Summary
Präsentiert wird hier ein phosphoprotemischer Ansatz, nämlich Stop-and-Go-Extraktionsspitze Phosphoproteomic, die hohen Durchsatz und tiefe Abdeckung von Arabidopsis phosphoproteome bietet. Dieser Ansatz beschreibt den Überblick über osmotische Stresssignale in Arabidopsis.
Abstract
Die Proteinphosphorylierung ist entscheidend für die Regulierung der Enzymaktivität und der Genexpression unter osmottischen Bedingungen. Die Massenspektrometrie (MS)-basierte Phosphoproteomik hat die Art und Weise der Untersuchung der Pflanzensignaltransduktion verändert. Die Anforderung vieler Ausgangsstoffe und eine längere MS-Messzeit, um die Tiefe der Abdeckung zu erreichen, war jedoch der begrenzende Faktor für die Studie mit hohem Durchsatz globaler phosphoprotemischer Veränderungen in Pflanzen. Um die Empfindlichkeit und den Durchsatz von Pflanzenphosphoproteomik zu verbessern, haben wir einen Stop-and-Go-Extraktionsansatz (Stufen-)Spitzen-basierte Phosphoproteomik-Ansatz in Verbindung mit der Tandem Mass Tag (TMT)-Kennzeichnung für die schnelle und umfassende Analyse der Pflanzenphosphorylierungsstörung als Reaktion auf osmotischen Stress entwickelt. Unter Ausnutzung der Einfachheit und des hohen Durchsatzes der Bühnenspitzentechnik dauert das gesamte Verfahren etwa eine Stunde, indem zwei Tipps verwendet werden, um die Phosphopeptidanreicherung, Fraktionierung und Probenreinigungsschritte zu beenden, was auf eine benutzerfreundliche und hohe Effizienz des Ansatzes hindeutet. Dieser Ansatz bietet nicht nur eine eingehende Pflanzenphosphoproteomik-Analyse (> 11.000 Phosphopeptid-Identifikation), sondern zeigt auch die überlegene Trenneffizienz (< 5% Überlappung) zwischen benachbarten Fraktionen. Darüber hinaus wurde Multiplexing mit TMT-Etikettierung erreicht, um die phosphoproteomischen Veränderungen von Wildtyp- und Snrk2-Decuple-Mutantenpflanzen zu quantifizieren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich verwendet, um die Phosphorylierungsereignisse von Raf-ähnlichen Kiinasen als Reaktion auf osmotischen Stress zu enthüllen, der Licht auf das Verständnis der frühen osmotischen Signalisierung in Landpflanzen wirft.
Introduction
Hoher Salzgehalt, niedrige Temperatur und Trockenheit verursachen osmotische Spannungen, was ein wichtiger Umweltfaktor ist, der die Pflanzenproduktivität beeinflusst1,2. Proteinphosphorylierung ist eine der bedeutendsten posttranslationalen Modifikationen, die Signalwahrnehmung und Transduktion in der pflanzlichen Reaktion auf osmotischen Stress3,4,5vermitteln. SNF1-bezogene Proteinkinase 2s (SnRK2s) sind an der osmotischen Stresssignalisierung6beteiligt. Neun von zehn Mitgliedern der SnRK2-Familie zeigen eine signifikante Aktivierung als Reaktion auf osmotischen Stress7,8. Die snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) Mutant mit Mutationen in allen zehn SnRK2 zeigte Überempfindlichkeit gegen osmotischen Stress. Bei snrk2-dec Mutant sind die osmotische Stress-induzierte Akkumulation von Inositol 1,4,5-Trisphosphat (IP3), Abscisinsäure (ABA) Biosynthese und Genausdrücke stark reduziert, was die wichtige Rolle von SnRK2s bei osmotischen Stressreaktionenunterstreicht 6. Es ist jedoch noch unklar, wie SnRK2s-Kiinasen diese biologischen Prozesse regulieren. Die Profilierung der phosphoprotemischen Veränderungen als Reaktion auf osmotischen Stress ist eine effiziente Möglichkeit, diese Lücke zu überbrücken und die osmotischen spannungsgesteuerten Abwehrmechanismen in Pflanzen abzuleiten.
Die Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Kartierung von Pflanzenphosphoproteome9. Die Charakterisierung der Pflanzenphosphoproteomik bleibt jedoch aufgrund des Dynamikbereichs des Pflanzenproteoms und der Komplexität des Pflanzenlysats4eine Herausforderung. Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir einen universellen pflanzlichen phosphoproteomischen Arbeitsablauf entwickelt, der unerwünschte Interferenzen wie photosynthetische Pigmente und Sekundärmetaboliten eliminiert und die tiefe Abdeckung von Pflanzenphosphoproteom10ermöglicht. Mehrere Phosphopeptidanreicherungsmethoden wie die immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) und die Metalloxidchromatographie (MOC) wurden für die Anreicherung von Phosphopeptiden vor der MS-Analyse11,12,13,14,15,16entwickelt. Saure Nicht-Phosphopeptide, die mit Phosphopeptiden koreinigen, sind die Hauptstörungen für den Phosphopeptidnachweis. Zuvor haben wir den pH-Wert und die organische Säurekonzentration des IMAC-Ladepuffers standardisiert, um die Bindung von Nichtphosphopeptiden zu eliminieren, um eine Anreicherungsspezifität von mehr als 90 % zu erhalten, die den Vorfraktionierungsschritt11umgeht.
Der Probenverlust im mehrstufigen Prozess der Phosphopeptidanreicherung und -fraktionierung behindert die Empfindlichkeit der Phosphopeptid-Identifikation und die Tiefe der phosphoproteomischen Abdeckung. Stop-and-Go-Extraktionsspitzen (Stufenspitzen) sind Pipettenspitzen, die kleine Scheiben enthalten, um das Ende der Spitze zu kappen, die mit Chromatographie für Peptidfraktionierung und Reinigung17integriert werden können. Der Probenverlust während des Stufenspitzenverfahrens kann minimiert werden, indem eine Probenübertragung zwischen den Rohren vermieden wird. Wir haben erfolgreich Bühnenspitze in Ga3 +-IMAC und Fe3+-IMAC implementiert, um niedrig reichlich reichlich phosphorylierte Peptide von einzeln phosphorylierten Peptiden zu trennen, die die Tiefe des menschlichen Phosphoproteloms15verbesserten. Darüber hinaus hat die Verwendung von High pH-Umkehrphasen (Hp-RP) Stufenspitze die breitere Abdeckung des menschlichen Membranproteoms im Vergleich zu der von starkem Kationenaustausch (SCX) und starker Anionenaustausch (SAX) Chromatographie18gezeigt. Daher kann die Integration von IMAC- und Hp-RP-Stufenspitzentechniken die Abdeckung von Pflanzenphosphoprotelom mit Einfachheit, hoher Spezifität und hohem Durchsatz erhöhen. Wir haben gezeigt, dass diese Strategie mehr als 20.000 Phosphorylierungsstellen von Arabidopsis Sämlingen identifiziert hat, was eine erhöhte Tiefe des pflanzlichen Phosphoproteloms19darstellt.
Hier berichten wir über ein phosphoproteomisches Protokoll zur Phosphoprotemik-Profilierung in Arabidopsis. Dieser Arbeitsablauf wurde angewendet, um die phosphoprotemische Störung von Wildtyp- und snrk2-dec mutierten Sämlingen als Reaktion auf osmotischen Stress zu untersuchen. Die phosphoproteomische Analyse ergab die Phosphorylierungsstellen, die an der Kinaseaktivierung und der frühen osmotischen Stresssignalisierung beteiligt sind. Die vergleichende Analyse von Wildtyp- und Snrk2-dec-Mutationsphosphoproteom-Daten führte zur Entdeckung einer Raf-ähnlichen Kinase (RAF)-SnRK2-Kinase-Kaskade, die eine Schlüsselrolle bei der Osmore-Stresssignalisierung in hohen Pflanzen spielt.
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Protocol
1. Probenvorbereitung
- Ernte die Kontroll- und stressbehandelten Sämlinge (1 g) in einer Aluminiumfolie und Blitz einfrieren die Proben in flüssigem Stickstoff.
HINWEIS: Eine höhere Proteinkonzentration wird in der Regel bei zwei Wochen alten Sämlingen beobachtet als bei reifen Pflanzen. Ein Gramm Sämlinge erzeugt etwa 10 mg Proteinlysat, was für die MS-Analyse ausreicht. Alle Zentrifugationsschritte erfolgen bei 16.000 x g in Schritt 1. - Gefrorene Sämlinge mit einem Mörtel und einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Stößel zu einem feinen Pulver mahlen.
- 1 ml Lysepuffer ((6 M Guanidin-HCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) mit 10 mM Tris (2-Carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), 40 mM 2-Chloracetamid (CAA), Proteasehemmer und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails) in den Mörtel geben und mit Hilfe von Pestle mischen.
- Das Pflanzenlysat in ein 1,5 ml-Rohr geben und bei 95 °C 5 min erhitzen.
- Legen Sie die Röhre für 10 min auf Eis. Sonicate die Röhre auf Eis für 10 s, Pause für 10 s, und dreimal wiederholen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr für 20 min und aliquot 150 l Pflanzenlysat in ein 1,5 ml Rohr.
- Fügen Sie 600 l 100% Methanol in die Röhre. Wirbel und drehen Sie die Röhre.
- 150 l 100% Chloroform in die Röhre geben. Wirbel und drehen Sie die Röhre.
- 450 L ddH2O in die Röhre geben. Wirbel und Zentrifugieren sie das Rohr für 3 min.
- Entsorgen Sie die obere wässrige Schicht. Fügen Sie 600 l 100% Methanol in die Röhre. Zentrifugieren Sie das Rohr für 3 min und entsorgen Sie dann die Lösung.
- Waschen Sie Proteinpellets mit 600 l 100% Methanol. Entsorgen Sie die Lösung und trocknen Sie das Proteinpellet an die Luft.
- Proteinpellets in 100 ml Verdauungspuffer (12 mM Natriumdeoxycholat (SDC)/12 mM Natriumlauroylsarkosinat (SLS) in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) wieder aufsetzen. Beschallen Sie das Rohr, bis die Suspension homogenisiert ist.
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Kit und passen Sie die Konzentration mit dem Verdauungspuffer auf 4 g/l an. Übertragen Sie 100 l des Lysats (400 g Proteine) in eine neue Röhre.
- Fügen Sie dem Rohr 292 l 50 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) und 8 l Lys-C (2,5 Einheit/ml) hinzu. Inkubieren Sie das Rohr bei 37 °C für 3 h.
- Fügen Sie 100 l von 50 mM TEAB mit 8 g Trypsin in das Rohr. Inkubieren Sie das Rohr bei 37 °C für 12 h.
- Fügen Sie dem Röhrchen 25 L 10 % Trifluoressigsäure (TFA) hinzu. Vortex und Zentrifugieren sie das Rohr für 20 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand in eine konditionierte Entsalzungssäule zum Entsalzen. Trocknen Sie das Eluat mit einem Vakuumzentrifugekonzentrator.
HINWEIS: Aktivieren Sie das Harz mit 1 ml Methanol, gefolgt von 1 ml 0,1% TFA in 80% Acetonitril (ACN). Waschen Sie das organische Lösungsmittel mit mindestens 3 ml 0,1% TFA in 5% ACN aus. In Schritt 1.16 hergestellte säuernde Peptidproben in die Kolonne laden und dann die Säule mit mindestens 3 ml 0,1% TFA in 5% ACN waschen. Für Proben mit hohen Salzkonzentrationen können weitere Wässen benötigt werden. Elute die Phosphopeptide mit 1 ml von 0,1% TFA in 80% ACN.
2. Tandem-Massen-Tag-Etikettierung (TMT)
- Die getrockneten Peptide in 100 l von 200 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES), pH 8.5, wieder aufsetzen.
- Lösen Sie das TMT-Reagenz jedes Kanals (0,8 mg) in 40 l wasserfreien ACN auf. Wirbeln Sie das TMT-Reagenzrohr für 5 min und drehen Sie es nach unten.
- Übertragen Sie 40 l TMT in das Probenröhrchen und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden die Kanäle 126 bis 128 mit drei biologischen Repliken von Pflanzen ohne Mannitolbehandlung beschriftet, und der Kanal 129 bis 131 wurde mit drei biologischen Repliken von Pflanzen mit Mannitolbehandlung gekennzeichnet. - Fügen Sie 8 l von 5% Hydroxylamin hinzu und brüten Sie 15 min.
- Mischen Sie 6 Proben in einem 5 ml Rohr und fügen Sie 14 l von 10% TFA hinzu.
- Fügen Sie dem Rohr 3.876 L von 0,1% TFA hinzu. Wirbel und Spin-down.
- Übertragen Sie die Lösung zum Entsalzen in eine konditionierte Entsalzungssäule. Trocknen Sie das Eluat mit einem Verdampfer.
3. Vorbereitung der IMAC-Stufenspitze
- Verwenden Sie eine 16 G stumpfe Nadel, um eine Polypropylen-Fritenscheibe zu durchdringen.
HINWEIS: Halten Sie den Fräser senkrecht zur Oberfläche der Scheibe und rollen Sie den Fräser ein paar Mal, um sicherzustellen, dass die Scheibe vollständig ausgeschnitten ist. Legen Sie die Scheibe zur Lagerung in eine Petrischale. Legen Sie die Nadel in eine 200-L-Pipettespitze und drücken Sie die Frikte mit einem Kolben in die Spitze. - Drücken Sie die Frikte vorsichtig in die Spitze mit einem Kolben, um das Ende der Spitze zu kappen.
- Legen Sie die Frititenscheibe in Spitzen mit dem gleichen Druck, die eine bessere Reproduzierbarkeit bietet. Die Reproduzierbarkeit der Stufenspitzenproduktion ist wichtig für den konstanten Gegendruck, der sich auf das Timing der Zentrifugenschritte und die Reproduzierbarkeit zwischen technischen Replikationen auswirkt.
- Wenn die Stufenspitzen während des Konditionierungsschritts einen hohen Gegendruck aufweisen, entsorgen Sie die Spitzen, um eine mögliche Spitzeverstopfung beim Laden von Proben zu vermeiden. Es kann sein, dass die Festplatte zu stark in Position gedrückt wurde.
- Ni-NTA-Spinsäule invertieren und auf ein 1,5 ml Rohr legen.
- Drücken Sie die Frikten der Ni-NTA-Perlen vorsichtig mit einem Kolben und schieben Sie die Perlen in die Röhre.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Frisit vorsichtig drücken, um den potenziellen Perlenverlust oder die Adsorption auf der Spin-Spalte zu vermeiden.
4. Vorbereitung der Hp-RP-Bühnenspitze
- Bereiten Sie die Hp-RP-Bühnenspitze wie beschrieben für die IMAC-Stufenspitze mit einer C8-Festplatte vor.
HINWEIS: Wenden Sie keine große Kraft auf die Scheibe an, da sie zu einem dicht gepackten Frit eführen und den Gegendruck der Stufenspitze erhöhen kann. Alle Zentrifugationsschritte erfolgen bei 1.000 x g für 5 min in Schritt 4. - 1 mg C18-Perlen in 100 l 100% Methanol aussetzen und die Perlenlösung durch die Spitze passieren.
- Fügen Sie der Stufenspitze 20 l Puffer 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) hinzu und passieren Puffer 8 durch Zentrifugation durch die Spitze.
- Fügen Sie der Stufenspitze 20 l Puffer A (200 mM NH4HCO2) hinzu und passieren Sie Puffer A durch Zentrifugation durch die Spitze.
HINWEIS: Balancieren Sie die Zentrifuge während des Gebrauchs und stellen Sie sicher, dass die Hp-RP-Stufenspitze nicht vollständig getrocknet ist.
5. Vorbereitung des Spinadapters
- Verwenden Sie scharfe Endpinzette, um ein Loch in der Mitte des Deckels eines 1,5 ml Rohrs zu durchstechen.
- Setzen Sie die IMAC-Bühnenspitze oder Hp-RP-Bühnenspitze in das Loch des Spinadapters ein.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Stufenspitze nicht in der Nähe des unteren Endes des Spinadapters befindet.
6. Phosphopeptid-Anreicherung mit IMAC-Stufenspitze
- Die 10 mg Ni-NTA-Perlen mit 400 l Ladepuffer (6% Essigsäure (AA), pH 3,0) aussetzen und die gesamte Perlenlösung pro Spitze laden. Übergeben Sie die Lösung durch die Spitze durch Zentrifugation.
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte erfolgen bei 200 x g für 3 min in Schritt 6 neben Schritt 6.8. - Laden Sie 100 l 50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um die Nickelionen von der IMAC-Stufenspitze zu entfernen und die Lösung durch Zentrifugation durch die Spitze zu leiten.
- Laden Sie 100 l Ladepuffer auf die Stufenspitze und passieren Sie die Lösung durch Zentrifugation durch die Spitze.
- Laden Sie 100 l von 50 mM FeCl3 in 6% AA auf die Stufenspitze und passieren Sie die Lösung durch Zentrifugation durch die Spitze. Fe3+ Ionen werden zur IMAC-Bühnenspitze chelaten.
- Laden Sie 100 l Ladepuffer, um die Stufenspitze zu konditionieren und die Lösung durch Zentrifugation durch die Spitze zu leiten.
- 100 L Ladepuffer mit in Schritt 2.7 vorbereiteten Probenpeptiden auf die Stufenspitze laden und die Lösung durch Zentrifugation durch die Spitze passieren.
HINWEIS: Nehmen Sie ein neues Rohr als Spin-Adapter, um den Durchfluss der Probe zu sammeln und den Durchfluss im Gefrierschrank für zukünftige Analysen zu speichern. - 100 l Waschpuffer (4,5 % AA und 25 % ACN) auf die Stufenspitze legen und die Lösung durch Zentrifugation durch die Spitze passieren.
- Führen Sie die zweite Wäsche mit Ladepuffer durch. Laden Sie 100 l Ladepuffer auf die Stufenspitze und passieren Sie die Lösung mit 1000 × g Zentrifuge für 3 min durch die Spitze.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Waschpuffer durch einen Ladepuffer in der Stufenspitze ersetzt wird, um den Verlust von Phosphopeptiden während des Elutionsschritts zu vermeiden. Equilibrate die IMAC-Stufenspitze vor der Phosphopeptid-Elution, um sicherzustellen, dass die AcN-Konzentration unter 5% liegt. - Schneiden Sie die IMAC-Bühnenspitze vorne mit einer Schere und legen Sie die getrimmte IMAC-Bühnenspitze in die Hp-RP-Spitze. Stellen Sie sicher, dass die beiden Schichten der Stufenspitzen den Deckel der Zentrifuge nicht berühren.
7. Phosphopeptid-Fraktionierung mit Hp-RP C18-Stufenspitze
- Fügen Sie der getrimmten IMAC-Stufenspitze 100 l Elutionspuffer (200 mM Ammoniumphosphat (NH4H2PO4)) hinzu und passieren Sie die Lösung durch Zentrifugation durch die beiden Schichten der Stufenspitzen.
HINWEIS: Wenn die Lösung nicht durch die Stufenspitze geht, erhöhen Sie die Geschwindigkeit des Spin-Down. Alle Zentrifugationsschritte erfolgen bei 1.000 x g für 5 min in Schritt 7. Alle Hp-RP-Puffer sind in Tabelle 1aufgeführt. - Entsorgen Sie die IMAC-Stufenspitze mit einer Pinzette, und fügen Sie der Hp-RP-Stufenspitze 20 L Puffer A hinzu und passieren Sie den Puffer durch zentrifugieren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der gesamte Elutionspuffer die IMAC-Stufenspitze durchläuft, bevor Sie sie verwerfen. - Fügen Sie 20 l Puffer 1 zu Elute Fraktion 1 hinzu und sammeln Sie das Eluat in einem neuen Rohr durch Zentrifugation. Wiederholen Sie den Vorgang mit den Puffern 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8, um jeden Bruch in einem neuen Rohr zu sammeln. Trocknen Sie das endgültige Eluat jeder Fraktion mit einem Vakuumkonzentrator.
HINWEIS: Bereiten Sie neue Fraktionierungspuffer vor. Nehmen Sie 8 neue Röhren als Spin-Adapter jeder Fraktion. Sammeln Sie das Eluat jeder Fraktion in einem anderen Spin-Adapter. Phosphopeptide sind unter Grundbedingungen nicht stabil, daher trocknen Sie die Eluate durch einen Konzentrator oder versauern Sie sofort um 10% TFA.
8. LC-MS/MS-Analyse und Datenanalyse
- Fügen Sie 5 l 0,1% Ameisensäure (FA) hinzu und analysieren Sie die Probe mit einem Massenspektrometer.
- Führen Sie einen 90 min Gradienten mit 6-30% Puffer B (80% ACN und 0.1% FA) für jede Fraktion aus.
- Fragmentieren Sie die Top 10 beschrifteten Peptide mit hoher Kollisionsenergiedissoziation (HCD). Führen Sie eine Datenbanksuche durch, um Phosphorylierungssites zu identifizieren.
- Laden Sie die Rohdateien in die MaxQuant-Software, benennen Sie die Experimente und legen Sie Brüche und PTM fest.
HINWEIS: Das Tutorial der MaxQuant-Software finden Sie unter https://www.maxquant.org/. - Wählen Sie Reporter-Ionen MS2 in der Art des LC-MS/MS-Laufs und 6plex TMT als isobaric-Etiketten aus. Aktivieren Sie den Filter nach PIF-Funktion und legen Sie den min PIF auf 0,75 fest.
- Wählen Sie Acetyl (Protein N-Term), Oxidation (M) und Phospho (STY) in das Panel mit variablen Modifikationen. Wählen Sie Carbamidomethyl (C) als feste Modifikationen aus.
- Legen Sie den Verdauungsmodus als spezifisch fest, wählen Sie Trypsin/P als Verdauungsenzym und zwei verpasste Dekolletés aus.
- Legen Sie die PSM-Falscherkennungsrate (FDR) und das Protein FDR auf 0,01 fest. Legen Sie die Mindestpunktzahl für modifizierte Peptide auf 40 fest.
- Fügen Sie arabidopsis thaliana Datenbank zum Panel der Fasta-Dateien hinzufügen und führen Sie datenbanksuche.
- Laden Sie die txt-Datei von Phospho (STY) Websites in die Perseus-Software, wie die Suche durchgeführt wird.
HINWEIS: Die detaillierten Tutorials der Perseus-Software finden Sie unter https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtern Sie die reverse phosphorylation Sites heraus. Filtern Sie die nicht lokalisierten Phosphorylierungsstellen mit der Lokalisierungswahrscheinlichkeit 75 % als Cut-off heraus.
- Verwenden Sie die Intensitäten von Phosphorylierungsstellen für statistische Analysen.
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Representative Results
Um die Leistungsfähigkeit dieses Workflows zu demonstrieren, haben wir die IMAC-Stufenspitze in Verbindung mit der Hp-RP-Stufenspitzenfraktionierung genutzt, um die phosphoprotemischen Veränderungen bei Wildtyp- und snrk2-dec mutierten Sämlingen mit oder ohne Mannitolbehandlung 30 Minuten lang zu messen. Jede Probe wurde in biologischen Triplicaten durchgeführt, und der experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt. Die verdauten Peptide (400 g) jeder Probe wurden mit einem TMT-6plex-Kanal beschriftet, gepoolt und entsalzt. Die Phosphopeptide wurden mit einer IMAC-Stufenspitze weiter angereichert und die gereinigten Phosphopeptide anschließend durch eine HP-RP-Stufenspitze in acht Fraktionen fraktioniert. Jeder Bruch wurde durch eine 90 min LC Gradientenanalyse analysiert. Die Rohdateien wurden mit einer Suchmaschine gegen Arabidopsis thaliana Datenbank durchsucht.
Insgesamt wurden 11.077 einzigartige Phosphopeptide identifiziert, die 3.630 Phosphoproteinen mit 6.852 lokalisierten Phosphorylierungsstellen (Klasse I, Lokalisationswahrscheinlichkeit > 0,75) entsprechen, was auf die breite Abdeckung von Arabidopsis phosphoproteome hindeutet. Insgesamt wurden 8.107 bzw. 7.248 Phosphopeptide aus Wildtyp- bzw. Snrk2-dec-Mutantenproben identifiziert. Dies veranschaulicht die Effizienz des Workflows bei der Tiefendeckung für die Abgrenzung der globalen Sicht der Signaltransduktion in Arabidopsis. Wir verglichen die Anzahl der identifizierten Phosphopeptide über 8 Fraktionen hinweg. In den ersten beiden Fraktionen, der Fraktion 1 und 2, wurden einige Phosphopeptide identifiziert. Jedoch, die Mehrheit der Phosphopeptide waren gleichmäßig in den Rest verteilt 6 Fraktionen (Abbildung 2A), was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz bietet die Fähigkeit, komplexe Phosphopeptide von der Pflanze Phosphoproteome zu trennen. Um die Trenneffizienz dieses Workflows weiter zu demonstrieren, haben wir die Überlappung von Phosphopeptiden zwischen zwei benachbarten Fraktionen (dq. F1-zu-F2) ausgewertet. Weniger als 5% Phosphopeptide überlappen sich in den angrenzenden Fraktionen, was auf eine robuste Fraktionierungseffizienz der Hp-RP-Stufenspitze hindeutet (Abbildung 2B).
Anhand der durch den Arbeitsablauf gewonnenen Daten verglichen wir die phosphorotemischen Profile von Wildtyp und Snrk2-dec Mutant bei Mannitolbehandlung. Insgesamt wurden 433 bzw. 380 Phosphorylierungsstellen nach Dermannitolbehandlung in Wildtyp- bzw. Snrk2-dec-Mutantenproben erhöht (Abbildung 3). Darunter zeigten 312 Phosphosite Induktion (FDR < 0,01) in Wildarten, nicht aber in snrk2-dec mutierten Pflanzen. Die Gene Ontology (GO) Analyse ergab, dass die Funktion der Phosphorylierung und Aktivierung der Proteinkinase, Regulierung des Phosphatstoffwechselprozesses, Signaltransduktion, in den SnRK2-abhängigen Phosphoproteinen signifikant angereichert sind. Interessanterweise wurde der GO-Begriff im Zusammenhang mit der Wurzelentwicklung auch in der SnRK2-abhängigen Gruppe angereichert, im Einklang mit dem Phänotyp der Wurzelwachstumsverzögerung unter osmotischem Stress6. Wir identifizierten auch 116 Phosphosite, die durch Mannitolbehandlung sowohl in Wildtyp als auch bei Snrk2-dec Mutant reguliert werden. Diese Phosphoproteine waren unabhängig von SnRK2 oder Kandidaten, die vor der Aktivierung von SnRK2s osmotische Spannungssignale vermitteln. Wir beobachteten, dass mehrere B4-Untergruppen-RAFs wie RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) und RAF42 (AT3G46920) durch osmotischen Stress erheblich hochreguliert wurden. Weitere Studien ergaben, dass RAF-Kiinasen schnell durch osmotischen Stress aktiviert werden und für die Phosphorylierung und Aktivierung von SnRK2s20erforderlich sind.
Abbildung 1: Workflow der phosphoproteomischen Phase-Spitzenmethode. Protein wurde extrahiert und verdaut aus Wildtyp und snrk2-dec mutierten Sämlingen, die mit oder ohne Mannitol behandelt wurden. Die verdauten Peptide jeder Replikation wurden mit einem einzigartigen TMT6-Plex-Kanal gekennzeichnet. Phosphopeptide wurden gepoolt und dann mit einer IMAC-Bühnenspitze angereichert. Die gereinigten Phosphopeptide wurden durch eine HP-RP-Stufenspitze getrennt. Jede Fraktion wurde mit dem Massenspektrometer analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Phosphoproteothermische Profilierung von Wildtyp- und Snrk2-Dekuperit-Mutanten durch IMAC-Stufenspitze und Hp-RP-Fraktionierung. (A) Die Anzahl der identifizierten Phosphopeptide pro Fraktion. (B) Die Trenneffizienz der Bühnenspitzen-basierten Hp-RP-Chromatographie. Die Überlappung zwischen den benachbarten Brüchen wird durch den Prozentsatz des gleichen Peptids dargestellt, der in den benachbarten Fraktionen identifiziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung der phosphoprotemischen Veränderungen als Reaktion auf osmotischen Stress. Vulkandiagramme zeigen die log2 Faltenänderung der Phosphorylierungsstellen in (A) Wildtyp und (B) snrk2-dec mutierten Sämlingen als Reaktion auf die Mannitolbehandlung. Der schwarze Kreis stellt die kinase phosphorylation Stellen durch Mannitol induziert. Der rote Kreis zeigt die Phosphorylierungsstellen von RAFs als Reaktion auf Mannitol hochreguliert an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Puffer A | 200 mM Ammoniumformat (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| Puffer B | 100% ACN. | |
| Puffer 1 | 5% Puffer B, 95% Puffer A. | |
| Puffer 2 | 8% Puffer B, 92% Puffer A. | |
| Puffer 3 | 11% Puffer B, 89% Puffer A. | |
| Puffer 4 | 14% Puffer B, 86% Puffer A. | |
| Puffer 5 | 17% Puffer B, 83% Puffer A. | |
| Puffer 6 | 20% Puffer B, 80% Puffer A. | |
| Puffer 7 | 23% Puffer B, 77% Puffer A. | |
| Puffer 8 | 80% Puffer B, 20% Puffer A. | |
Tabelle 1: Puffer für hp-RP-Stufenspitzenfraktionierung.
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Discussion
Der Dynamikumfang und die Komplexität von Pflanzenproteom und Phosphoproteom sind nach wie vor ein begrenzender Faktor für die Tiefe der Phosphoproteomik-Analysen. Trotz der Fähigkeit der Single-Run-LC-MS/MS-Analyse, 10.000 Phosphorylierungsstellen21,22zu identifizieren, ist die Abdeckung des gesamten Pflanzlichen Phosphoproteloms immer noch begrenzt. Daher ist ein phosphoprotemischer Workflow erforderlich, der eine hohe Empfindlichkeit und überlegene Trenneffizienz bietet, um die globale Ansicht von Anlagensignalnetzen als Reaktion auf Umweltbelastungen zu profilieren. Kommerzielle Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) säulenbasierte Chromatographie ist eine gängige Methode zur Reduzierung der Peptidkomplexität vor der MS-Analyse23,24. Mühsame Probenentnahmeschritte und ein großes Elutionsvolumen sind jedoch die größten Herausforderungen von HPLC-basierten Methoden in Bezug auf Empfindlichkeit und Durchsatz. Stage Tip ist ein alternativer Ansatz zur Durchführung von Peptidvorfraktionierung oder Anreicherung für hochempfindliche und hochdurchsatzige Arbeiten. Dieser neue phosphoproterote Workflow, der die isobarische Etikettierung in Verbindung mit der Phosphopeptidanreicherung und -fraktionierung nutzt, bietet eine bessere Abdeckung und Tiefe der pflanzlichen Phosphoproteomik als andere phosphoproteomische Arbeitsabläufe25,26.
Der pH-Wert von Proben ist der entscheidende Faktor, der die Anreicherungsspezifität von Phosphopeptiden bestimmt. Der pH-Wert kann durch den vorherigen Schritt der Probenvorbereitung beeinflusst werden, daher ist es wichtig, den pH-Wert vor der Probenbelastung zu überprüfen. Wenn der pH-Wert verschoben wird, wird den Proben Essigsäure oder Natriumhydroxid hinzugefügt, um den pH-Wert auf 3,0 einzustellen. Wir führen dieses Protokoll zur gleichzeitigen Elution und Belastung von Phosphopeptiden auf die C18-Stufenspitze aus. Daher ist es wichtig, die IMAC-Stufenspitze vor der Phosphopeptid-Elution auszustatten, um sicherzustellen, dass die ACN-Konzentration unter 5% liegt.
Die Anzahl der Brüche hängt von der Komplexität und den Stichprobengrößen ab. In der Regel, 5 bis 8 Fraktionen sind genug, um eine breite Abdeckung der Phosphopeptid-Identifikation in Pflanzen bieten. Die AcN-Konzentration in Fraktionierungspuffern kann entsprechend der Hydrophobizität der Proben eingestellt werden. Die meisten Phosphopeptide werden aus C18-Perlen mit einem Bereich von 5% bis 25% ACN-Konzentration eluiert. Phosphopeptide sind in der Regel hydrophiler als nicht phosphorylierte Peptide aufgrund der zusätzlichen negativen Belastungen der Phosphatgruppe. Jedoch, Tagging TMT Reagenz auf N-Terminus von Peptid führt zu einer Erhöhung der Hydrophobie der markierten Peptide27, die erklären kann, warum weniger Phosphopeptide wurden in den ersten beiden Fraktionen in unserem Fall identifiziert (Abbildung 2A). So kann ein Test mit einem TMT-Null-Reagenz und einem Aliquot von Proben verwendet werden, um die Anzahl der Fraktionen und die ACN-Konzentration in jedem Fraktionierungspuffer zu bewerten. Die optimierten Puffer können zu einer besseren Trenneffizienz von TMT-6plex-markierten Phosphopeptiden führen.
Die Einschränkungen der Stufentipp-basierten Fraktionierung sind die Anzahl der Brüche und die Kapazität der Spitzen. Es ist schwierig, die Anzahl der Brüche bei der Stufenspitzentrennung zu erweitern, da diskontinuierliche Gradientenpuffer für die Stufenspitzenfraktionierung verwendet werden. Andererseits kann ein kontinuierlicher Gradient auf HPLC-Säulen angewendet werden, um eine hohe Bruchzahl zu erreichen. Die Kapazität der Tipps ist ein weiterer Faktor, der die Anwendung von Stufentipps einschränkt. Für groß angelegte Phosphoproteomik-Analysen (> 10 mg Proteine) ist es besser, HPLC-basierte Anreicherung mit längerer Säulenlänge mit mehr C18-Perlen und Fraktionierung zu verwenden, die über die analytische Skala der Stufenspitzen hinausgeht. Zusammengenommen ist die Stufenspitzen-basierte Phosphopeptidanreicherung und -fraktionierung eine nützliche Methode für kleine bis mittlere Phosphoproteomik-Analysen. Dieser Ansatz kann in die isobarische Etikettierung integriert werden, um eine multiplexed Quantifizierung zu erreichen. Die Ergebnisse zeigten auch, dass es für die Profilierung und Quantifizierung von Pflanzenphosphoproteomik in der Pflanze verwendet werden kann. Dieser Workflow ist auf andere Arten und verschiedene Gewebetypen für die Abgrenzung von spezialisierten Signalnetzen anwendbar.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Grant XDB27040106, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
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