Summary
Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.
Abstract
Eiwitfosforylatie is cruciaal voor de regulatie van enzymactiviteit en genexpressie onder osmotische conditie. Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde phosphoproteomics heeft de manier van het bestuderen van plantsignaaltransductie veranderd. De eis van veel uitgangsmaterialen en een langere meettijd van de lidstaten om de diepte van de dekking te bereiken, was echter de beperkende factor voor de studie met een hoge doorvoer van wereldwijde fosfaatprotemische veranderingen in planten. Om de gevoeligheid en doorvoer van plantaardige fosfoproteomics te verbeteren, hebben we een stop and go extractie (stage) tip gebaseerde phosphoproteomics aanpak ontwikkeld in combinatie met Tandem Mass Tag (TMT) etikettering voor de snelle en uitgebreide analyse van plantfosforylatie perturbatie als reactie op osmotische stress. Gebruikmakend van de eenvoud en hoge doorvoer van fasepunttechniek, duurt de hele procedure ongeveer een uur met behulp van twee tips om fosfopeptideverrijking, fractionering en monsterreinigingsstappen af te ronden, wat een gebruiksvriendelijke en hoge efficiëntie van de aanpak suggereert. Deze aanpak biedt niet alleen een diepgaande analyse van de fysfoproteomics (> 11.000 fosfopeptide-identificatie), maar toont ook de superieure scheidingsefficiëntie (< 5% overlap) tussen aangrenzende fracties aan. Verder is multiplexing bereikt met behulp van TMT-etikettering om de fosfaatprotemische veranderingen van wilde en snrk2 decuple mutante planten te kwantificeren. Deze aanpak is met succes gebruikt om de fosforyleringsgebeurtenissen van Raf-achtige kinases te onthullen als reactie op osmotische stress, die licht werpt op het begrip van vroege osmotische signalering in landplanten.
Introduction
Hoge zoutgehalte, lage temperatuur en droogte veroorzaken osmotische spanningen, wat een belangrijke milieufactor is die de productiviteit van planten beïnvloedt1,2. Eiwitfosforylatie is een van de belangrijkste post-translationele modificaties die signaalperceptie en transductie bemiddelen in de reactie van planten op osmotische stress3,4,5. SNF1-gerelateerde eiwitkinase 2s (SnRK2s) zijn betrokken bij de osmotische stresssignalering6. Negen van de tien leden van de SnRK2-familie vertonen een aanzienlijke activering als reactie op osmotische stress7,8. De snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant met mutaties in alle tien SnRK2 vertoonde overgevoeligheid voor osmotische stress. In snrk2-dec mutant wordt de osmotische stress-geïnduceerde accumulatie van inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP3),abscisinezuur (ABA) biosynthese en genexpressies sterk verminderd, wat de vitale rol van SnRK2s in osmotische stressreactiesbenadrukt 6. Het is echter nog steeds onduidelijk hoe SnRK2s kinases deze biologische processen reguleren. Profilering van de fosfaatprotemische veranderingen als reactie op osmotische stress is een efficiënte manier om deze kloof te overbruggen en de osmotische stress-geactiveerde verdedigingsmechanismen in planten af te baken.
Massaspectrometrie (MS) is een krachtige techniek voor het in kaart brengen van plantfosfaat9. Karakterisering van plantfosfaatproteomics blijft echter een uitdaging vanwege het dynamische bereik van plantenproteoom en de complexiteit van plantlysaat4. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, ontwikkelden we een universele plantfosfoproteomische workflow, die ongewenste interferenties zoals van fotosynthetische pigmenten en secundaire metabolieten elimineert en de diepe dekking van plantfosfaat10mogelijk maakt. Verschillende fosfopeptideverrijkingsmethoden zoals geïmmobiliseerde metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC) en metaaloxidechromatografie (MOC) zijn ontwikkeld voor het verrijken van fosfopeptiden voorafgaand aan MS-analyse11,12,13,14,15,16. Zure niet-fosfiumpeptiden co-zuiveren met fosfopeptiden zijn de belangrijkste interferenties voor fosfopeptide detectie. Voorheen hebben we de pH-waarde en organische zuurconcentratie van de IMAC-belastingsbuffer gestandaardiseerd om de binding van niet-fosfopeptiden te elimineren, om meer dan 90% verrijkingsspecificatie te verkrijgen die de prefractiestap11omzeilt.
Monsterverlies in het meerstapsproces van fosfopeptideverrijking en fractionering belemmert de gevoeligheid van de identificatie van fosfopeptiden en de diepte van de fosfaatprotemische dekking. Stop-and-go-extractie tips (fase tips) zijn pipet tips die kleine schijven bevatten om het uiteinde van de punt te doppen, die kunnen worden opgenomen met chromatografie voor peptide fractionering en reiniging17. Monsterverlies tijdens de fasepuntprocedure kan worden geminimaliseerd door monsteroverdracht tussen de buizen te voorkomen. We hebben met succes fasetip geïmplementeerd in Ga3 +- IMAC en Fe3 +- IMAC om laag overvloedige meerdere gefosforyleerde peptiden te scheiden van afzonderlijk gefosforyleerde peptiden, wat de diepte van menselijk fosfoproteom15verbeterde. Bovendien heeft het gebruik van een hoge pH-omgekeerde fase (Hp-RP) fasetip de bredere dekking van het proteoom van het menselijk membraan aangetoond in vergelijking met die van sterke kationenuitwisseling (SCX) en sterke anionenuitwisseling (SAX) chromatografie18. Daarom kan de integratie van IMAC- en Hp-RP-trapstiptechnieken de dekking van plantfosfoproteom verhogen met eenvoud, hoge specificiteit en hoge doorvoer. We hebben aangetoond dat deze strategie meer dan 20.000 fosforyleringslocaties van Arabidopsis-zaailingen identificeerde, wat een verbeterde diepte van plantfosfaat19vertegenwoordigt.
Hier rapporteren we een op tips gebaseerd fosfaatprotemofoonprotocol voor fosfaatprotemische profilering in Arabidopsis. Deze workflow werd toegepast om de fosfaatprotemische verstoring van wilde-type en snrk2-dec mutant zaailingen te bestuderen als reactie op osmotische stress. De fosfaatprotemische analyse onthulde de fosforyleringslocaties die betrokken zijn bij kinaseactivering en vroege osmotische stresssignalering. Vergelijkende analyse van wild-type en snrk2-dec mutante fosfaatgegevens leidde tot de ontdekking van een Raf-achtige kinase (RAF)-SnRK2 kinase cascade die een sleutelrol speelt in osmore stresssignalering in hoge planten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Oogst de met controle en spanning behandelde zaailingen (1 g) in een aluminiumfolie en vries de monsters in vloeibare stikstof.
OPMERKING: Een hogere eiwitconcentratie wordt meestal waargenomen van twee weken oude zaailingen dan die van volwassen planten. Eén gram zaailingen genereert ongeveer 10 mg eiwitlysaat, wat voldoende is voor de MS-analyse. Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 16.000 x g in stap 1. - Maal bevroren zaailingen tot een fijn poeder met behulp van een vijzel en stamper gevuld met vloeibare stikstof.
- Voeg 1 ml lysisbuffer toe ((6 M guanidine-HCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) met 10 mM Tris (2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP), 40 mM 2-chloroacetamide (CAA), proteaseremmer en fosfaatremmercocktails) aan de mortier en meng met behulp van stamper.
- Breng de plant lysaat over in een buis van 1,5 ml en verwarm gedurende 5 minuten op 95 °C.
- Leg de buis 10 minuten op ijs. Soniceer de buis 10 s op ijs, pauzeer gedurende 10 s en herhaal driemaal.
- Centrifugeer de buis gedurende 20 minuten en aliquot 150 μL plantlysaat in een buis van 1,5 ml.
- Voeg 600 μL 100% methanol toe aan de buis. Vortex en draai door de buis.
- Voeg 150 μL 100% chloroform toe aan de buis. Vortex en draai door de buis.
- Voeg 450 μL ddH2O toe aan de buis. Vortex en centrifugeren de buis gedurende 3 minuten.
- Gooi de bovenste waterige laag weg. Voeg 600 μL 100% methanol toe aan de buis. Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten en gooi de oplossing vervolgens weg.
- Was eiwitkorrels met 600 μL 100% methanol. Gooi de oplossing weg en droog de eiwitkorrel aan de lucht.
- Resuspendeer eiwitkorrels in 600 μL vergistingsbuffer (12 mM natriumdeoxycholaat (SDC)/12 mM natriumlaurylsarcosinaat (SLS) in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Soniceer de buis totdat de suspensie is gehomogeniseerd.
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-kit en pas de concentratie aan op 4 μg/μL met de vergistingsbuffer. Breng 100 μL van het lysaat (400 μg eiwitten) over in een nieuwe buis.
- Voeg 292 μL triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) en 8 μL Lys-C (2,5 eenheid/ml) toe aan de buis. Incubeer de buis gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Voeg 100 μL van 50 mM TEAB met 8 μg trypsine toe aan de buis. Incubeer de buis gedurende 12 uur bij 37 °C.
- Voeg 25 μL 10% trifluoracetinezuur (TFA) toe aan de buis. Vortex en centrifugeren de buis gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Breng de supernatant over in een geconditioneerde ontaltingskolom voor ontsalting. Droog het eluaat met een vacuümcentrifugeconcentrator.
OPMERKING: Activeer de hars met 1 ml methanol gevolgd door 1 ml 0,1% TFA in 80% acetonitril (ACN). Was het organische oplosmiddel met ten minste 3 ml van 0,1% TFA in 5% ACN. Laad verzuurde peptidemonsters bereid in stap 1.16 in de kolom en was de kolom vervolgens met ten minste 3 ml van 0,1% TFA in 5% ACN. Meer wasbeurten kunnen nodig zijn voor monsters met hoge zoutconcentraties. Elute de fosffopeptiden met 1 ml van 0,1% TFA in 80% ACN.
2. Tandem Mass Tag (TMT) etikettering
- Resuspendeer de gedroogde peptiden in 100 μL van 200 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), pH 8,5.
- Los het TMT-reagens van elk kanaal (0,8 mg) op in 40 μL watervrij ACN. Draai de TMT-reagensbuis gedurende 5 minuten en draai deze naar beneden.
- Breng 40 μL TMT over in de monsterbuis en broed gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: In dit experiment werden kanaal 126 tot 128 geëtiketteerd met drie biologische replica's van planten zonder mannitolbehandeling, en het kanaal 129 tot 131 werd geëtiketteerd met drie biologische replica's van planten met mannitolbehandeling. - Voeg 8 μL hydroxylamine van 5% toe en incubeer gedurende 15 minuten.
- Meng 6 monsters in een tube van 5 ml en voeg 14 μL van 10% TFA toe.
- Voeg 3.876 μL van 0,1% TFA toe aan de buis. Vortex en draai naar beneden.
- Breng de oplossing over naar een geconditioneerde ontsaltingskolom voor ontsalting. Droog het eluaat met een verdamper.
3. Voorbereiding van de IMAC-podiumtip
- Gebruik een 16 G stompe naald om een polypropyleen fritschijf te penetreren.
OPMERKING: Houd de frees loodrecht op het oppervlak van de schijf en rol de frees een paar keer om er zeker van te zijn dat de schijf volledig is verwijderd. Plaats de schijf in een Petrischaal voor opslag. Plaats de naald in een pipettip van 200 μL en duw de frit met een zuiger in de punt. - Druk de frit voorzichtig in de punt met een zuiger om het uiteinde van de punt te doken.
- Plaats de fritschijf in uiteinden met dezelfde druk, wat zorgt voor een betere reproduceerbaarheid. De reproduceerbaarheid van de productie van fasetips is belangrijk voor een constante tegendruk, wat van invloed is op de timing van de centrifugestappen en de reproduceerbaarheid tussen technische replica's.
- Als de traptips een hoge tegendruk vertonen tijdens de conditioneringsstap, gooi dan de tips weg om mogelijke verstopping van de tip tijdens het laden van monsters te voorkomen. Het kan zijn dat de schijf te hard in positie is gedrukt.
- Draai de Ni-NTA spinkolom om en plaats deze op een buis van 1,5 ml.
- Gebruik een zuiger om de frit van Ni-NTA kralen zachtjes te drukken en duw de kralen in de buis.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de frit voorzichtig duwt om het mogelijke kraalverlies of adsorptie op de spinkolom te voorkomen.
4. Voorbereiding van hp-RP fase tip
- Bereid hp-RP-traptip voor zoals beschreven voor IMAC-traptip met behulp van een C8-schijf.
OPMERKING: Oefen geen grote kracht uit op de schijf, omdat dit kan leiden tot een dicht opeengepakte frit en de tegendruk van de trappunt kan verhogen. Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 1.000 x g gedurende 5 minuten in stap 4. - Schortel 1 mg C18 kralen in 100 μL 100% methanol en passeer de kralenoplossing door de punt.
- Voeg 20 μL buffer 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) toe aan de podiumtip en passeer buffer 8 door de punt door middel van centrifugatie.
- Voeg 20 μL buffer A (200 mM NH4HCO2) toe aan de fasetip en passeer buffer A door de punt door middel van centrifugatie.
OPMERKING: Breng de centrifuge tijdens het gebruik in evenwicht en zorg ervoor dat de Hp-RP-trapstip niet volledig is gedroogd.
5. Voorbereiding van spinadapter
- Gebruik een scherp pincet om een gat in het midden van het deksel van een buis van 1,5 ml te prikken.
- Steek de IMAC-traptip of hp-RP-trapstip in het gat van de spinadapter.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de punt van het podium niet dicht bij de onderkant van de spinadapter ligt.
6. Phosphopeptide verrijking met behulp van IMAC stadium tip
- Schortel de 10 mg Ni-NTA kralen op met 400 μL laadbuffer (6% azijnzuur (AA), pH 3.0) en laad alle kralenoplossing in per punt. Passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.
OPMERKING: Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 200 x g gedurende 3 minuten in stap 6 naast stap 6.8. - Laad 100 μL ethyleendiaminetetraaceaanzuur (EDTA) van 50 mM om de nikkelionen uit de IMAC-fasetip te verwijderen en de oplossing door centrifugeren door de punt te laten gaan.
- Laad 100 μL laadbuffer op de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.
- Laad 100 μL van 50 mM FeCl3 in 6% AA naar de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie. Fe3+ ionen cheleren naar IMAC stage tip.
- Laad 100 μL laadbuffer om de fasetip te conditioneren en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.
- Laad 100 μL laadbuffer met monsterpeptiden bereid in stap 2.7 tot de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.
OPMERKING: Neem een nieuwe buis als spinadapter om de doorstroming van het monster te verzamelen en bewaar de doorstroming in de vriezer voor toekomstige analyse. - Laad 100 μL wasbuffer (4,5% AA en 25% ACN) in de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.
- Voer de tweede wasbeurt uit met laadbuffer. Laad 100 μL laadbuffer op de traptip en passeer de oplossing door de punt met 1000 × g centrifuge gedurende 3 minuten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de wasbuffer wordt vervangen door een laadbuffer in de fasetip om het verlies van fosfopeptiden tijdens de elutiestap te elimineren. Evenwicht van de IMAC-fasepunt voorafgaand aan fosfopeptide-elutie om ervoor te zorgen dat de concentratie ACN lager is dan 5%. - Knip de IMAC-podiumtip aan de voorkant bij met een schaar en plaats de bijgesneden IMAC-podiumtip in de Hp-RP-tip. Zorg ervoor dat de twee lagen podiumtips het deksel van de centrifuge niet raken.
7. Fosfopeptide fractionering met hp-RP C18 fase tip
- Voeg 100 μL elutiebuffer (200 mM ammoniumfosfaat (NH4H2PO4)) toe aan de bijgesneden IMAC-fasetip en passeer de oplossing door de twee lagen fasepunten door middel van centrifugeren.
OPMERKING: Als de oplossing niet door de traptip gaat, verhoogt u de snelheid van het naar beneden draaien. Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 1.000 x g gedurende 5 minuten in stap 7. Alle Hp-RP-buffers staan vermeld in tabel 1. - Gooi de IMAC-traptip weg met een pincet en voeg 20 μL buffer A toe aan de Hp-RP-traptip en passeer de buffer door de punt door middel van centrifugatie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle elutiebuffer door de IMAC-fasetip gaat voordat u deze weggooit. - Voeg 20 μL buffer 1 toe aan elutefractie 1 en verzamel het eluaat in een nieuwe buis door centrifugatie. Herhaal het proces met buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 om elke fractie in een nieuwe buis te verzamelen. Droog het uiteindelijke eluaat van elke fractie met behulp van een vacuümconcentrator.
OPMERKING: Bereid nieuwe fractioneringsbuffers voor. Neem 8 nieuwe buizen als spinadapter van elke fractie. Verzamel het eluaat van elke fractie in een andere spinadapter. Fosfiumpeptiden zijn niet stabiel onder basisomstandigheden, dus droog de eluaten onmiddellijk door een concentrator of verzuurd met 10% TFA.
8. LC-MS/MS-analyse en gegevensanalyse
- Voeg 5 μL van 0,1% mierenzuur (FA) toe en analyseer het monster met een massaspectrometer.
- Voer een verloop van 90 minuten uit met 6-30% buffer B (80% ACN en 0,1% FA) voor elke fractie.
- Fragmenteer de top 10 gelabelde peptiden met behulp van high collision energy dissociation (HCD). Voltooi een databasezoekopdracht om fosforyleringssites te identificeren.
- Laad de onbewerkte bestanden in de MaxQuant-software, geef de experimenten een naam en stel breuken en PTM in.
OPMERKING: De tutorial van MaxQuant software is te vinden op https://www.maxquant.org/. - Selecteer reporter ion MS2 in het type LC-MS/MS run en 6plex TMT als isobarische labels. Schakel filter op PIF-functie in en stel de min PIF in op 0,75.
- Selecteer Acetyl (Protein N-term), Oxidation (M) en Phospho (STY) in het paneel met variabele wijzigingen. Selecteer Carbamidomethyl (C) als vaste wijzigingen.
- Stel de spijsverteringsmodus in als specifiek, selecteer Trypsine/P als spijsverteringsenzym en twee gemiste decolleté.
- Stel psm false discovery rate (FDR) en eiwit FDR in op 0,01. Stel de minimumscore voor gemodificeerde peptiden in op 40.
- Voeg Arabidopsis thaliana database toe aan het paneel van fasta bestanden en voer database zoeken uit.
- Laad het txt-bestand van Phospho (STY) sites naar de Perseus software terwijl het zoeken wordt gedaan.
OPMERKING: De gedetailleerde tutorials van Perseus software zijn te vinden op https://www.maxquant.org/perseus/. - Filter de omgekeerde fosforyleringsplaatsen eruit. Filter de niet-gelokaliseerde fosforyleringslocaties uit met lokalisatiekans 75% als afsluiting.
- Gebruik de intensiteiten van fosforyleringslocaties voor statistische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de prestaties van deze workflow aan te tonen, hebben we gebruik gemaakt van IMAC stage tip in combinatie met Hp-RP stage tip fractionatie om de fosfaatproteomische veranderingen in wild-type en snrk2-dec mutant zaailingen met of zonder mannitol behandeling gedurende 30 minuten te meten. Elk monster werd uitgevoerd in biologische drievouden en de experimentele workflow is weergegeven in figuur 1. De verteerde peptiden (400 μg) van elk monster werden geëtiketteerd met één TMT-6plex kanaal, samengevoegd en ontzout. De fosffopeptiden werden verder verrijkt met behulp van een IMAC-stadiumtip en de gezuiverde fosfopeptiden werden vervolgens gefractioneerd in acht fracties door een Hp-RP-trapstip. Elke fractie werd geanalyseerd door een LC-gradiëntanalyse van 90 minuten. De onbewerkte bestanden werden doorzocht met behulp van een zoekmachine tegen Arabidopsis thaliana database.
In totaal werden 11.077 unieke fosfopeptiden geïdentificeerd die overeenkomen met 3.630 fosfaatproteïnen met 6.852 gelokaliseerde fosforyleringslocaties (klasse I, lokalisatiekans > 0,75), wat wijst op de brede dekking van Arabidopsis fosfaat. In totaal werden 8.107 en 7.248 fosfopeptiden geïdentificeerd uit respectievelijk wild-type en snrk2-dec mutantenmonster. Dit illustreert de efficiëntie van de workflow bij het bieden van diepgaande dekking voor het afbakenen van de globale visie op signaaltransductie in Arabidopsis. We vergeleken het aantal geïdentificeerde fosffopeptiden over 8 fracties. Een paar fosfopeptiden werden geïdentificeerd in de eerste twee fracties, de fractie 1 en 2. De meeste fosffopeptiden werden echter gelijkmatig verdeeld in de rest van 6 fracties (figuur 2A), wat suggereert dat deze aanpak de mogelijkheid biedt om complexe fosfopeptiden van het plantaardige fosfaat te scheiden. Om de scheidingsefficiëntie van deze workflow verder aan te tonen, evalueerden we de overlapping van fosfopeptiden tussen twee aangrenzende fracties (eq. F1-tot-F2). Minder dan 5% fosffopeptiden overlappen elkaar in de aangrenzende fracties, wat wijst op een robuuste fractioneringsefficiëntie van de Hp-RP-fasepunt (figuur 2B).
Met behulp van de gegevens verkregen door de workflow, vergeleken we de fosfaatproteomische profielen van wild-type en snrk2-dec mutant op mannitol behandeling. In totaal werden 433 en 380 fosforyleringsplaatsen verhoogd na mannitolbehandeling in respectievelijk wild-type en snrk2-dec mutant monster (figuur 3). Daarvan vertoonden 312 fosfosieten inductie (FDR < 0,01) in wilde-type, maar niet in snrk2-dec mutante planten. Uit de genontologie (GO)-analyse bleek dat de functie van fosforylering en activering van eiwitkinase, regulatie van het metabole fosfaatproces, signaaltransductie, aanzienlijk zijn verrijkt in de SnRK2-afhankelijke fosfaatproducten. Interessant is dat go-term met betrekking tot wortelontwikkeling ook werd verrijkt in SnRK2-afhankelijke groep, consistent met het fenotype van wortelgroeiachterstand onder osmotische stress6. We identificeerden ook 116 fosieten up-gereguleerd door mannitol behandeling in zowel wild-type en snrk2-dec mutant. Deze fosfaatproteïnen waren onafhankelijk van SnRK2, of kandidaten die bemiddelen osmotische stress-geactiveerde signalering voorafgaand aan SnRK2s activering. We merkten op dat verschillende B4-subgroep-RAF's zoals RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) en RAF42 (AT3G46920) aanzienlijk werden gereguleerd door osmotische stress. Verder onderzoek toonde aan dat RAF-kinases snel worden geactiveerd door osmotische stress en nodig zijn voor fosforylering en activering van SnRK2s20.
Figuur 1: Workflow van fase tip-gebaseerde fosfaatproteomische methode. Eiwit werd geëxtraheerd en verteerd uit wilde en snrk2-dec mutante zaailingen behandeld met of zonder mannitol. De verteerde peptiden van elke replicerende werden geëtiketteerd met een uniek TMT6-plex kanaal. Fosffopeptiden werden samengevoegd en vervolgens verrijkt met behulp van een IMAC-podiumtip. De gezuiverde fosffopeptiden werden gescheiden door een Hp-RP-trapstip. Elke fractie werd geanalyseerd door massaspectrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Phosfoproteomische profilering van wilde-type en snrk2 decuple mutant zaailingen door IMAC stadium tip en Hp-RP fractionering. (A) Het aantal geïdentificeerde fosffopeptiden per fractie. (B) De scheidingsefficiëntie van de op de punt gebaseerde Hp-RP-chromatografie. De overlapping tussen de aangrenzende breuken wordt weergegeven door het percentage van hetzelfde peptide dat in de aangrenzende breuken is geïdentificeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van de fosfaatprotemische veranderingen als reactie op osmotische stress. Vulkaanpercelen tonen de log2-voudige verandering van fosforyleringsplaatsen in (A) wild-type en (B) snrk2-dec mutante zaailingen als reactie op mannitolbehandeling. De zwarte cirkel vertegenwoordigt de kinase fosforylering sites geïnduceerd door mannitol. De rode cirkel geeft de fosforyleringsplaatsen van RAF's up-regulated als reactie op mannitol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffer A | 200 mM ammoniumformat (NH4HCO2), pH 10,0. | |
| Buffer B | 100% ACN. | |
| Buffer 1 | 5% Buffer B, 95% Buffer A. | |
| Buffer 2 | 8% Buffer B, 92% Buffer A. | |
| Buffer 3 | 11% Buffer B, 89% Buffer A. | |
| Buffer 4 | 14% Buffer B, 86% Buffer A. | |
| Buffer 5 | 17% Buffer B, 83% Buffer A. | |
| Buffer 6 | 20% Buffer B, 80% Buffer A. | |
| Buffer 7 | 23% Buffer B, 77% Buffer A. | |
| Buffer 8 | 80% Buffer B, 20% Buffer A. | |
Tabel 1: Buffers voor hp-RP-trapstipfractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het dynamisch bereik en de complexiteit van plantproteoom en fosfaatproteom zijn nog steeds een beperkende factor tot diepte van fosfaatproteomics analyses. Ondanks het vermogen van single run LC-MS/MS-analyse om 10.000 fosforyleringslocaties21,22te identificeren, is de dekking van het hele fosfaat van de installatie nog steeds beperkt. Daarom is een fosfaatprotemische workflow vereist die een hoge gevoeligheid en superieure scheidingsefficiëntie biedt bij het profileren van de wereldwijde visie van plantsignaleringsnetwerken als reactie op milieustress. Commerciële hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC) kolomgebaseerde chromatografie is een veelgebruikte methode om de complexiteit van peptiden te verminderen voorafgaand aan MS-analyse23,24. Vervelende stappen voor het verzamelen van monsters en een groot elutievolume zijn echter de grootste uitdagingen van hplc-gebaseerde methoden in termen van gevoeligheid en doorvoer. stage tip is een alternatieve aanpak om peptide pre-fractionering of verrijking uit te voeren voor hooggevoeligheids- en hoogdoorvoerwerken. Deze nieuwe fosfaatprotemische workflow die gebruik maakt van isobarische etikettering in combinatie met fosfaatverrijking en fractionering biedt een betere dekking en diepte van plantfosfoproteomics ten opzichte van andere phosfoproteomische workflows25,26.
De pH-waarde van monsters is de cruciale factor die de verrijkingsspecificatie van fosffopeptiden bepaalt. De pH-waarde kan worden beïnvloed door de vorige stap van monstervoorbereiding, dus het is essentieel om de pH-waarde te controleren voordat het monster wordt geladen. Als de pH wordt verschoven, voegt u azijnzuur of natriumhydroxide toe aan monsters om de pH aan te passen aan 3,0. We voeren dit protocol uit voor gelijktijdige elutie en het laden van fosfopeptiden op C18-trapstip. Daarom is het belangrijk om de IMAC-fasetip in evenwicht te brengen voorafgaand aan de fosfopeptide-elutie om ervoor te zorgen dat de concentratie ACN lager is dan 5%.
Het aantal breuken is afhankelijk van de complexiteit en steekproefgrootten. Meestal zijn 5 tot 8 fracties voldoende om een brede dekking van fosfopeptide-identificatie in planten te bieden. De concentratie ACN in fractioneringsbuffers kan worden aangepast aan de hydrofobiceiteit van monsters. De meeste fosffopeptiden zijn geëuteerd uit C18 kralen met behulp van het bereik van 5% tot 25% ACN concentratie. Fosfiumpeptiden zijn meestal meer hydrofiel in vergelijking met niet-gefosforyleerde peptiden als gevolg van de extra negatieve ladingen van de fosfaatgroep. Het taggen van TMT-reagens op het N-eindpunt van peptide leidt echter tot een toename van de hydrofobiteit van gelabelde peptiden27, wat kan verklaren waarom in de eerste twee fracties in ons geval minder fosfopeptiden werden geïdentificeerd (figuur 2A). Zo kan een test met een TMT-nulreagens en een aliquot van monsters worden gebruikt om het aantal fracties en de ACN-concentratie in elke fractioneringsbuffer te evalueren. De geoptimaliseerde buffers kunnen resulteren in een betere scheidingsefficiëntie van TMT-6plex gelabelde fosffopeptiden.
De beperkingen van fase-tip-gebaseerde fractionering zijn het aantal breuken en de capaciteit van tips. Het is moeilijk om het aantal breuken in fasepuntscheiding uit te breiden, omdat discontinu verloopbuffers worden gebruikt voor fasepuntfractie. Aan de andere kant kan een continu verloop worden toegepast op HPLC-kolommen om een hoog breukgetal te bereiken. De capaciteit van tips is een andere factor die de toepassing van fasetips beperkt. Voor grootschalige fosfaatproteomics analyse (> 10 mg eiwitten) is het beter om HPLC-gebaseerde verrijking te gebruiken met een langere kolomlengte vol met meer C18-kralen en fractionering, wat verder gaat dan de analytische schaal van podiumtips. Samen genomen is fosfaatverrijking en fractionering op basis van fosfaat in fases een nuttige methode voor kleine tot middelgrote fosfaatproteomics-analyses. Deze aanpak kan worden geïntegreerd met isobarische etikettering om multiplexed kwantificering te bereiken. De resultaten toonden ook aan dat het kon worden gebruikt voor diepgaande profilering en kwantificering van plantfosfoproteomics. Deze workflow is van toepassing op andere soorten en verschillende weefseltypen voor de afbakening van gespecialiseerde signaleringsnetwerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
