Summary
قدمت هنا هو نهج phosphoproteomic، وهي وقف والذهاب تلميح استخراج القائمة على phosphoproteomic، الذي يوفر إنتاجية عالية وتغطية عميقة من phosphoproteome Arabidopsis. يحدد هذا النهج نظرة عامة على إشارات الإجهاد التناضح في Arabidopsis.
Abstract
إن فسفورة البروتين أمر حاسم لتنظيم نشاط الإنزيم والتعبير الجيني في ظل حالة تناضحة. وقد حولت قياس الطيف الكتلي (MS) القائم على الفوسفاتية على أساس phosphoproteomics طريقة دراسة عملية تحويل إشارة النبات. ومع ذلك، كان شرط الكثير من المواد الأولية وإطالة وقت قياس التصلب المتعدد لتحقيق عمق التغطية هو العامل المقيد لدراسة الإنتاجية العالية للتغيرات الفوسفوبروتينية العالمية في النباتات. لتحسين حساسية وإنتاجية phosphoproteomics النبات، وضعنا توقف والذهاب استخراج (مرحلة) تلميح نهج يستند phosphoproteomics إلى جانب تاند ماس الوسم (TMT) وضع العلامات للتحليل السريع والشامل لزعزعة الفوسوبيل النباتية استجابة للإجهاد التناضح. الاستفادة من البساطة وارتفاع الإنتاجية من تقنية تلميح المرحلة، الإجراء كله يأخذ ما يقرب من ساعة واحدة باستخدام اثنين من النصائح لإنهاء إثراء فوسفوبيبيتيد، تجزئة، وخطوات التنظيف عينة، مما يشير إلى سهولة الاستخدام والكفاءة العالية للنهج. وهذا النهج لا يوفر فقط تحليل phosphoproteomics النباتية المتعمقة (> 11000 تعريف فوسببتيد) ، بل يوضح أيضا كفاءة الفصل الفائقة (< 5 ٪ تداخل) بين الكسور المجاورة. علاوة على ذلك ، تم تحقيق تعدد التعدد باستخدام تسمية TMT لتحديد التغيرات الفوسفاتيةبروتينية للنباتات المتحولة من النوع البري وsnrk2 decuple. وقد استخدم هذا النهج بنجاح للكشف عن أحداث الفوسفور من كينازات تشبه راف استجابة للإجهاد التناضحي ، الذي يلقي الضوء على فهم الإشارات التناضحية المبكرة في مصانع الأرض.
Introduction
ارتفاع الملوحة، وانخفاض درجة الحرارة، والجفاف يسبب الضغوط التناضحة، وهو عامل بيئي رئيسي يؤثر على إنتاجية النبات1،2. إنّ فسفورة البروتين هي واحدة من أهم التعديلات اللاحقة للوساطة في إدراك الإشارة و تحويلها في استجابة النبات للإجهاد التناضحي3،4،5. SNF1 البروتين ذات الصلة كيناز 2s (SnRK2s) وتشارك في الإجهاد التناضح إشارة6. تسعة من عشرة أعضاء من عائلة SnRK2 تظهر تفعيل كبير في استجابة للإجهاد التناضحي7,8. وsnrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)متحولة وجود الطفرات في كل عشرة SnRK2 عرض فرط الحساسية للإجهاد التناضحي. في snrk2-dec mutant, تراكم التناسخ الناجم عن الإجهاد من إينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (IP3),حمض abscisic (ABA) التركيب الحيوي, ويتم تخفيض التعبيرات الجينية بقوة, تسليط الضوء على الدور الحيوي لSnRK2s في استجابات الإجهاد osmotic6. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ينظم kinases SnRK2s هذه العمليات البيولوجية. إن تحديد ملامح التغيرات الفوسفاتية في مجال بروتونات الفوسفو في استجابة للإجهاد التناضحيي هو وسيلة فعالة لسد هذه الفجوة وتحديد آليات الدفاع التي تسببها الاجهاد في النباتات.
قياس الطيف الشامل (MS) هو تقنية قوية لرسم خرائط مصنع الفوسفاتproteome9. ومع ذلك، يظل توصيف الفوسبروتينات النباتية يمثل تحديًا بسبب المدى الديناميكي للبروتيوم النباتي ومدى تعقيد الفلورات النباتية4. للتغلب على هذه التحديات، وضعنا سير عمل نباتي شامل للفوسفوبروتينات، والذي يزيل التداخلات غير المرغوب فيها مثل الأصباغ الضوئية والإيضات الثانوية، وتمكين التغطية العميقة للفوسفوبروتينوم النباتي10. وقد تم تطوير عدة طرق تخصيب فوسفوسوبيبتيد مثل شل الحركة المعدنية أيونات اللوني (IMAC) وكلوروغرافيا أكسيد المعادن (MOC) لإثراء فوسفوسوبيبتيد قبل تحليل MS11،12،13،14،15،16. حمضية غير فوسفوسوبيبتيدات شارك تنقية مع فوسفوسوبيبتيد هي التدخلات الرئيسية للكشف عن فوسفوسوبيبتيد. سابقا، ونحن موحدة قيمة الرقم الحموضة وتركيز حمض عضوي من IMAC تحميل العازلة للقضاء على ربط غير فوسفوسوبيبتيد، للحصول على أكثر من 90٪ خصوصية التخصيب تجاوز الخطوة ما قبل التجزئة11.
فقدان العينة في عملية متعددة الخطوات من إثراء فوسوبيبتيد وتجزئة يعوق حساسية تحديد فوسفوبيبتيد وعمق التغطية فوسفوبروتينومي. نصائح التوقف والذهاب الاستخراج (نصائح المرحلة) هي نصائح ماصة التي تحتوي على أقراص صغيرة لسقف نهاية الطرف، والتي يمكن دمجها مع الكروماتوغرافيا لتجزئة الببتيد وتنظيف17. يمكن تقليل فقدان العينة أثناء إجراء طرف المرحلة عن طريق تجنب نقل العينة بين الأنابيب. لقد نفذنا بنجاح المرحلة تلميح في Ga3 +- IMAC و Fe3 +- IMAC لفصل منخفضة وفيرة متعددة الببتيدات الفوسفورية من الببتيدات الفوسفورية منفردة، والتي حسنت عمق phosphoproteome الإنسان15. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام درجة عالية من درجة السوية عكس المرحلة (Hp-RP) وقد أظهرت المرحلة تلميح التغطية الأوسع للبروتيوم غشاء الإنسان مقارنة مع ذلك من تبادل الموجبة قوية (SCX) وتبادل الأنيون قوية (ساكس) الكروماتوغرافيا18. ولذلك، يمكن دمج IMAC وHP-RP المرحلة تقنيات تلميح زيادة تغطية phosphoproteome النبات مع البساطة، وخصوصية عالية، وإنتاجية عالية. لقد أثبتنا أن هذه الاستراتيجية حددت أكثر من 20،000 مواقع الفسفور من شتلات Arabidopsis ، مما يمثل عمق محسن من phosphoproteome النبات19.
هنا، ونحن تقرير المرحلة البقشيش بروتوكول الفوسفاتية القائمة على phosphoproteomic للتوصيف الفوسفاتيبروتيني في Arabidopsis. تم تطبيق هذا العمل لدراسة الانزعاج الفوسفاتيبروتومي من نوع البرية وsnrk2 ديسمبر الشتلات متحولة استجابة للإجهاد التناضح. وكشف تحليل phosphoproteomic مواقع الفوسفور المتورطين في تنشيط كيناز وإشارات الإجهاد التناضحي في وقت مبكر. تحليل مقارن من نوع البرية وsnrk2 ديسمبر بيانات phosphoproteome متحولة أدى إلى اكتشاف كيناز مثل راف (RAF) - SnRK2 سلسلة كيناز التي تلعب دورا رئيسيا في إشارات الإجهاد osmore في النباتات العالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينة
- حصاد السيطرة والإجهاد معالجة الشتلات (1 ز) في رقائق الألومنيوم وفلاش تجميد العينات في النيتروجين السائل.
ملاحظة: عادة ما يتم ملاحظة تركيز البروتين العالي من الشتلات التي يبلغ عمرها أسبوعين أكثر من تلك التي من النباتات الناضجة. غرام واحد من الشتلات يولد ما يقرب من 10 ملغ من البروتين، وهو ما يكفي لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. يتم إجراء كافة خطوات الطرد المركزي عند 16,000 x ز في الخطوة 1. - طحن الشتلات المجمدة في مسحوق ناعم باستخدام هاون وبذيء مليئة النيتروجين السائل.
- إضافة 1 مل من العازلة تحلل ((6 M guanidine-HCl في 100 mM تريس-HCl، pH 8.5) مع 10 mM تريس (2-carboxyethyl) هيدروكلوريد فوسفين (TCEP)، 40 mM 2-chloroacetamide (CAA)، مثبطات البروتياز وكوكتيلات مثبطات فوسفاتاز) إلى هاون ومزيج مع المعونة من الحشرات.
- نقل lysate النبات إلى أنبوب 1.5 مل والحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- ضع الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. سونيكات أنبوب على الجليد لمدة 10 ق، وقفة لمدة 10 ق، وكرر ثلاث مرات.
- جهاز طرد مركزي أنبوب لمدة 20 دقيقة و aliquot 150 ميكرولتر من lysate النبات في أنبوب 1.5 مل.
- إضافة 600 μL من 100٪ الميثانول في أنبوب. دوامة وتدور أسفل الأنبوب.
- إضافة 150 μL من 100٪ الكلوروفورم في الأنبوب. دوامة وتدور أسفل الأنبوب.
- إضافة 450 μL من ddH2O في الأنبوب. دوامة وطاردة مركزية الأنبوب لمدة 3 دقائق.
- تجاهل الطبقة مائي العلوي. إضافة 600 μL من 100٪ الميثانول في أنبوب. الطرد المركزي أنبوب لمدة 3 دقائق ومن ثم تجاهل الحل.
- غسل الكريات البروتين مع 600 μL من 100٪ الميثانول. تخلص من الحل والهواء الجافة بيليه البروتين.
- الكريات البروتين ريسوسينيند في 600 ميكرولتر من العازلة الهضم (12 mM الصوديوم deoxycholate (SDC)/12 mM الصوديوم لاورويل ساركوسينات (SLS) في 100 mM تريس-HCl, pH 8.5). سونيكات الأنبوب حتى يتم تجانس التعليق.
- قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة BCA وضبط التركيز إلى 4 ميكروغرام / ميكرولتر مع العازلة الهضم. نقل 100 ميكرولتر من lysate (400 ميكروغرام البروتينات) في أنبوب جديد.
- أضف 292 ميكرولتر من بيكربونات ثلاثية الأمهات 50 ملوميوم (TEAB) و8 ميكرولتر من Lys-C (2.5 وحدة/مل) إلى الأنبوب. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- إضافة 100 ميكرولتر من 50 mM TEAB مع 8 ميكروغرام التربسين إلى الأنبوب. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
- إضافة 25 ميكرولتر من 10٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك (TFA) إلى الأنبوب. دوامة وطرد مركزي الأنبوب لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- نقل المُنَتَكِر إلى عمود مُشروط من إزالة التشبع من أجل إزالة السيلت. جففي الـ eluate باستخدام جهاز طرد مركزي مركّز للطرد المركزي.
ملاحظة: قم بتنشيط الراتنج مع 1 مل من الميثانول تليها 1 مل من 0.1٪ TFA في 80٪ الأسيتونتريل (ACN). غسل المذيبات العضوية مع ما لا يقل عن 3 مل من 0.1٪ TFA في 5٪ ACN. تحميل عينات الببتيد المحمّضة المعدة في الخطوة 1.16 في العمود ثم غسل العمود مع ما لا يقل عن 3 مل من 0.1٪ TFA في 5٪ ACN. قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الغسل للعينات مع تركيزات عالية من الملح. Elute فوسفوسوبيبتيدات مع 1 مل من 0.1٪ TFA في 80٪ ACN.
2. العلامة الجماعية جنبا إلى جنب (TMT) وضع العلامات
- إعادة دمج الببتيدات المجففة في 100 ميكرولتر من 200 mM 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازينيثينيسلفون (HEPES)، pH 8.5.
- حل كاشف TMT من كل قناة (0.8 ملغ) في 40 ميكرولتر من ACN اللامائية. دوامة أنبوب TMT الكاشف لمدة 5 دقائق وتدور عليه.
- نقل 40 ميكرولتر من TMT إلى أنبوب العينة واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم تسمية القناة 126 إلى 128 مع ثلاثة تكرارات بيولوجية من النباتات دون معالجة المانينتول، والقناة 129 إلى 131 تم تصنيفها مع ثلاثة نسخ بيولوجية من النباتات مع معالجة المنيتول. - أضف 8 ميكرولتر من 5٪ هيدروكسيلامين وحضانة لمدة 15 دقيقة.
- مزيج 6 عينات في أنبوب 5 مل وإضافة 14 ميكرولتر من 10٪ TFA.
- إضافة 3,876 μL من 0.1٪ TFA إلى الأنبوب. دوامة وتدور أسفل.
- نقل الحل إلى عمود إزالة التشبع المشروط لـ desalting. جففي الـ eluate باستخدام المبخر.
3. إعداد تلميح المرحلة IMAC
- استخدام إبرة 16 G حادة الينتهي لاختراق قرص البولي بروبلين فريت.
ملاحظة: عقد قاطع عمودي على سطح القرص ولفة القاطع بضع مرات للتأكد من أن القرص هو استئصال تماما. ضع القرص في طبق بيتري للتخزين. ضع الإبرة في طرف ماصة 200 ميكرولتر وادفع الفريت في الحافة باستخدام المكبس. - اضغط على frit بلطف في طرف باستخدام المكبس لسقف نهاية تلميح.
- ضع قرص frit في تلميحات مع نفس الضغط ، مما يوفر إمكانية إعادة إنتاج أفضل. إن إعادة إنتاج نصائح المرحلة أمر مهم لضغط الظهر المستمر، مما يؤثر على توقيت خطوات الطرد المركزي وقابلية التكاثر بين التكرارات التقنية.
- إذا كانت نصائح المرحلة تظهر ارتفاع الضغط على الظهر أثناء خطوة تكييف، تجاهل نصائح لتجنب انسداد تلميح المحتملة عند أثناء تحميل العينات. قد يكون القرص قد تم الضغط بشدة في الموضع.
- عكس ني NTA تدور العمود ومكان على أنبوب 1.5 مل.
- استخدام المكبس للضغط على frit من ني NTA الخرز بلطف ودفع الخرز في أنبوب.
ملاحظة: تأكد من دفع frit بلطف لتجنب فقدان حبة محتملة أو الامتزاز على عمود الدوران.
4. إعداد تلميح المرحلة HP-RP
- إعداد تلميح المرحلة HP-RP كما هو موضح لـ IMAC المرحلة تلميح باستخدام قرص C8.
ملاحظة: لا تقم بتطبيق قوة كبيرة على القرص لأنه قد يؤدي إلى frit معبأة بكثافة وزيادة الضغط الخلفي من طرف المرحلة. يتم إجراء كافة خطوات الطرد المركزي في 1000 x ز لمدة 5 دقائق في الخطوة 4. - تعليق 1 ملغ من الخرز C18 في 100 ميكرولتر 100٪ الميثانول وتمرير الحل الخرز من خلال طرف.
- إضافة 20 ميكرولتر من العازلة 8 (80٪ ACN/20٪ 200 M NH4HCO2،درجة حُمر 10.0) إلى طرف المرحلة وتمرير العازلة 8 من خلال الطرف عن طريق الطرد المركزي.
- أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (200 mM NH4HCO2) إلى طرف المرحلة ومرر العازل A عبر الطرف عن طريق الطرد المركزي.
ملاحظة: توازن جهاز الطرد المركزي أثناء الاستخدام والتأكد من أن طرف المرحلة Hp-RP غير جاف تمامًا.
5. إعداد محول تدور
- استخدم ملاقط حادة لثقب ثقب في وسط غطاء أنبوب 1.5 مل.
- أدخل طرف المرحلة IMAC أو تلميح المرحلة Hp-RP في ثقب محول الدوران.
ملاحظة: تأكد من أن طرف المرحلة ليس قريباً من أسفل محول الدوران.
6. إثراء فوسفوسوبيبتيد باستخدام تلميح المرحلة IMAC
- تعليق 10 ملغ ني NTA الخرز مع 400 ميكرولتر من تحميل العازلة (6٪ حمض الخليك (AA)، وhH 3.0) وتحميل كل من حل الخرز في كل طرف. تمرير الحل من خلال طرف عن طريق الطرد المركزي.
ملاحظة: كافة خطوات الطرد المركزي تأخذ مكان في 200 × ز لمدة 3 دقيقة في الخطوة 6 بالإضافة إلى الخطوة 6.8. - تحميل 100 ميكرولتر من 50 mM Ethylenediaminetetraacetic حامض (EDTA) لتجريد أيونات النيكل من تلميح المرحلة IMAC وتمرير الحل من خلال الطرف عن طريق الطرد المركزي.
- تحميل 100 μL من تحميل العازلة إلى طرف المرحلة وتمرير الحل من خلال طرف من قبل الطرد المركزي.
- تحميل 100 ميكرولتر من 50 mM FeCl3 في 6٪ AA إلى طرف المرحلة وتمرير الحل من خلال طرف من قبل الطرد المركزي. Fe3 + أيونات سوف يلخي إلى تلميح المرحلة IMAC.
- تحميل 100 μL من تحميل العازلة لشرط طرف المرحلة وتمرير الحل من خلال طرف من قبل الطرد المركزي.
- تحميل 100 μL من تحميل العازلة مع الببتيدات عينة أعدت في الخطوة 2.7 إلى طرف المرحلة وتمرير الحل من خلال طرف من قبل الطرد المركزي.
ملاحظة: خذ أنبوب جديد كمحول السواب لجمع تدفق العينة وتخزين التدفق من خلال في الفريزر لتحليلها في المستقبل. - تحميل 100 ميكرولتر من العازلة الغسيل (4.5٪ AA و 25٪ ACN) إلى طرف المرحلة وتمرير الحل من خلال طرف من قبل الطرد المركزي.
- قم بإجراء الغسيل الثاني مع مخزن التحميل المؤقت. تحميل 100 μL من تحميل العازلة إلى طرف المرحلة وتمرير الحل من خلال الطرف باستخدام 1000 × ز الطرد المركزي لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: تأكد من استبدال المخزن المؤقت للغسيل بواسطة تحميل المخزن المؤقت في طرف المرحلة للقضاء على فقدان فوسفوسوبيبتيد أثناء خطوة elution. اكويبيل طرف المرحلة IMAC قبل elution فوسفوسوبيبتيد لضمان تركيز ACN أقل من 5٪. - تقليم تلميح المرحلة IMAC في الجبهة مع مقص ووضع تلميح المرحلة IMAC قلصت داخل طرف HP-RP. تأكد من أن طبقتي نصائح المرحلة لا تلمس غطاء جهاز الطرد المركزي.
7. تجزئة فوسفوسوبيبتيد باستخدام تلميح المرحلة HP-RP C18
- أضف 100 ميكرولتر من عازلة elution (200 mM فوسفات الأمونيوم (NH4H2PO4))إلى طرف المرحلة IMAC المشذبة وتمرير الحل من خلال طبقتين من نصائح المرحلة عن طريق الطرد المركزي.
ملاحظة: إذا لم يمر الحل عبر طرف المرحلة، قم بزيادة سرعة الدوران لأسفل. يتم إجراء كافة خطوات الطرد المركزي عند 1,000 x ز لمدة 5 دقائق في الخطوة 7. يتم سرد كافة المخازن المؤقتة Hp-RP في الجدول 1. - تجاهل تلميح المرحلة IMAC باستخدام ملاقط وإضافة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت A إلى طرف المرحلة HP-RP وتمرير المخزن المؤقت من خلال الطرف عن طريق الطرد المركزي.
ملاحظة: تأكد من مرور كل المخزن المؤقت لـ elution عبر طرف المرحلة IMAC قبل تجاهله. - إضافة 20 ميكرولتر من العازلة 1 إلى كسر مائل 1 وجمع eluate في أنبوب جديد عن طريق الطرد المركزي. كرر العملية مع المخازن المؤقتة 2 و3 و4 و5 و6 و7 و8 لتجميع كل كسر في أنبوب جديد. جففي الـ eluate النهائي لكل كسر باستخدام مُركز فراغ.
ملاحظة: تحضير المخازن المؤقتة الكسر جديد. اتخاذ 8 أنابيب جديدة كمحول السواب من كل كسر. جمع مُمَلّد كل كسر في محول دوران مختلف. فوسفوسوبيبتيد ليست مستقرة في ظل الظروف الأساسية، حتى تجف الذبذبات بواسطة المكثف أو حموضة بنسبة 10٪ TFA على الفور.
8 - تحليل وتحليل البيانات من LC-MS/MS
- إضافة 5 ميكرولتر من 0.1٪ حمض فليك (FA) وتحليل العينة بواسطة مطياف الشامل.
- تشغيل تدرج 90 دقيقة مع 6-30٪ المخزن المؤقت B (80٪ ACN و 0.1٪ FA) لكل كسر.
- شظ أعلى 10 الببتيدات المسمى باستخدام ارتفاع تفكك الطاقة الاصطدام (HCD). أكمل البحث في قاعدة بيانات لتحديد مواقع الفسفور.
- تحميل الملفات الخام في برنامج MaxQuant ، اسم التجارب ، وتعيين الكسور وPTM.
ملاحظة: يمكن العثور على البرنامج التعليمي من برنامج MaxQuant في https://www.maxquant.org/. - حدد مراسل ion MS2 في نوع تشغيل LC-MS/MS و TMT 6plex كتسميات isobaric. تمكين عامل التصفية بواسطة PIF وظيفة وتعيين الحد الأدنى PIF ك 0.75.
- حدد أسيتيل (بروتين N-term)، الأكسدة (M)، وPhospho (STY) إلى لوحة التعديلات المتغيرة. حدد Carbamidomethyl (C) كتعديلات ثابتة.
- تعيين وضع الهضم محددة، حدد تريبسين / P كما إنزيم الهضم، واثنين من الانقسام غاب.
- تعيين PSM معدل اكتشاف كاذبة (FDR) والبروتين FDR ك 0.01. تعيين الحد الأدنى للنقاط الببتيدات المعدلة كما 40.
- إضافة العربيةidopsis thaliana قاعدة البيانات إلى لوحة من الملفات fasta وتشغيل قاعدة البيانات البحث.
- تحميل ملف txt من مواقع Phospho (STY) إلى برنامج Perseus كما يتم البحث.
ملاحظة: الدروس التفصيلية من البرامج Perseus يمكن العثور عليها في https://www.maxquant.org/perseus/. - تصفية مواقع الفسفور العكسي. تصفية مواقع الفوسفور غير المُحَمَّن باستخدام احتمالية التعريب 75٪ كقطع.
- استخدام كثافة مواقع الفسفور للتحليل الإحصائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات أداء هذا العمل، استغللنا تلميح المرحلة IMAC إلى جانب تجزئة تلميح المرحلة HP-RP لقياس التغيرات الفوسفاتية في نوع البرية وsnrk2-dec الشتلات متحولة مع أو بدون علاج المنيتول لمدة 30 دقيقة. تم تنفيذ كل عينة في ثلاثية المعادن البيولوجية، ويتم تمثيل سير العمل التجريبي في الشكل 1. الببتيدات المهضمة (400 ميكروغرام) من كل عينة كانت تحمل علامة على قناة TMT-6plex، مجمعة ومزيلة. تم إثراء فوسفوسوبيبتيدات باستخدام تلميح مرحلة IMAC ، وتم تقسيم الفوسفات المطهر لاحقًا إلى ثمانية كسور بواسطة طرف مرحلة Hp-RP. تم تحليل كل كسر من قبل تحليل التدرج LC 90 دقيقة. تم البحث في الملفات الخام باستخدام محرك بحث ضد قاعدة بيانات Arabidopsis thaliana.
وتم تحديد ما مجموعه 077 11 فوسفوسوبيبتيدات فريدة من نوعها مطابقة لما مجموعه 630 3 فوسفوبروتينات مع 852 6 موقعا محليا للفوسفور (الفئة الأولى، احتمالية التوطين> 0.75)، مما يدل على التغطية الواسعة لفوسفوبروتينوم أرابيدوبيس. وتم تحديد ما مجموعه 107 8 و 248 7 فوسفوسوبيبتيد من عينة متحولة من النوع البري وsnrk2-dec، على التوالي. وهذا يوضح كفاءة سير العمل في توفير تغطية متعمقة لتحديد النظرة العالمية لإشارات نقل في Arabidopsis. قارنا عدد الفوسفاتي المحدد عبر 8 كسور. تم تحديد عدد قليل من فوسفوسوبيبتيد في أول جزأين، الكسر 1 و 2. ومع ذلك، تم توزيع غالبية فوسفوسوبيبتيد بالتساوي في بقية 6 كسور(الشكل 2A)،مما يشير إلى أن هذا النهج يوفر القدرة على فصل فوسفوسوبيبتيدات معقدة من phosphoproteome النبات. لمزيد من إثبات كفاءة الفصل من هذا العمل، قمنا بتقييم تداخل فوسفوسوبيبتيد بين كسرين متجاورين (eq. F1 إلى F2). أقل من 5٪ phophopeptides تتداخل في الكسور المجاورة، مما يدل على كفاءة تجزئة قوية من تلميح المرحلة Hp-RP(الشكل 2B).
باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها من قبل سير العمل، قارنا ملامح phosphoproteomic من نوع البرية وsnrk2 ديسمبر متحولة على علاج المانينتول. وتمت زيادة ما مجموعه 433 و 380 موقعا من الفسفور بعد معالجة المنيتول في عينة متحولة من نوع البرية و snrk2-dec على التوالي (الشكل 3). من بين ذلك ، أظهر 312 فوسفوسيتس التعريفي (FDR < 0.01) في الأنواع البرية ، ولكن ليس في نباتات متحولة snrk2-dec. كشف تحليل علم الانتولوجيا الجينية (GO) أن وظيفة الفسفوريل وتنشيط كيناز البروتين ، وتنظيم عملية التمثيل الغذائي الفوسفاتي ، تحويل الإشارة ، يتم إثراؤها بشكل كبير في phosphoproteins المعتمدة على SnRK2. ومن المثير للاهتمام ، تم إثراء مصطلح GO المتعلقة بالتنمية الجذرية أيضًا في مجموعة تعتمد على SnRK2 ، بما يتفق مع النمط الظاهري لتأخر نمو الجذر تحت الضغط التناضحي6. كما حددنا 116 فوسفوسيتس حتى ينظمها العلاج المنيتول في كل من نوع البرية وsnrk2 ديسمبر متحولة. وكانت هذه phosphoproteins مستقلة عن SnRK2، أو المرشحين التي تتوسط الإشارات التناضحة التي تسبب الإجهاد قبل تنشيط SnRK2s. لاحظنا أن العديد من B4 RAFs المجموعة الفرعية مثل RAF18 (AT1G16270) ، RAF24 (AT2G35050) ، و RAF42 (AT3G46920) ، كانت بشكل كبير حتى ينظمها الإجهاد التناضح. وكشفت دراسة أخرى أن كينازات سلاح الجو الملكي البريطاني يتم تنشيطها بسرعة عن طريق الإجهاد التناضح والمطلوبة للفوسفورة وتفعيل SnRK2s20.
الشكل 1: سير عمل طريقة phosphoproteomic القائمة على المرحلة. تم استخراج البروتين وهضمه من الشتلات المتحولة من النوع البري وsnrk2-dec المعالجة مع أو بدون مانيتول. تم تسمية الببتيدات المهضمة لكل تكرار بقناة TMT6-plex فريدة من نوعها. تم تجميع فوسفوسوبيبتيدات ثم تم إثراؤه باستخدام طرف مرحلة IMAC. تم فصل فوسفوسوبيبتيدات المنقية من قبل طرف مرحلة HP-RP. تم تحليل كل كسر بواسطة مطياف الكتلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التنميط الفسفوري للبروتينات من النوع البري وsnrk2 decuple شتلات متحولة من قبل تلميح المرحلة IMAC وتجزئة HP-RP. (أ) عدد الفوسفات الذي تم تحديده لكل كسر. (B) كفاءة الفصل من المرحلة على أساس طرف من الألوان HP-RP. ويمثل التداخل بين الكسور المجاورة النسبة المئوية لنفس الببتيد المحدد في الكسور المجاورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس الكمي للتغيرات الفوسفاتية في التصدّي للإجهاد التنازي. تظهر قطع الثورات البركانية تغيير log2 أضعاف من مواقع الفوسفور في (أ) من نوع البرية و (B) snrk2-dec الشتلات المتحولة ردا على العلاج المنيتول. تمثل الدائرة السوداء مواقع فوسفوريل كيناز التي يسببها مانيتول. الدائرة الحمراء تشير إلى مواقع الفوسفور من RAFs حتى المنظمة استجابة لمانينتول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المخزن المؤقت A | 200 mm الأمونيوم فورماتي (NH4HCO2)، 10.0 pH. | |
| المخزن المؤقت B | 100٪ ACN. | |
| المخزن المؤقت 1 | 5٪ المخزن المؤقت B، 95٪ المخزن المؤقت A. | |
| المخزن المؤقت 2 | 8٪ المخزن المؤقت B، 92٪ المخزن المؤقت A. | |
| المخزن المؤقت 3 | 11٪ المخزن المؤقت B، 89٪ المخزن المؤقت A. | |
| المخزن المؤقت 4 | 14٪ المخزن المؤقت B، 86٪ المخزن المؤقت A. | |
| المخزن المؤقت 5 | 17٪ المخزن المؤقت B، 83٪ المخزن المؤقت A. | |
| المخزن المؤقت 6 | 20٪ المخزن المؤقت B، 80٪ المخزن المؤقت A. | |
| المخزن المؤقت 7 | 23٪ المخزن المؤقت B، 77٪ المخزن المؤقت A. | |
| المخزن المؤقت 8 | 80٪ المخزن المؤقت B، 20٪ المخزن المؤقت A. | |
الجدول 1: المخازن المؤقتة لتجزئة تجزئة تجزئة مرحلة Hp-RP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا يزال النطاق الديناميكي وتعقيد بروتين النبات والفوسفوبروتينيوم عاملاً مقيداً لعمق تحليلات الفوسفاتبروتينيوم. على الرغم من قدرة واحدة تشغيل LC-MS/MS تحليل لتحديد 10,000 مواقع الفوسفور21,22, لا تزال محدودة التغطية من phosphoproteome النبات كله. ولذلك، فإن سير العمل phosphoproteomic الذي يوفر حساسية عالية وكفاءة الفصل متفوقة مطلوب في تحديد صورة عالمية لشبكات الإشارات النباتية استجابة للإجهاد البيئي. إن الكروماتوغرافيا اللونية ذات الضغط العالي (HPLC) ذات العمود هو أسلوب شائع لتقليل تعقيد الببتيد قبل تحليل التصلب العصبي المتعدد23،24. ومع ذلك، خطوات جمع العينة مملة وحجم elution كبيرة هي التحديات الرئيسية من الأساليب المستندة إلى HPLC من حيث حساسية والإنتاجية. المرحلة تلميح هو نهج بديل لتنفيذ الببتيد قبل تجزئة أو إثراء للأعمال عالية الحساسية وعالية الإنتاجية. هذا سير العمل phosphoproteomic جديدة استغلال وضع العلامات التساويات إلى جانب إثراء الفوسفات والتجزئة يوفر تغطية أفضل وعمق من النباتات phosphoproteomics على سير العمل الأخرى phosphoproteomic25،26.
قيمة pH العينات هي العامل الحاسم الذي يحدد خصوصية الإثراء من فوسفوسوبيبتيد. قد تتأثر قيمة الرقم PH بالخطوة السابقة لإعداد العينة، لذلك من الضروري التحقق من قيمة الرقم PH قبل تحميل العينة. إذا تم تحويل الأس هيدروك، إضافة حمض الخليك أو هيدروكسيد الصوديوم إلى عينات لضبط درجة الحموضة إلى 3.0. نحن تنفيذ هذا البروتوكول ل elution في وقت واحد وتحميل فوسفوسوبيبتيد على طرف المرحلة C18. ولذلك، فمن المهم لتكليل تلميح المرحلة IMAC قبل elution فوسفوسوبيبتيد لضمان تركيز ACN أقل من 5٪.
يعتمد عدد الكسور على التعقيد وأحجام العينة. عادة، 5 إلى 8 كسور كافية لتوفير تغطية واسعة لتحديد فوسفوسوبيبتيد في النباتات. ويمكن تعديل تركيز ACN في مخازن الكسر وفقا لhyphobicity العينات. يتم استلسيد معظم فوسفوسوبيبتيد من خرز C18 باستخدام نطاق تركيز ACN 5٪ إلى 25٪. فوسفوسوبيبتيد عادة ما تكون أكثر هيدروفيلية مقارنة بالببتيدات غير الفوسفورية بسبب التهم السلبية الإضافية لمجموعة الفوسفات. ومع ذلك، وضع علامات TMT الكاشف على ن-رفينوس من الببتيد يؤدي إلى زيادة في الرهاب المائي من الببتيدات المسمى27، وهذا قد يفسر لماذا تم تحديد أقل فوسفوسوبيبتيد في أول جزأين في حالتنا (الشكل 2A). وهكذا، يمكن استخدام اختبار باستخدام كاشف TMT-zero و aliquot من العينات لتقييم عدد الكسور وتركيز ACN في كل مخازن الكسر. قد ينتج عن المخازن المؤقتة المحسنة كفاءة أفضل لفصل phosphopeptides المسمى TMT-6plex.
القيود على مرحلة الكسور على الطرف هي عدد الكسور وقدرة النصائح. من الصعب توسيع عدد الكسور في فصل طرف المرحلة لأنه يتم استخدام المخازن المؤقتة المتدرجة غير المتجاورة لتجزئة طرف المرحلة. من ناحية أخرى، يمكن تطبيق تدرج مستمر على أعمدة HPLC لتحقيق رقم كسر مرتفع. قدرة النصائح هو عامل آخر يحد من تطبيق نصائح المرحلة. لتحليل phosphoproteomics على نطاق واسع (> 10 ملغ بروتينات) فمن الأفضل استخدام الإثراء القائم على HPLC مع طول العمود أطول معبأة مع المزيد من الخرز C18 والتجزئة، وهو ما يتجاوز النطاق التحليلي لنصائح المرحلة. تؤخذ معا، المرحلة على أساس طرف الإثراء والتجزئة هو وسيلة مفيدة لمقياس صغير إلى متوسط من تحليلات فوسفوبروتينوميات. ويمكن دمج هذا النهج مع وضع العلامات التساوية لتحقيق تحديد كمي متعدد. وأظهرت النتائج أيضا أنه يمكن استخدامه في تحديد سمات phosphoproteomics المتعمقة وتحديد كمية. هذا العمل ينطبق على الأنواع الأخرى وأنواع مختلفة من الأنسجة لتحديد الشبكات المتخصصة الإشارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم، Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
