
- למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת BCA ולהתאים את הריכוז ל 4 מיקרוגרם / μL עם מאגר העיכול. להעביר 100 μL של lysate (400 חלבונים מיקרוגרם) לתוך צינור חדש.
- הוסף 292 μL של 50 מ"מ טריאתילמוניום ביקרבונט (TEAB) ו 8 μL של Lys-C (2.5 יחידה / מ"ל) לצינור. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- הוסף 100 μL של 50 מ"מ TEAB עם 8 מיקרוגרם טריפסין לצינור. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס עבור 12 שעות.
- הוסף 25 μL של 10% חומצה trifluoroacetic (TFA) לצינור. וורטקס וצנטריפוגה הצינור במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- העבר את העל-טבעי לעמודת התפלה מותנית להתפלה. יבש את ההארה באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום.
הערה: הפעל את שרף עם 1 מ"ל של מתנול ואחריו 1 מ"ל של 0.1% TFA ב 80% אצטוניטריל (ACN). לשטוף את הממס האורגני עם לפחות 3 מ"ל של 0.1% TFA ב 5% ACN. טען דגימות פפטיד חומציות שהוכנו בשלב 1.16 לתוך העמודה ולאחר מכן לשטוף את העמודה עם לפחות 3 מ"ל של 0.1% TFA ב 5% ACN. ייתכן שיהיה צורך בשטיפות נוספות לדגימות עם ריכוזי מלח גבוהים. יש לטבול את הפוסופפטידים ב-1 מ"ל של 0.1% TFA ב-80% ACN.
2. תיוג תג מסה טנדם (TMT)
- Resuspend פפטידים מיובשים לתוך 100 μL של 200 מ"מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 8.5.
- להמיס את מגיב TMT של כל ערוץ (0.8 מ"ג) ב 40 μL של ACN נטול מים. וורטקס הצינור מגיב TMT במשך 5 דקות ולסובב אותו.
- להעביר 40 μL של TMT לצינור מדגם דגירה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
הערה: בניסוי זה, ערוץ 126 כדי 128 תויגו עם שלושה העתקים ביולוגיים של צמחים ללא טיפול מניטול, ואת הערוץ 129 כדי 131 תויגו עם שלושה משכפל ביולוגי של צמחים עם טיפול מניטול. - הוסף 8 μL של 5% הידרוקסילאמין ודגרת במשך 15 דקות.
- מערבבים 6 דגימות בצינור 5 מ"ל ומוסיפים 14 μL של 10% TFA.
- הוסף 3,876 μL של 0.1% TFA לצינור. וורטקס ותסתובב.
- העבר את הפתרון לעמודת desalting מותנית עבור desalting. יבש את ההתפוגגות באמצעות מאייד.
3. הכנת קצה שלב IMAC
- השתמש במחט קהה 16 G כדי לחדור דיסק פריט פוליפרופילן.
הערה: החזק את החותך בניצב על פני השטח של הדיסק וגלגל את החותך כמה פעמים כדי לוודא שהדיסק נכרת לחלוטין. מניחים את הדיסק בצלחת פטרי לאחסון. מניחים את המחט לתוך קצה פיפטה 200 μL ולדחוף את הפריט לתוך הקצה באמצעות בוכנה. - לחץ על הפריט בעדינות לתוך הקצה באמצעות בוכנה כדי לכסות את קצה הקצה.
- מניחים את הדיסק פריט טיפים עם אותו לחץ, אשר מספק רבייה טובה יותר. השחזור של ייצור טיפים שלב חשוב עבור לחץ גב מתמיד, אשר משפיע על התזמון של שלבי צנטריפוגה ושחזור בין משכפלים טכניים.
- אם עצות הבמה מראות לחץ גב גבוה במהלך שלב המיזוג, השלך את העצות כדי למנוע סתימת טיפים פוטנציאלית בעת טעינת דגימות. ייתכן שהדיסק נלחץ חזק מדי למקומו.
- הפוך עמוד ספין Ni-NTA ומניחים על צינור 1.5 מ"ל.
- השתמש בוכנה ללחוץ על פריט של חרוזי Ni-NTA בעדינות ולדחוף את החרוזים לתוך הצינור.
הערה: הקפד לדחוף את הפריט בעדינות כדי למנוע אובדן חרוזים פוטנציאלי או ספיחה בעמודת הסיבוב.
4. הכנת קצה שלב Hp-RP
- הכן את קצה שלב Hp-RP כמתואר עבור קצה שלב IMAC באמצעות דיסק C8.
הערה: אל תפעיל כוח גדול על הדיסק מכיוון שהוא עלול לגרום פריט ארוז בצפיפות ולהגדיל את הלחץ האחורי של קצה הבמה. כל שלבי הצנטריפוגה מתרחשים במהירות של 1,000 x גרם למשך 5 דקות בשלב 4. - להשעות 1 מ"ג של חרוזי C18 ב 100 μL 100% מתנול ולהעביר את פתרון החרוזים דרך הקצה.
- הוסף 20 μL של חיץ 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) לקצה הבמה ולהעביר מאגר 8 דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
- הוסף 20 μL של חוצץ A (200 mM NH4HCO2)לקצה הבמה ולהעביר מאגר A דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
הערה: איזון הצנטריפוגה במהלך השימוש וודא שקצה שלב Hp-RP אינו מיובש לחלוטין.
5. הכנת מתאם ספין
- השתמש בפינצטה חדה כדי לנקב חור במרכז המכסה של צינור 1.5 מ"ל.
- הכנס את קצה הבמה של IMAC או את קצה השלב של Hp-RP לתוך החור של מתאם הסיבוב.
הערה: ודא שקצה הבמה אינו קרוב לתחתית מתאם הסיבוב.
6. העשרת פוסופפטיד באמצעות קצה שלב IMAC
- להשעות את 10 חרוזי Ni-NTA מ"ג עם 400 μL של מאגר טעינה (6% חומצה אצטית (AA), pH 3.0) ולטעון את כל פתרון החרוזים לכל קצה. להעביר את הפתרון דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
הערה: כל שלבי הצנטריפוגה מתרחשים ב- 200 x g למשך 3 דקות בשלב 6 מלבד שלב 6.8. - טען 100 μL של 50 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) כדי להסיר את יוני ניקל מקצה הבמה IMAC ולהעביר את הפתרון דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
- טען 100 μL של מאגר טעינה לקצה הבמה והעבר את הפתרון דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
- טען 100 μL של 50 mM FeCl3 ב 6% AA לקצה הבמה ולהעביר את הפתרון דרך הקצה על ידי צנטריפוגה. Fe3+ יונים יהיה chelate כדי קצה הבמה IMAC.
- טען 100 μL של מאגר טעינה כדי להתנות את קצה הבמה ולהעביר את הפתרון דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
- לטעון 100 μL של מאגר טעינה עם פפטידים מדגם מוכן בשלב 2.7 לקצה הבמה ולהעביר את הפתרון דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
הערה: קח צינור חדש כמתאם ספין כדי לאסוף את הזרימה דרך המדגם ולאחסן את הזרימה דרך במקפיא לניתוח עתידי. - טען 100 μL של חוצץ כביסה (4.5% AA ו- 25% ACN) לקצה הבמה והעבר את הפתרון דרך הקצה על ידי צנטריפוגה.
- בצע את הכביסה השניה עם מאגר טעינה. טען 100 μL של מאגר טעינה לקצה הבמה והעבר את הפתרון דרך הקצה באמצעות צנטריפוגה 1000 × g במשך 3 דקות.
הערה: ודא שמאגר הכביסה מוחלף על-ידי טעינת מאגר בקצה הבמה כדי למנוע אובדן פוסופפטידים במהלך שלב ההתרוממות. השווה את קצה שלב IMAC לפני התרוממות רוח פוסופפטיד כדי להבטיח את הריכוז של ACN הוא מתחת 5%. - חתוך את קצה הבמה של IMAC מלפנים במספריים והנח את קצה הבמה של IMAC החתוך בתוך קצה Hp-RP. ודא ששתי שכבות קצות הבמה אינן נוגעות במכסה הצנטריפוגה.
7. שבר פוסופפטיד באמצעות קצה שלב Hp-RP C18
- הוסף 100 μL של מאגר elution (200 mM אמוניום פוספט (NH4H2PO4))לקצה שלב IMAC גזוז ולהעביר את הפתרון דרך שתי שכבות של טיפים שלב על ידי צנטריפוגה.
הערה: אם הפתרון אינו עובר דרך קצה הבמה, להגדיל את המהירות של ספין למטה. כל שלבי הצנטריפוגה מתרחשים במהירות של 1,000 x גרם למשך 5 דקות בשלב 7. כל מאגרי Hp-RP מפורטים בטבלה 1. - השלך את קצה השלב של IMAC באמצעות פינצטה והוסף 20 μL של Buffer A לקצה השלב של Hp-RP והעבר את המאגר דרך הקצה על-ידי צנטריפוגה.
הערה: ודא שכל מאגר ההקצה עובר דרך קצה השלב של IMAC לפני ביטולו. - הוסף 20 μL של חוצץ 1 כדי elute שבר 1 ולאסוף את eluate בצינור חדש על ידי צנטריפוגה. חזור על התהליך עם Buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7, ו 8 כדי לאסוף כל שבר בצינור חדש. יבש את ההמרה הסופית של כל שבר באמצעות רכז ואקום.
הערה: הכן מאגרי שברים טריים. קח 8 צינורות חדשים כמתאם הסיבוב של כל שבר. לאסוף את ההתרוממות של כל שבר במתאם ספין שונה. פוסופפטידים אינם יציבים בתנאים בסיסיים, ולכן יבש את eluates על ידי רכז או חומצי על ידי 10% TFA מיד.
8. ניתוח וניתוח נתונים של LC-MS/MS
- הוסף 5 μL של 0.1% חומצה פורמית (FA) ולנתח את המדגם על ידי ספקטרומטר מסה.
- הפעל מעבר צבע של 90 דקות עם 6-30% מאגר B (80% ACN ו- 0.1% FA) עבור כל שבר.
- פצל את 10 הפפטידים בעלי התווית העליונה באמצעות דיסוציאציה של אנרגיית התנגשות גבוהה (HCD). השלם חיפוש במסד נתונים כדי לזהות אתרי זרחון.
- טען את הקבצים הגולמיים לתוכנת MaxQuant, תן שם לניסויים והגדר שברים ו- PTM.
הערה: ערכת הלימוד של תוכנת MaxQuant ניתן למצוא https://www.maxquant.org/. - בחר יון כתב MS2 בסוג של הפעלת LC-MS/MS ו- 6plex TMT כתוויות איסובריות. הפוך סינון לזמין לפי פונקציית PIF והגדר את ה- PIF של min כ- 0.75.
- בחר אצטיל (חלבון N-מונח), חמצון (M), ו Phospho (STY) ללוח של שינויים משתנים. בחר קרבמידומתיל (C) כשינויים קבועים.
- הגדר מצב עיכול ספציפי, בחר טריפסין /P כאנזים עיכול, ושני מחשוף שלא נענו.
- הגדר קצב גילוי כוזב של PSM (FDR) ו- FDR של חלבונים כ- 0.01. הגדר את הציון המינימלי עבור פפטידים ששונו כ- 40.
- הוסף מסד נתונים thaliana Arabidopsis ללוח של קבצי fasta ולהפעיל חיפוש מסד נתונים.
- טען את קובץ ה- txt של אתרי Phospho (STY) לתוכנת פרסאוס בעת ביצוע החיפוש.
הערה: את ההדרכות המפורטות של תוכנת פרסאוס ניתן למצוא https://www.maxquant.org/perseus/. - סנן את אתרי הזרחון ההפוכים. סנן את אתרי הזרחן הלא מנוטרלים באמצעות הסתברות לוקליזציה של 75% כניתוק.
- השתמש בעוצמות של אתרי זרחן לניתוח סטטיסטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את הביצועים של זרימת עבודה זו, ניצלנו טיפ שלב IMAC בשילוב עם שבר קצה שלב Hp-RP כדי למדוד את השינויים הזרחניים בסוג פראי ו snrk2-dec שתילים מוטציה עם או בלי טיפול מניטול במשך 30 דקות. כל דגימה בוצעה בטריפליטים ביולוגיים, וזרימת העבודה הניסיונית מיוצגת באיור 1. הפפטידים המתעכלים (400 מיקרוגרם) של כל דגימה סומנו בערוץ TMT-6plex אחד, במאגר ומותפל. הפוסופפטידים הועשרו עוד יותר באמצעות קצה שלב IMAC, והפוסופפטידים המטוהרים נותקו לאחר מכן לשמונה שברים על ידי קצה שלב Hp-RP. כל שבר נותח על ידי ניתוח הדרגתי של LC 90 דקות. הקבצים הגולמיים חיפשו באמצעות מנוע חיפוש נגד מסד הנתונים של ערבידופסיס טליאנה.
בסך הכל זוהו 11,077 פוספוגפטידים ייחודיים המתאימים ל-3,630 פוספופרוטאינים עם 6,852 אתרי זרחן מקומיים (Class I, הסתברות לוקליזציה > 0.75), מה שמצביע על הכיסוי הרחב של זרחן ערבידופסיס. בסך הכל זוהו 8,107 ו-7,248 פוסופפטידים מסוג בר ומדגימת מוטנטים snrk2-dec, בהתאמה. זה ממחיש את היעילות של זרימת העבודה במתן כיסוי מעמיק לתיונון ההשקפה העולמית של התמרת אותות ב Arabidopsis. השווינו את מספר הפוסופפטידים שזוהו על פני 8 שברים. בשני השברים הראשונים זוהו מספר פוסופפטידים, השבר הראשון והשני. עם זאת, רוב הפוסופפטידים חולקו באופן שווה בשאר 6 השברים(איור 2A),מה שמרמז על כך שגישה זו מספקת את היכולת להפריד פוסופפטידים מורכבים מהזרחן הצמחי. כדי להדגים עוד יותר את יעילות ההפרדה של זרימת עבודה זו, הערכנו את החפיפה של פוסופפטידים בין שני שברים סמוכים (eq. F1-to-F2). פחות מ-5% פוסופפטידים חופפים בשברים הסמוכים, מה שמצביע על יעילות שבר חזקה של קצה השלב Hp-RP (איור 2B).
באמצעות הנתונים שהושגו על ידי זרימת העבודה, השווינו את הפרופילים הזרחניים של מוטנטים מסוג בר ו snrk2-dec על טיפול מניטול. בסך הכל הוגדלו 433 ו-380 אתרי זרחן לאחר טיפול מניטול במדגם מוטנטים מסוג בר ו-snrk2-dec, בהתאמה (איור 3). בין זאת, 312 פוספוסיטים הראו אינדוקציה (FDR < 0.01) בסוג פראי, אך לא בצמחים מוטנטים snrk2-dec. ניתוח ג'ין אונטולוגיה (GO) גילה כי הפונקציה של זרחון והפעלה של קינאז חלבון, ויסות של תהליך מטבולי פוספט, התמרת אותות, מועשרים באופן משמעותי בפוספוגוטאינים תלויי SnRK2. מעניין, GO מונח הקשורים להתפתחות השורש הועשר גם בקבוצה תלויה SnRK2, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ של פיגור צמיחת השורש תחת מתח אוסמוטי6. זיהינו גם 116 פוספוסיטים המווסתים על ידי טיפול מניטול הן בסוג פראי והן במוטנט snrk2-dec. פוספופרוטאינים אלה היו עצמאיים של SnRK2, או מועמדים המתווכים אוסמוטי מתח מופעל איתות לפני הפעלת SnRK2s. ראינו כי מספר RAFs קבוצת משנה B4 כגון RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050), ו RAF42 (AT3G46920), היו מוסדר באופן משמעותי על ידי מתח אוסמוטי. מחקר נוסף גילה כי KINASES חיל האוויר המלכותי מופעלים במהירות על ידי מתח אוסמוטי ונדרש עבור זרחון והפעלה של SnRK2s20.
איור 1: זרימת עבודה של שיטת פוספוטומית מבוססת קצה שלב. החלבון חולץ והתעכל משניטלנטים מוטנטים מסוג בר ו-snrk2-dec שטופלו במניטול או בלעדיו. הפפטידים המתעכלים של כל שכפול סומנו בערוץ TMT6-plex ייחודי. פוסופפטידים אוחדו ולאחר מכן הועשרו באמצעות קצה שלב IMAC. הפוסופפטידים המטוהרים הופרדו על ידי קצה שלב Hp-RP. כל שבר נותח על ידי ספקטרומטר מסה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון פוספופרוטאיומי של שתילי מוטציות מסוג בר ו-snrk2 על-ידי קצה שלב IMAC ושברון Hp-RP. (A)מספר הפוסופפטידים שזוהו לכל שבר. (B)יעילות ההפרדה של כרומטוגרפיית Hp-RP מבוססת קצה הבמה. החפיפה בין השברים הסמוכים מיוצגת על-ידי אחוז אותו פפטיד שזוהה בשברים הסמוכים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות השינויים הזרחניים בתגובה ללחץ אוסמוטי. חלקות הר געש מראות את השינוי בקיפול ה-log2 של אתרי זרחן ב- (A) סוג פראי ו -( B) שתילי מוטנטים snrk2-dec בתגובה לטיפול מניטול. העיגול השחור מייצג את אתרי הזרחון של קינאז הנגרמים על ידי מניטול. העיגול האדום מציין את אתרי הזרחון של RAFs מוסדרים בתגובה מניטול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מאגר א' | 200 mM אמוניום אסיר (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| מאגר ב' | 100% ACN. | |
| מאגר 1 | 5% מאגר B, 95% מאגר A. | |
| מאגר 2 | 8% מאגר B, 92% מאגר A. | |
| מאגר 3 | 11% מאגר B, 89% מאגר A. | |
| מאגר 4 | 14% מאגר B, 86% מאגר A. | |
| מאגר 5 | 17% מאגר B, 83% מאגר A. | |
| מאגר 6 | 20% מאגר B, 80% מאגר A. | |
| מאגר 7 | 23% מאגר B, 77% מאגר A. | |
| מאגר 8 | 80% מאגר B, 20% מאגר A. | |
טבלה 1: מאגרים עבור שברי קצה שלב Hp-RP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטווח הדינמי והמורכבות של פרוטאום צמחים ופוספופרוטום הם עדיין גורם מגביל לעומק ניתוחי הפוספופרוטומיקה. למרות היכולת של ניתוח LC-MS/MS חד פעמי לזהות 10,000 אתרי זרחון21,22, הכיסוי של זרחן הצמח כולו עדיין מוגבל. לכן, נדרשת זרימת עבודה זרחנית המספקת רגישות גבוהה ויעילות הפרדה מעולה בפרופיל התפיסה העולמית של רשתות איתות צמחים בתגובה ללחץ סביבתי. כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה מסחרי (HPLC) כרומטוגרפיה מבוססת עמודה היא שיטה נפוצה להפחתת מורכבות הפפטיד לפני ניתוח MS23,24. עם זאת, שלבי איסוף מדגם מייגעים ונפח elution גדול הם האתגרים העיקריים של שיטות מבוססות HPLC במונחים של רגישות ותפוקה. קצה שלב הוא גישה חלופית לביצוע פפטיד טרום שבר או העשרה לעבודות רגישות גבוהה ותפוקה גבוהה. זרימת עבודה פוספוטומית חדשה זו המנצלת תיוג איסוברי בשילוב עם העשרת פוסופפטיד ושבר מספק כיסוי ועומק טובים יותר של פוספופרוטומיקה צמחית על פני זרימות עבודה זרחניות אחרות25,26.
ערך ה- pH של דגימות הוא הגורם המכריע הקובע את ספציפיות ההעשרה של פוסופפטידים. ערך ה- pH עשוי להיות מושפע מהשלב הקודם של הכנת מדגם, ולכן חיוני לבדוק את ערך ה- pH לפני טעינת הדגימה. אם ה- pH מועבר, הוספת חומצה אצטית או נתרן הידרוקסידי לדגימות כדי להתאים את ה- pH ל- 3.0. אנו מבצעים פרוטוקול זה עבור התרוממות רוח בו זמנית וטעינה של פוסופפטידים על קצה שלב C18. לכן, חשוב לאזן את קצה שלב IMAC לפני elution פוסופפטיד כדי להבטיח את הריכוז של ACN הוא מתחת 5%.
מספר השברים תלוי במורכבות ובגדלים לדוגמה. בדרך כלל, 5 עד 8 שברים מספיקים כדי לספק כיסוי רחב של זיהוי פוסופפטיד בצמחים. הריכוז של ACN במאגרי שבר יכול להיות מותאם על פי הידרופוביות של דגימות. רוב הפוסופפטידים הם eluted מ C18 חרוזים באמצעות טווח של 5% עד 25% ריכוז ACN. פוסופפטידים הם בדרך כלל הידרופיליים יותר בהשוואה לפפטידים שאינם זרחניים בשל החיובים השליליים הנוספים של קבוצת הפוספט. עם זאת, תיוג ריאגנט TMT על N-terminus של פפטיד מוביל לעלייה של הידרופוביות של פפטידים שכותרתו27, זה עשוי להסביר מדוע פחות פוסופפטידים זוהו בשני השברים הראשונים במקרה שלנו (איור 2A). לכן, בדיקה באמצעות מגיב TMT-אפס ו aliquot של דגימות ניתן להשתמש כדי להעריך את מספר השברים ואת ריכוז ACN בכל מאגרי שבר. המאגרים הממוטבים עלולים לגרום ליעילות הפרדה טובה יותר של פוסופפטידים עם תווית TMT-6plex.
המגבלות של שברים מבוססי קצה שלב הן מספר השברים והקיבולת של עצות. קשה להרחיב את מספר השברים בהפרדת קצה שלב מכיוון שמאגרי מעבר צבע לא רציפים משמשים לשברים של תיאורי שלב. מצד שני, ניתן להחיל מעבר צבע רציף על עמודות HPLC כדי להשיג מספר שבר גבוה. היכולת של טיפים הוא גורם נוסף המגביל את היישום של טיפים לשלב. לניתוח פוספופרוטאימיקה בקנה מידה גדול (> 10 חלבונים מ"ג) עדיף להשתמש בהעשרה מבוססת HPLC עם אורך עמודה ארוך יותר עמוס ביותר חרוזי C18 ושבר, שהוא מעבר לקנה המידה האנליטי של טיפים לבמה. יחד, העשרת פוסופפטיד מבוססת קצה שלב ושבר הוא שיטה שימושית עבור בקנה מידה קטן עד בינוני של ניתוחי פוספוטומיקה. גישה זו יכולה להיות משולבת עם תיוג isobaric כדי להשיג כימות מולטיפלקסים. התוצאות הראו גם כי זה יכול לשמש פוספופרוטאיומיקה צמחית מעמיקה פרופיל וכימות. זרימת עבודה זו חלה על מינים אחרים וסוגי רקמות שונים עבור תיוג של רשתות איתות מיוחדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים, גרנט XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
