Summary
Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis'te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.
Abstract
Protein fosforilasyonu, ozmotik durum altında enzim aktivitesinin ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi için çok önemlidir. Kütle spektrometresi (MS) bazlı fosfoproteomik, bitki sinyali transdüksiyonunu inceleme şeklini dönüştürmüştür. Bununla birlikte, kapsama derinliğini elde etmek için çok sayıda başlangıç malzemesinin ve uzun ms ölçüm süresinin gerekliliği, bitkilerdeki küresel fosfoproteomik değişikliklerin yüksek verimli çalışması için sınırlayıcı faktör olmuştur. Bitki fosfoproteomiklerinin hassasiyetini ve verimini artırmak için, ozmotik strese yanıt olarak bitki fosforilasyon pertürbasyonunun hızlı ve kapsamlı analizi için Tandem Mass Tag (TMT) etiketlemesi ile birlikte dur ve git ekstraksiyonu (aşama) uç bazlı fosfoproteomik yaklaşım geliştirdik. Sahne ucu tekniğinin basitliğinden ve yüksek veriminden yararlanan tüm prosedür, fosfopenptid zenginleştirme, fraksiyonasyon ve numune temizleme adımlarını bitirmek için iki ipucu kullanarak yaklaşık bir saat sürer ve bu da yaklaşımın kullanımı kolay ve yüksek verimliliğini önerir. Bu yaklaşım sadece derinlemesine bir bitki fosfoproteomik analizi (> 11.000 fosfopenptid tanımlaması) sağlamaz, aynı zamanda bitişik kesirler arasındaki üstün ayırma verimliliğini (< % 5 örtüşme) gösterir. Ayrıca, vahşi tip ve snrk2 mutant bitkilerinin fosfoproteomik değişikliklerini ölçmek için TMT etiketlemesi kullanılarak çoklama sağlanmıştır. Bu yaklaşım, kara bitkilerinde erken ozmotik sinyalizasyonun anlaşılmasına ışık tutan ozmotik strese yanıt olarak Raf benzeri kinazların fosforilasyon olaylarını ortaya çıkarmak için başarıyla kullanılmıştır.
Introduction
Yüksek tuzluluk, düşük sıcaklık ve kuraklık, bitki verimliliğini etkileyen önemli bir çevresel faktör olan ozmotik streslere neden olur1,2. Protein fosforilasyonu, osmotik strese santral tepkisinde sinyal algısına ve transdüksiyona aracılık eden çeviri sonrası en önemli modifikasyonlardan biridir3,4,5. SNF1 ile ilgili protein kinaz 2'ler (SnRK2s) ozmotik stres sinyalinde yer almaktadır6. SnRK2 ailesinin on üyesinden dokuzu ozmotik strese yanıt olarak önemli aktivasyon gösterir7,8. On SnRK2'nin tamamında mutasyona uğrayan snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant ozmotik strese karşı aşırı duyarlılık gösterdi. Snrk2-dec mutantında, inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscisic asit (ABA) biyosentezinin ozmotik stres kaynaklı birikimi ve gen ifadeleri güçlü bir şekilde azalır ve SnRK2'lerin ozmotik stres yanıtlarındaki hayati rolünü vurgular6. Bununla birlikte, SnRK2s kinazlarının bu biyolojik süreçleri nasıl düzenlediği hala belirsizdir. Osmotik strese yanıt olarak fosfoproteomik değişikliklerin profillenmesi, bu boşluğu kapatmanın ve bitkilerdeki ozmotik stresi tetikleyen savunma mekanizmalarını tanımlamanın etkili bir yoludur.
Kütle spektrometresi (MS), bitki fosfoproteom9'unharitalandırılması için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, bitki fosfoproteomiklerinin karakterizasyonu, bitki proteomunun dinamik aralığı ve bitki lysate4'ünkarmaşıklığı nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fototiretik pigmentler ve ikincil metabolitler gibi istenmeyen parazitleri ortadan tanıyan ve bitki fosfoproteomunun derin kapsamasını sağlayan evrensel bir bitki fosfoproteomik iş akışı geliştirdik10. MS analizi 11,12,13,14,15,16öncesinde fosfopenptidlerin zenginleştirilmesi için hareketsiz metal iyonbenzeşim kromatografisi (IMAC) ve metal oksit kromatografisi (MOC) gibi çeşitli fosfopenptid zenginleştirme yöntemleri geliştirilmiştir. Fosfopenptitlerle birlikte saflaştırıcı asidik fosfopenptitler fosfopenptid tespiti için başlıca girişimlerdir. Daha önce, fosfopenptitlerin bağlanmasını ortadan kaldırmak, ön fraksiyonasyon adım11'iatlayarak% 90'dan fazla zenginleştirme özgüllüğü elde etmek için IMAC yükleme tamponunun pH değerini ve organik asit konsantrasyonunu standartlaştırdık.
Fosfopenptid zenginleştirme ve fraksiyonasyonun çok adımlı sürecindeki numune kaybı fosfopenptid tanımlama hassasiyetini ve fosfoproteomik kapsamın derinliğini engeller. Durdur ve git ekstraksiyon ipuçları (aşama ipuçları), peptit fraksiyonasyonu ve temizliği için kromatografi ile birleştirilebilen ucun ucunu kaplamak için küçük diskler içeren pipet uçlarıdır17. Tüpler arasında numune aktarımı önlenerek kademe ucu işlemi sırasında numune kaybı en aza indirilebilir. Ga3+-IMAC ve Fe3+-IMAC'de, insan fosfoproteomunun derinliğini artıran tekil fosforilasyonlu peptitlerden düşük bol çoklu fosforillenmiş peptitleri ayırmak için aşama ipucunu başarıyla uyguladık15. Ek olarak, yüksek pH ters fazlı (Hp-RP) faz ucunun kullanımı, güçlü katyon değişimi (SCX) ve güçlü anion değişimi (SAX) kromatografisi18ile karşılaştırıldığında insan zarı proteomunun daha geniş kapsamını göstermiştir. Bu nedenle, IMAC ve Hp-RP kademe ucu tekniklerini entegre etmek, bitki fosfoproteom kapsamını basitlik, yüksek özgüllük ve yüksek verim ile artırabilir. Bu stratejinin Arabidopsis fidelerinden 20.000'den fazla fosforilasyon alanı tanımladığını ve bitki fosfoproteomunun gelişmiş bir derinliğini temsil ettiğini gösterdik19.
Burada, Arabidopsis'te fosfoproteomik profilleme için aşama ucu tabanlı fosfoproteomik bir protokol bildiriyoruz. Bu iş akışı, ozmotik strese yanıt olarak vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerinin fosfoproteomik pertürbasyonunu incelemek için uygulanmıştır. Fosfoproteomik analiz, kinaz aktivasyonu ve erken ozmotik stres sinyali ile ilişkili fosforilasyon bölgelerini ortaya çıkardı. Vahşi tip ve snrk2-dec mutant fosfoproteome verilerinin karşılaştırmalı analizi, yüksek bitkilerde osmore stres sinyallerinde kilit rol oynayan Raf benzeri bir kinaz (RAF)-SnRK2 kinaz kaskadının keşfine yol açtı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune hazırlama
- Kontrol ve stresle işlenmiş fideleri (1 g) alüminyum bir folyoda hasat edin ve numuneleri sıvı nitrojende flaşla dondurun.
NOT: Daha yüksek protein konsantrasyonu genellikle iki haftalık fidelerden olgun bitkilerden daha fazla gözlenir. Bir gram fide, MS analizi için yeterli olan yaklaşık 10 mg protein lysate üretir. Tüm santrifüjleme adımları 1. - Donmuş fideleri sıvı nitrojenle doldurulmuş bir harç ve pestle kullanarak ince bir toz haline getirin.
- 1 mL lizis tamponu ekleyin ((100 mM Tris-HCl'de 6 M guanidin-HCl, pH 8.5) ile 10 mM Tris (2-karboksit)fosfin hidroklorür (TCEP), 40 mM 2-kloroasetamid (CAA), proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü kokteylleri) harcına karıştırın ve pestil yardımıyla karıştırın.
- Bitki lisatını 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın.
- Tüpü 10 dakika boyunca buza yerleştirin. Tüpü 10 s buz üzerinde sonicate, 10 s için duraklatın ve üç kez tekrarlayın.
- Tüpü 20 dakika ve aliquot 150 μL bitki lysate'yi 1,5 mL'lik bir tüpe santrifüj edin.
- Tüpe 600 μL% 100 metanol ekleyin. Girdap ve tüp aşağı dön.
- Tüpe 150 μL% 100 kloroform ekleyin. Girdap ve tüp aşağı dön.
- Tüpe 450 μL ddH2O ekleyin. Girdap ve santrifüj tüp 3 dakika.
- Üst sulu tabakayı atın. Tüpe 600 μL% 100 metanol ekleyin. Tüpü 3 dakika santrifüj edin ve ardından çözeltiyi atın.
- Protein peletlerini% 100 metanolden 600 μL ile yıkayın. Çözeltiyi atın ve protein peletini havayla kurutun.
- Protein peletlerini 600 μL sindirim tamponuna (12 mM sodyum deoksikolat (SDC)/12 mM sodyum lauroyl sarkolizat (SLS) 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) olarak yeniden sunun. Süspansiyon homojenize olana kadar tüpü sonicate edin.
- Bir BCA kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve sindirim tamponu ile konsantrasyonu 4 μg / μL'ye ayarlayın. 100 μL lysate (400 μg protein) yeni bir tüpe aktarın.
- Tüpe 292 μL 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) ve 8 μL Lys-C (2,5 Birim/mL) ekleyin. Tüpü 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.
- Tüpe 8 μg tripsin ile 100 μL 50 mM TEAB ekleyin. Tüpü 37 °C'de 12 saat kuluçkaya yatırın.
- Tüpe 25 μL% 10 trifluoroasetik asit (TFA) ekleyin. Vorteks ve santrifüj tüpü 4 °C'de 20 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantı tuzdan arındırma için koşullandırılmış bir tuzdan arındırma sütununa aktarın. Bir vakum santrifüj konsantratör kullanarak eluat kurutun.
NOT: Reçineyi 1 mL metanol ve ardından %80 asetonitrilde (ACN) %0,1 TFA'nın 1 mL'si ile etkinleştirin. Organik çözücüyü %5 ACN'de en az 3 mL%0,1 TFA ile yıkayın. 1.16. adımda hazırlanan asitlenmiş peptit örneklerini kolona yükleyin ve ardından sütunu% 5 ACN'de% 0.1 TFA'nın en az 3 mL'si ile yıkayın. Yüksek tuz konsantrasyonlarına sahip numuneler için daha fazla yıkama gerekebilir. Fosfopenptitleri% 80 ACN'de% 0.1 TFA'nın 1 mL'si ile elute edin.
2. Tandem Mass Tag (TMT) etiketleme
- Kurutulmuş peptitleri 100 μL 200 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.5'e yeniden tanımlayın.
- Her kanalın TMT reaktifini (0,8 mg) 40 μL susuz ACN'de çözün. TMT reaktif tüpünü 5 dakika boyunca girdap ve aşağı çevirin.
- 40 μL TMT'yi numune tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu deneyde, 126 ila 128 kanalı mannitol tedavisi olmayan bitkilerin üç biyolojik çoğaltılması ile, 129 ila 131 kanalı ise mannitol tedavisi ile bitkilerin üç biyolojik çoğaltılması ile etiketlenmiştir. - 8 μL% 5 hidroksilamin ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 5 mL'lik bir tüpte 6 numuneyi karıştırın ve% 10 TFA'nın 14 μL'sini ekleyin.
- Tüpe %0,1 TFA'nın 3.876 μL'sini ekleyin. Girdap ve aşağı dön.
- Çözümü tuzdan arındırma için koşullandırılmış bir tuzdan arındırma sütununa aktarın. Buharlaştırıcı kullanarak elüat kurutun.
3. IMAC aşama ucunun hazırlanması
- Polipropilen frit diske nüfuz etmek için 16 G künt uçlu bir iğne kullanın.
NOT: Kesiciyi diskin yüzeyine dik tutun ve diskin tamamen ekstrüzyona maruz olduğundan emin olmak için kesiciyi birkaç kez yuvarlayın. Diski saklamak için bir Petri kabına yerleştirin. İğneyi 200 μL pipet ucuna yerleştirin ve friti bir piston kullanarak ucuna itin. - Ucun ucunu kaplamak için bir piston kullanarak friti hafifçe ucuna bastırın.
- Frit diski, daha iyi tekrarlanabilirlik sağlayan aynı basınca sahip uçlara yerleştirin. Aşama uçları üretiminin tekrarlanabilirliği, santrifüj adımlarının zamanlamasını ve teknik yinelemeler arasındaki tekrarlanabilirliği etkileyen sabit geri basınç için önemlidir.
- Aşama ipuçları koşullandırma adımı sırasında yüksek sırt basıncı gösteriyorsa, numuneleri yüklerken olası uç tıkanmasını önlemek için ipuçlarını atın. Disk çok fazla yerleştirilmiş olabilir.
- Ni-NTA spin sütununu ters çevirin ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- Ni-NTA boncuklarının fritini hafifçe bastırmak ve boncukları tüpe itmek için bir piston kullanın.
NOT: Spin sütunundaki olası boncuk kaybını veya adsorpsiyonunu önlemek için friti hafifçe itmeye dikkat edin.
4. Hp-RP sahne ucunun hazırlanması
- C8 disk kullanarak IMAC aşama ucu için açıklandığı gibi Hp-RP sahne ucu hazırlayın.
NOT: Diske büyük kuvvet uygulamayın, çünkü yoğun bir şekilde paketlenmiş bir frit ile sonuçlanabilir ve sahne ucunun geri basıncını artırabilir. Tüm santrifüjleme adımları, 4. - 100 μL%100 metanolde 1 mg C18 boncuk askıya alın ve boncuk çözeltisini ucundan geçirin.
- Sahne ucuna 20 μL tampon 8 (%80 ACN/%20 200 mMNH 4HCO2, pH 10.0) ekleyin ve tampon 8'i santrifüjleme ile uçtan geçirin.
- Sahne ucuna 20 μL Tampon A (200 mMNH 4HCO2)ekleyin ve A tamponunu santrifüjleme ile uçtan geçirin.
NOT: Kullanım sırasında santrifüjü dengeleyin ve Hp-RP kademe ucunun tamamen kurumadığını sağlayın.
5. Spin adaptörünün hazırlanması
- 1,5 mL'lik bir tüpün kapağının ortasındaki bir deliği delmek için keskin uçlu cımbız kullanın.
- IMAC kademe ucunu veya Hp-RP kademe ucunu spin adaptörünün deliğine takın.
NOT: Sahne ucunun spin adaptörünün altına yakın olmadığından emin olun.
6. IMAC aşama ucu kullanılarak fosfopenptid zenginleştirme
- 10 mg Ni-NTA boncuklarını 400 μL yükleme tamponu (%6 asetik asit (AA), pH 3.0) ile askıya alın ve tüm boncuk çözeltisini uç başına yükleyin. Çözeltiyi santrifüjleme ile ucundan geçirin.
NOT: Tüm santrifüjleme adımları, adım 6.8'in yanı sıra 6. - Nikel iyonlarını IMAC aşama ucundan çıkarmak ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirmek için 100 μL 50 mM etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) yükleyin.
- Sahne ucuna 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.
- %6 AA'da 50 mM FeCl3'ün 100 μL'sini sahne ucuna yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin. Fe3+ iyonları IMAC sahne ucuna şelatlanacaktır.
- Sahne ucunu koşullandırmak için 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.
- 2.7. adımda hazırlanan numune peptitleri ile 100 μL yükleme tamponunu sahne ucuna yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.
NOT: Numunenin akışını toplamak için spin adaptörü olarak yeni bir tüp alın ve akışı gelecekteki analizler için dondurucuda saklayın. - Sahne ucuna 100 μL yıkama tamponu (%4,5 AA ve %25 ACN) yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.
- yükleme arabelleği ile ikinci yıkamayı gerçekleştirin. Sahne ucuna 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi 3 dakika boyunca 1000 × g santrifüj kullanarak uçtan geçirin.
NOT: Elution adımı sırasında fosfopenptit kaybını ortadan kaldırmak için yıkama tamponunun sahne ucuna tampon yükleyerek değiştirildiğinden emin olun. ACN konsantrasyonunun% 5'in altında olduğundan emin olmak için fosfopenptid elüasyonundan önce IMAC sahne ucunu aşındırın. - Öndeki IMAC sahne ucunu bir makasla kırpın ve kesilmiş IMAC sahne ucunu Hp-RP ucunun içine yerleştirin. sahne uçlarının iki katmanının santrifüjün kapağına temas etmemesini sağlayın.
7. Hp-RP C18 aşama ucu kullanılarak fosfopenptid fraksiyonasyonu
- Kırpılmış IMAC sahne ucuna 100 μL elution tamponu (200 mM amonyum fosfat (NH4H2PO4)) ekleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile sahne uçlarının iki katmanından geçirin.
NOT: Çözüm sahne ucuna geçmiyorsa, aşağı dönüş hızını artırın. Tüm santrifüjleme adımları, 7. Tüm Hp-RP arabellekleri Tablo 1'de listelenmiştir. - Cımbız kullanarak IMAC kademe ucunu atın ve Hp-RP kademe ucuna 20 μL Tampon A ekleyin ve tamponu santrifüjleme ile uçtan geçirin.
NOT: Tüm elution tamponun atılmadan önce IMAC aşama ucundan geçtiğinden emin olun. - Kesir 1'i elüte etmek için 20 μL Tampon 1 ekleyin ve eluat'ı santrifüjleme ile yeni bir tüpte toplayın. Her kesiri yeni bir tüpte toplamak için işlemi Tamponlar 2, 3, 4, 5, 6, 7 ve 8 ile tekrarlayın. Vakum konsantratörü kullanarak her fraksiyonun son eluatını kurutun.
NOT: Yeni kesirli tamponlar hazırlayın. Her fraksiyonun spin adaptörü olarak 8 yeni tüp alın. Her kesirdeki eluat'ı farklı bir spin adaptöründe toplayın. Fosfopenptitler temel koşullar altında stabil değildir, bu nedenle elüatları bir konsantratörle kurulayın veya hemen% 10 TFA ile asitlendirin.
8. LC-MS/MS analizi ve veri analizi
- %0,1 formik asit (FA) için 5 μL ekleyin ve numuneyi bir kütle spektrometresi ile analiz edin.
- Her kesir için %6-30 arabellek B (%80 ACN ve %0,1 SK) ile 90 dk gradyan çalıştırın.
- Yüksek çarpışma enerjisi ayrışması (HCD) kullanarak ilk 10 etiketli peptidi parçala. Fosforilasyon alanlarını tanımlamak için bir veritabanı aramasını tamamlayın.
- Ham dosyaları MaxQuant yazılımına yükleyin, denemeleri adlandırın ve kesirleri ve PTM'yi ayarlayın.
NOT: MaxQuant yazılımının öğreticisi https://www.maxquant.org/ bulunabilir. - LC-MS/MS çalıştırması türünde muhabir iyon MS2'yi ve izobarik etiketler olarak 6plex TMT'yi seçin. PIF işlevine göre filtreyi etkinleştirin ve en az PIF'i 0,75 olarak ayarlayın.
- Değişken değişiklikler paneline Asetil (Protein N-terim), Oksidasyon (M) ve Fosfo (STY) seçin. Sabit değişiklikler olarak Carbamidomethyl (C) öğesini seçin.
- Sindirim modunu belirli olarak ayarlayın, sindirim enzimi olarak Trypsin/P'yi ve iki kaçırılan bölünmeyi seçin.
- PSM yanlış bulma oranını (FDR) ve protein FDR'yi 0,01 olarak ayarlayın. Değiştirilmiş peptitler için minimum puanı 40 olarak ayarlayın.
- Arabidopsis thaliana veritabanını fasta dosyaları paneline ekleyin ve veritabanı aramasını çalıştırın.
- Arama yapılırken Fosfo (STY) sitelerinin txt dosyasını Perseus yazılımına yükleyin.
NOT: Perseus yazılımının ayrıntılı öğreticilerini https://www.maxquant.org/perseus/. - Ters fosforilasyon bölgelerini filtreleyin. Yerelleştirme olasılığını %75 keserek kireçlenmemiş fosforilasyon alanlarını filtreleyin.
- İstatistiksel analiz için fosforilasyon alanlarının yoğunluklarını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iş akışının performansını göstermek için, 30 dakika boyunca mannitol tedavisi olan veya olmayan vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerindeki fosfoproteomik değişiklikleri ölçmek için Hp-RP aşama ucu fraksiyonasyonu ile birlikte IMAC aşama ipucundan yararlandık. Her örnek biyolojik üç taraflı olarak gerçekleştirildi ve deneysel iş akışı Şekil 1'detemsil edildi. Her numunenin sindirilmiş peptitleri (400 μg) bir TMT-6plex kanalı ile etiketlendi, havuza alındı ve tuzdan arındırıldı. Fosfopenptitler bir IMAC aşama ucu kullanılarak daha da zenginleştirildi ve saflaştırılmış fosfopenptitler daha sonra bir Hp-RP aşama ucu ile sekiz fraksiyona fraksiyone edildi. Her kesir 90 dk LC gradyan analizi ile analiz edildi. Ham dosyalar Arabidopsis thaliana veritabanına karşı bir arama motoru kullanılarak arandı.
Arabidopsis fosfoproteomu geniş kapsama alanını gösteren 6.852 lokalize fosforilasyon bölgesi (Sınıf I, lokalizasyon olasılığı > 0.75) ile 3.630 fosfoproteine karşılık gelen toplam 11.077 benzersiz fosfopenptid tanımlanmıştır. Vahşi tip ve snrk2-dec mutant örneklerinden sırasıyla toplam 8.107 ve 7.248 fosfopenptit tespit edildi. Bu, Arabidopsis'tesinyal transdüksiyonunun küresel görünümünün sınırlanması için derinlemesine kapsama alanı sağlamada iş akışının verimliliğini göstermektedir. Tanımlanan fosfopenptit sayısını 8 fraksiyonda karşılaştırdık. İlk iki fraksiyonda, fraksiyon 1 ve 2'de birkaç fosfopenptit tanımlanmıştır. Bununla birlikte, fosfopenptidlerin çoğu geri kalan 6 fraksiyonda eşit olarak dağıtılmamıştır (Şekil 2A), bu yaklaşımın karmaşık fosfopenptitleri bitki fosfoproteomundan ayırma yeteneği sağladığını göstermektedir. Bu iş akışının ayırma verimliliğini daha fazla göstermek için fosfopenptitlerin bitişik iki kesir (eq. F1-to-F2) arasındaki çakışmasını değerlendirdik. %5'ten az fosfopenptid bitişik kesirlerde üst üste biner ve hp-RP aşama ucunun sağlam fraksiyonasyon verimliliğini gösterir (Şekil 2B).
İş akışı tarafından elde edilen verileri kullanarak, vahşi tip ve snrk2-dec mutant fosfoproteomik profillerini mannitol tedavisi ile karşılaştırdık. Vahşi tip ve snrk2-dec mutant örneklerinde mannitol tedavisinden sonra sırasıyla toplam 433 ve 380 fosforilasyon bölgesi arttırılmıştır (Şekil 3). Bunlar arasında, 312 fosit vahşi tipte indüksiyon (FDR < 0.01) gösterdi, ancak snrk2-dec mutant bitkilerinde değil. Gen Ontolojisi (GO) analizi, fosforilasyon fonksiyonunun ve protein kinazının aktivasyonunun, fosfat metabolik sürecinin düzenlenmesinin, sinyal transdüksiyonunun SnRK2 bağımlı fosfoproteinlerde önemli ölçüde zenginleştiğini ortaya koydu. İlginçtir ki, kök gelişimi ile ilgili GO terimi de SnRK2 bağımlı grupta zenginleştirilmiştir, ozmotik stres altında kök büyüme geriliğinin fenotipi ile tutarlı6. Ayrıca hem vahşi tip hem de snrk2-dec mutantta mannitol tedavisi ile düzenlenmiş 116 fosit tespit ettik. Bu fosfoproteinler SnRK2'den veya SnRK2s aktivasyonundan önce ozmotik stresle tetiklenen sinyalizasyona aracılık eden adaylardan bağımsızdı. RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) ve RAF42 (AT3G46920) gibi birkaç B4 alt grubu RAT'nin ozmotik stres tarafından önemli ölçüde düzenlendiğini gözlemledik. Daha fazla çalışma, RAF kinazlarının ozmotik stres tarafından hızlı bir şekilde aktive edildiğini ve SnRK2s20'ninfosforilasyonu ve aktivasyonu için gerekli olduğunu ortaya koydu.
Şekil 1: Sahne ucu tabanlı fosfoproteomik yöntemin iş akışı. Protein, mannitollü veya mannitolsüz olarak tedavi edilen vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerinden çıkarıldı ve sindirildi. Her bir kopyanın sindirilmiş peptitleri benzersiz bir TMT6-pleks kanalla etiketlendi. Fosfoptikürler birikmiş ve daha sonra bir IMAC aşama ucu kullanılarak zenginleştirilmiştir. Saflaştırılmış fosfopenptitler Hp-RP sahne ucu ile ayrılmıştır. Her kesir kütle spektrometresi ile analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Vahşi tip ve snrk2 decuple mutant fidelerinin IMAC sahne ucu ve Hp-RP fraksiyonasyonu ile fosfoproteomik profillenmesi. (A) Fraksiyon başına tanımlanan fosfopenptid sayısı. (B) Aşama ucu tabanlı Hp-RP kromatografisinin ayırma verimliliği. Bitişik kesirler arasındaki çakışma, bitişik kesirlerde tanımlanan aynı peptitin yüzdesiyle temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fosfoproteomik değişikliklerin ozmotik strese yanıt olarak nicelleştirilmesi. Volkan arazileri, mannitol tedavisine yanıt olarak (A) vahşi tip ve (B) snrk2-dec mutant fidelerinde fosforilasyon alanlarının log2 kat değişimini göstermektedir. Siyah daire, mannitol tarafından indüklenen kinaz fosforilasyon bölgelerini temsil eder. Kırmızı daire, rafların fosforilasyon alanlarını mannitol'e yanıt olarak düzenlenmiş olarak gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek A | 200 mM amonyum format (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| Arabellek B | %100 ACN. | |
| Arabellek 1 | %5 Tampon B, %95 Tampon A. | |
| Arabellek 2 | %8 Tampon B, %92 Tampon A. | |
| Arabellek 3 | %11 Tampon B, %89 Tampon A. | |
| Arabellek 4 | %14 Tampon B, %86 Tampon A. | |
| Arabellek 5 | %17 Tampon B, %83 Tampon A. | |
| Arabellek 6 | %20 Tampon B, %80 Tampon A. | |
| Arabellek 7 | %23 Tampon B, %77 Tampon A. | |
| Arabellek 8 | %80 Tampon B, %20 Tampon A. | |
Tablo 1: Hp-RP aşama ucu fraksiyonasyonu için arabellekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bitki proteomunun dinamik aralığı ve karmaşıklığı ve fosfoproteom hala fosfoproteomik analizlerin derinliği için sınırlayıcı bir faktördür. 10.000 fosforilasyon bölgesi21 , 22'yitanımlamak için tek çalıştırmalı LC-MS / MS analizi yeteneğine rağmen, tüm bitki fosfoproteomunun kapsamı hala sınırlıdır. Bu nedenle, çevresel strese yanıt olarak tesis sinyal ağlarının küresel görünümünün profil oluşturmasında yüksek hassasiyet ve üstün ayırma verimliliği sağlayan fosfoproteomik bir iş akışı gereklidir. Ticari yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) kolon bazlı kromatografi, MS analizi23,24öncesinde peptit karmaşıklığını azaltmak için yaygın bir yöntemdir. Bununla birlikte, sıkıcı numune toplama adımları ve büyük elution hacmi, hassasiyet ve verim açısından HPLC tabanlı yöntemlerin en önemli zorluklarıdır. sahne ucu, yüksek hassasiyetli ve yüksek verimli işler için peptit ön fraksiyonasyonunu veya zenginleştirmesini yürütmek için alternatif bir yaklaşımdır. Fosfopenptid zenginleştirme ve fraksiyonasyonu ile birleştiğinde izobarik etiketlemeden yararlanan bu yeni fosfoproteomik işakışı,diğer fosfoproteomik iş akışlarına göre bitki fosfoproteomiklerinin daha iyi kapsamasını ve derinliğini sağlar25,26.
Numunelerin pH değeri fosfopenptitlerin zenginleştirme özgüllüğünü belirleyen önemli faktördür. pH değeri, numune hazırlamanın önceki adımından etkilenebilir, bu nedenle numune yüklemeden önce pH değerini kontrol etmek önemlidir. pH kaydırılırsa, pH'ı 3.0'a ayarlamak için örneklere asetik asit veya sodyum hidroksit ekleyerek. Fosfopenptitlerin C18 sahne ucuna eşzamanlı olarak elüsyon ve yüklenmesi için bu protokolü uygularız. Bu nedenle, ACN konsantrasyonunun% 5'in altında olduğundan emin olmak için fosfopenptid elution'dan önce IMAC sahne ucunun aşındırılması önemlidir.
Kesir sayısı karmaşıklığa ve örnek boyutlarına bağlıdır. Tipik olarak, bitkilerde fosfopenptid tanımlamasının geniş kapsamını sağlamak için 5 ila 8 fraksiyon yeterlidir. Kesir tamponlarındaki ACN konsantrasyonu, numunelerin hidrofobikliğine göre ayarlanabilir. Fosfopenptitlerin çoğu% 5 ila% 25 ACN konsantrasyonu kullanılarak C18 boncuklarından elde edilir. Fosfopenptitler tipik olarak fosfat grubunun ek negatif yükleri nedeniyle fosforilasyonsuz peptitlere kıyasla daha hidrofiliktir. Bununla birlikte, peptid N-terminusunda TMT reaktifinin etiketlenmesi, etiketli peptitlerin hidrofobikliğinin artmasına yol açar27, bu, durumumuzda ilk iki fraksiyonda neden daha az fosfopenptit tanımlandığını açıklayabilir (Şekil 2A). Bu nedenle, her kesir arabelleğindeki kesir sayısını ve ACN konsantrasyonunu değerlendirmek için bir TMT-sıfır reaktifi ve bir aliquot numunesi kullanan bir test kullanılabilir. Optimize edilmiş tamponlar, TMT-6plex etiketli fosfopenptidlerin daha iyi ayrılmasına neden olabilir.
Aşama ipucu tabanlı kesir sınırlamaları kesir sayısı ve ipuçlarının kapasitesidir. Aşama ucu fraksiyonasyonu için süreksiz degrade arabellekler kullanıldığından, aşama ucu ayrımında kesir sayısını genişletmek zordur. Öte yandan, yüksek kesirli bir sayı elde etmek için HPLC sütunlarına sürekli bir degrade uygulanabilir. İpuçlarının kapasitesi, aşama ipuçlarının uygulanmasını sınırlayan bir başka faktördür. Büyük ölçekli fosfoproteomik analiz için (> 10 mg proteinler), daha fazla C18 boncuk ve fraksiyonasyon ile dolu daha uzun sütun uzunluğu ile HPLC tabanlı zenginleştirme kullanmak daha iyidir, bu da sahne ipuçlarının analitik ölçeğinin ötesindedir. Birlikte ele alındığında, aşama ucu bazlı fosfopenptid zenginleştirme ve fraksiyonasyonu, küçük ve orta ölçekli fosfoproteomik analizler için yararlı bir yöntemdir. Bu yaklaşım, çoklayıcı niceleme elde etmek için izobarik etiketleme ile entegre edilebilir. Sonuçlar ayrıca derinlemesine bitki fosfoproteomik profilleme ve niceleme için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu iş akışı, özel sinyal ağlarının tanımlaması için diğer türler ve farklı doku türleri için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı Grant XDB27040106 tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
