Summary
Présenté ici est une approche phosphoproteomic, à savoir arrêter et aller pointe d’extraction à base de phosphoproteomic, qui fournit un haut débit et une couverture profonde du phosphoprotéome Arabidopsis. Cette approche délimite la vue d’ensemble de la signalisation osmotique de stress dans Arabidopsis.
Abstract
La phosphorylation des protéines est cruciale pour la régulation de l’activité enzymatique et de l’expression des gènes dans un état osmotique. La spectrométrie de masse (MS) à base de phosphoproteomics a transformé la façon d’étudier la transduction du signal végétal. Toutefois, l’exigence d’un grand nombre de matériaux de départ et d’un temps de mesure prolongé de la SP pour atteindre la profondeur de la couverture a été le facteur limitant pour l’étude à haut débit des changements phosphoproteomic mondiaux dans les plantes. Afin d’améliorer la sensibilité et le débit de la phosphoproteomics végétale, nous avons mis au point une approche phosphoproteomics à base de pointes d’extraction (étape) couplée à l’étiquetage Tandem Mass Tag (TMT) pour l’analyse rapide et complète de la perturbation de la phosphorylation des plantes en réponse au stress osmotique. Tirant parti de la simplicité et du débit élevé de la technique de pointe de scène, l’ensemble de la procédure prend environ une heure en utilisant deux pointes pour terminer l’enrichissement du phosphopeptide, la fractionnement et les étapes de nettoyage de l’échantillon, ce qui suggère une utilisation facile à utiliser et une grande efficacité de l’approche. Cette approche fournit non seulement une analyse approfondie de la phosphoproteomics végétale (> 11 000 identification au phosphopeptide), mais démontre également l’efficacité supérieure de séparation (< chevauchement de 5 % ) entre les fractions adjacentes. En outre, le multiplexage a été réalisé à l’aide de l’étiquetage TMT pour quantifier les changements phosphoproteomic des plantes mutantes de type sauvage et de snrk2 decuple. Cette approche a été utilisée avec succès pour révéler les événements de phosphorylation des kinases de type Raf en réponse au stress osmotique, qui met en lumière la compréhension de la signalisation osmotique précoce chez les plantes terrestres.
Introduction
La salinité élevée, la basse température et la sécheresse causent des contraintes osmotiques, qui est un facteur environnemental majeur qui affecte la productivitédes plantes 1,2. La phosphorylation des protéines est l’une des modifications post-translationnelles les plus significatives qui médient la perception et la transduction du signal dans la réponse des plantes au stressosmotique 3,4,5. Kinase 2s de protéine SNF1-connexe (SnRK2s) sont impliqués dans le stress osmotique signalant6. Neuf des dix membres de la famille SnRK2 montrent une activation significative en réponse au stressosmotique 7,8. Le snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutant ayant des mutations dans les dix SnRK2 a montré l’hypersensibilité au stress osmotique. Chez le mutant snrk2-dec, l’accumulation osmotique induite par le stress de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3),de la biosynthèse de l’acide abscisique (ABA) et des expressions géniques est fortement réduite, mettant en évidence le rôle vital des SnRK2 dans les réponses osmotiques au stress6. Cependant, on ne sait toujours pas comment les kinases SnRK2s régulent ces processus biologiques. Le profilage des changements phosphoproteomic en réponse au stress osmotique est un moyen efficace de combler cet écart et de délimifier les mécanismes de défense osmotiques déclenchés par le stress chez les plantes.
La spectrométrie de masse (SP) est une technique puissante pour cartographier le phosphoproteomevégétal 9. La caractérisation du phosphoproteomics végétal, cependant, reste un défi dû à la gamme dynamique du protéome végétal et à la complexité du lysatevégétal 4. Pour surmonter ces défis, nous avons développé un flux de travail phosphoproteomic végétal universel, qui élimine les interférences indésirables telles que des pigments photosynthétiques et des métabolites secondaires, et permettant la couverture profonde du phosphoproteomevégétal 10. Plusieurs méthodes d’enrichissement du phosphopeptide telles que la chromatographie d’affinité irationnelle métallique immobilisée (IMAC) et la chromatographie par oxyde métallique (MOC) ont été développées pour enrichir les phosphopeptides avant l’analyse de la SP11,12,13,14,15,16. Les non-phosphopeptides acides co-purifiant avec les phosphopeptides sont les principales interférences pour la détection du phosphopeptide. Auparavant, nous avons normalisé la valeur du pH et la concentration d’acide organique du tampon de chargement IMAC afin d’éliminer la liaison des non-phosphopeptides, afin d’obtenir plus de 90 % de spécificité d’enrichissement en contournant l’étape de pré-fractionnement11.
La perte d’échantillon dans le processus en plusieurs étapes de l’enrichissement et de la fractionnement de phosphopeptide entrave la sensibilité de l’identification de phosphopeptide et la profondeur de la couverture phosphoproteomic. Les pointes d’arrêt et d’extraction (pointes d’étape) sont des bouts de pipette qui contiennent de petits disques pour plafonner l’extrémité de la pointe, qui peuvent être incorporés avec la chromatographie pour la fractionnement de peptide et lenettoyage 17. La perte d’échantillon pendant la procédure de pointe de l’étape peut être réduite au minimum en évitant le transfert d’échantillon entre les tubes. Nous avons mis en œuvre avec succès la pointe de stade dans Ga3+-IMAC et Fe3+-IMAC pour séparer les peptides phosphorylatés multiples abondants bas des peptides phosphorylatés singly, qui ont amélioré la profondeur du phosphoproteomehumain 15. En outre, l’utilisation de la pointe de phase inversée à pH élevé (Hp-RP) a démontré la couverture plus large du protéome de membrane humaine comparée à celle de l’échange fort de cation (SCX) et de la chromatographie forte d’échange d’anion (SAX)18. Par conséquent, l’intégration des techniques de pointe de scène IMAC et Hp-RP peut augmenter la couverture du phosphoprotéome végétal avec simplicité, haute spécificité et débit élevé. Nous avons démontré que cette stratégie a permis d’identifier plus de 20 000 sites de phosphorylation provenant de semis d’Arabidopsis, ce qui représente une profondeur accrue du phosphoprotéomevégétal 19.
Ici, nous rapportons un protocole phosphoproteomic basé sur la pointe de étape pour le profilage phosphoproteomic dans Arabidopsis. Ce flux de travail a été appliqué pour étudier la perturbation phosphoproteomic des semis mutants de type sauvage et de snrk2-dec en réponse au stress osmotique. L’analyse phosphoproteomic a indiqué les emplacements de phosphorylation impliqués dans l’activation de kinase et la signalisation osmotic tôt de stress. L’analyse comparative des données de phosphoproteome mutant de type sauvage et de snrk2-dec a mené à la découverte d’une cascade de kinase raf-like (RAF)-SnRK2 qui joue un rôle clé dans la signalisation de stress d’osmore dans les usines élevées.
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Protocol
1. Préparation de l’échantillon
- Récolter les semis traités à la lutte et au stress (1 g) dans une feuille d’aluminium et congeler les échantillons dans de l’azote liquide.
REMARQUE : Une concentration plus élevée en protéines est habituellement observée chez les semis vieux de deux semaines que chez les plantes matures. Un gramme de semis génère environ 10 mg de lysate protéique, ce qui est suffisant pour l’analyse de la SP. Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 16 000 x g à l’étape 1. - Moudre les semis congelés en poudre fine à l’aide d’un mortier et d’un pilon remplis d’azote liquide.
- Ajouter 1 mL de tampon de lyse ((6 M guanidine-HCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) avec 10 mM Tris (2 carboxyethyl)phosphine hydrochlorure (TCEP), 40 mM 2-chloroacetamide (CAA), inhibiteur de la protéase et cocktails inhibiteurs de la phosphatase) au mortier et mélanger à l’aide d’un pilon.
- Transférer le lysate de la plante dans un tube de 1,5 mL et chauffer à 95 °C pendant 5 min.
- Placer le tube sur la glace pendant 10 min. Sonicate le tube sur la glace pendant 10 s, pause pendant 10 s, et répéter trois fois.
- Centrifuger le tube pendant 20 min et aliquot 150 μL de lysate végétal dans un tube de 1,5 mL.
- Ajouter 600 μL de 100% de méthanol dans le tube. Vortex et tourner dans le tube.
- Ajouter 150 μL de chloroforme à 100 % dans le tube. Vortex et tourner dans le tube.
- Ajouter 450 μL de ddH2O dans le tube. Vortex et centrifugeuse du tube pendant 3 min.
- Jetez la couche aqueuse supérieure. Ajouter 600 μL de 100% de méthanol dans le tube. Centrifuger le tube pendant 3 min, puis jeter la solution.
- Laver les granulés de protéines avec 600 μL de 100 % de méthanol. Jetez la solution et séchez l’air de la pastille protéique.
- Resuspendez les granulés de protéines en 600 μL de tampon de digestion (désoxycholate de sodium (DDC) de 12 mM/12 mM de sarcosine lauroyle de sodium (SLS) en 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Sonicate le tube jusqu’à ce que la suspension soit homogénéisée.
- Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit BCA et ajustez la concentration à 4 μg/μL avec le tampon de digestion. Transférer 100 μL de lysate (protéines de 400 μg) dans un nouveau tube.
- Ajouter 292 μL de bicarbonate de triéthylammonium de 50 mM (TEAB) et 8 μL de Lys-C (2,5 unité/mL) au tube. Incuber le tube à 37 °C pendant 3 h.
- Ajouter 100 μL de TEAB de 50 mM avec 8 trypsines de μg au tube. Incuber le tube à 37 °C pendant 12 h.
- Ajouter 25 μL d’acide trifluoroacétique (ALE) à 10 % au tube. Vortex et centrifugeuse du tube pendant 20 min à 4 °C.
- Transférer le supernatant dans une colonne de dessalage conditionnée pour le desalage. Séchez l’élixate à l’aide d’un concentrateur de centrifugeuse sous vide.
REMARQUE : Activez la résine avec 1 mL de méthanol suivi de 1 mL de 0,1 % de TFA dans 80 % d’acétyltrile (ACN). Laver le solvant organique avec au moins 3 mL de 0,1 % d’ALE dans 5 % d’ACN. Chargez les échantillons acidifiés de peptide préparés à l’étape 1.16 dans la colonne, puis lavez la colonne avec au moins 3 mL de TFA de 0,1 % dans 5 % d’ACN. D’autres lavages peuvent être nécessaires pour les échantillons à forte concentration de sel. Elute les phosphopeptides avec 1 mL de 0,1% de TFA dans 80% ACN.
2. Étiquetage tandem mass tag (TMT)
- Resuspendez les peptides séchés en 100 μL de 200 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), pH 8.5.
- Dissoudre le réagencé TMT de chaque canal (0,8 mg) dans 40 μL d’ACN anhydre. Vortex le tube de reagent TMT pendant 5 min et tournez-le vers le bas.
- Transférer 40 μL de TMT dans le tube de l’échantillon et incuber pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Dans cette expérience, le canal 126 à 128 a été étiqueté avec trois répliques biologiques des plantes sans traitement de mannitol, et le canal 129 à 131 ont été étiquetés avec trois répétitions biologiques des usines avec le traitement de mannitol. - Ajouter 8 μL d’hydroxylamine à 5 % et incuber pendant 15 min.
- Mélanger 6 échantillons dans un tube de 5 mL et ajouter 14 μL de 10 % de TFA.
- Ajouter 3 876 μL de 0,1 % de TFA au tube. Vortex et spin down.
- Transférez la solution dans une colonne de dessalage conditionnée pour le dessalage. Séchez l’allongement à l’aide d’un évaporateur.
3. Préparation de la pointe de scène de l’IMAC
- Utilisez une aiguille émoussée de 16 G pour pénétrer dans un disque frit en polypropylène.
REMARQUE : Maintenez le cutter perpendiculairement à la surface du disque et roulez le coupeur quelques fois pour vous assurer que le disque est complètement excisé. Placer le disque dans une boîte de Pétri pour le stockage. Placez l’aiguille dans une pointe de pipette de 200 μL et poussez la frite dans la pointe à l’aide d’un piston. - Appuyez doucement sur la frite dans la pointe à l’aide d’un piston pour couronner l’extrémité de la pointe.
- Placez le disque frit dans des pointes avec la même pression, ce qui offre une meilleure reproductibilité. La reproductibilité de la production de pointes de stade est importante pour la pression constante du dos, ce qui affecte le moment des étapes de centrifugeuse et la reproductibilité entre les répliques techniques.
- Si les pointes de scène montrent une pression arrière élevée pendant l’étape de conditionnement, jetez les pointes pour éviter l’obstruction potentielle de pointe lors du chargement des échantillons. Il se peut que le disque ait été pressé trop fort en position.
- Inverser la colonne de spin Ni-NTA et la placer sur un tube de 1,5 mL.
- Utilisez un piston pour presser doucement la frite de perles Ni-NTA et pousser les perles dans le tube.
REMARQUE : Assurez-vous de pousser le frit doucement pour éviter la perte potentielle de perles ou l’adsorption sur la colonne de rotation.
4. Préparation de la pointe d’étape hp-RP
- Préparez la pointe de scène Hp-RP telle que décrite pour la pointe de scène IMAC à l’aide d’un disque C8.
REMARQUE : N’appliquez pas une grande force sur le disque, car cela peut entraîner une frite densément emballée et augmenter la pression arrière de la pointe de la scène. Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 1 000 x g pendant 5 minutes à l’étape 4. - Suspendre 1 mg de perles C18 dans 100 μL 100% méthanol et passer la solution perles à travers la pointe.
- Ajouter 20 μL de tampon 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) à la pointe de l’étape et passer tampon 8 à travers la pointe par centrifugation.
- Ajouter 20 μL de tampon A (200 mM NH4HCO2) à la pointe de l’étape et passer le tampon A à travers la pointe par centrifugation.
REMARQUE : Équilibrez la centrifugeuse pendant l’utilisation et assurez-vous que la pointe de l’étape Hp-RP n’est pas complètement séchée.
5. Préparation de l’adaptateur de spin
- Utilisez des pinces à épiler pointues pour percer un trou au centre du couvercle d’un tube de 1,5 mL.
- Insérez la pointe de scène IMAC ou la pointe de scène Hp-RP dans le trou de l’adaptateur de spin.
REMARQUE : Assurez-vous que la pointe de la scène n’est pas près du fond de l’adaptateur de spin.
6. Enrichissement au phosphopeptide à l’aide de la pointe du stade IMAC
- Suspendre les perles Ni-NTA de 10 mg avec 400 μL de tampon de chargement (6 % d’acide acétique (AA), pH 3,0) et charger toutes les perles de solution par pointe. Passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 200 x g pendant 3 min à l’étape 6 en plus de l’étape 6.8. - Chargez 100 μL d’acide éthylèneediaminetetraacetic de 50 mM (EDTA) pour dépouiller les ions nickel de la pointe du stade IMAC et passer la solution à travers la pointe par centrifugation.
- Chargez 100 μL de tampon de chargement jusqu’à la pointe de l’étape et passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
- Chargez 100 μL de 50 mM FeCl3 en 6% AA jusqu’à la pointe du stade et passez la solution à travers la pointe par centrifugation. Fe3+ ions se chélate à la pointe étape IMAC.
- Chargez 100 μL de tampon de chargement pour conditionner la pointe de l’étape et passer la solution à travers la pointe par centrifugation.
- Chargez 100 μL de tampon de chargement avec des peptides d’échantillon préparés à l’étape 2.7 jusqu’à la pointe de l’étape et passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
REMARQUE : Prenez un nouveau tube comme adaptateur de spin pour recueillir l’écoulement de l’échantillon et entreposer le flux dans le congélateur pour une analyse future. - Chargez 100 μL de tampon de lavage (4,5% AA et 25% ACN) jusqu’à la pointe du stade et passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
- Effectuez le deuxième lavage avec tampon de chargement. Chargez 100 μL de tampon de chargement jusqu’à la pointe du stade et passez la solution à travers la pointe à l’aide de 1000 × g centrifugeuse pendant 3 min.
REMARQUE : Assurez-vous que le tampon de lavage est remplacé par un tampon de chargement dans la pointe de l’étape afin d’éliminer la perte de phosphopeptides pendant l’étape d’élitution. Equilibrer la pointe du stade de l’IMAC avant l’éution du phosphopeptide pour s’assurer que la concentration d’ACN est inférieure à 5 %. - Coupez la pointe de scène IMAC à l’avant avec un ciseaux et placez la pointe de scène IMAC taillée à l’intérieur de la pointe Hp-RP. Assurez-vous que les deux couches de pointes de scène ne touchent pas le couvercle de la centrifugeuse.
7. Fractionnement du phosphopeptide à l’aide de la pointe de l’étape Hp-RP C18
- Ajouter 100 μL de tampon d’élitution (phosphate d’ammonium de 200 mM (NH4H2PO4))à la pointe de scène IMAC parée et passer la solution à travers les deux couches de pointes de scène par centrifugation.
REMARQUE : Si la solution ne passe pas à travers la pointe de l’étape, augmentez la vitesse de rotation vers le bas. Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 1 000 x g pendant 5 minutes à l’étape 7. Tous les tampons Hp-RP sont répertoriés dans le tableau 1. - Jetez la pointe de scène IMAC à l’aide d’une pince à épiler et ajoutez 20 μL de tampon A à la pointe de l’étape Hp-RP et passez le tampon à travers la pointe par centrifugation.
REMARQUE : Assurez-vous que tout le tampon d’éution passe à travers la pointe de l’étape IMAC avant de la jeter. - Ajouter 20 μL de tampon 1 à la fraction 1 et recueillir l’élitate dans un nouveau tube par centrifugation. Répétez le processus avec les tampons 2, 3, 4, 5, 6, 7 et 8 pour recueillir chaque fraction dans un nouveau tube. Séchez l’allongement final de chaque fraction à l’aide d’un concentrateur à vide.
REMARQUE : Préparez de nouveaux tampons de fractionnement. Prenez 8 nouveaux tubes comme adaptateur de spin de chaque fraction. Recueillir l’allongement de chaque fraction dans un adaptateur de spin différent. Les phosphopeptides ne sont pas stables dans des conditions de base, de sorte que sécher les évasés par un concentrateur ou acidifié par 10% TFA immédiatement.
8. Analyse LC-MS/MS et analyse des données
- Ajouter 5 μL d’acide formique (FA) de 0,1 % et analyser l’échantillon à l’amiomètre de masse.
- Exécutez un gradient de 90 min avec un tampon B de 6 à 30 % (80 % d’ACN et 0,1 % de FA) pour chaque fraction.
- Fragmenter les 10 peptides les plus marqués à l’aide d’une dissociation énergétique à haute collision (HCD). Effectuer une recherche de base de données pour identifier les sites de phosphorylation.
- Chargez les fichiers bruts dans le logiciel MaxQuant, nommez les expériences et définissez des fractions et PTM.
REMARQUE: Le tutoriel du logiciel MaxQuant peut être trouvé à https://www.maxquant.org/. - Sélectionnez reporter ion MS2 dans le type de LC-MS/MS run et 6plex TMT sous forme d’étiquettes isobariques. Activer le filtre par fonction PIF et définir le min PIF comme 0,75.
- Sélectionnez Acétyl (protéine N-term), oxydation (M) et phospho (STY) au panneau de modifications variables. Sélectionnez Carbamidomethyl (C) comme modifications fixes.
- Définissez le mode de digestion comme spécifique, sélectionnez Trypsin/P comme enzyme de digestion, et deux clivages manqués.
- Définissez le taux de fausse découverte psm (FDR) et la protéine FDR comme 0,01. Définissez le score minimum pour les peptides modifiés comme 40.
- Ajoutez la base de données Arabidopsis thaliana au panel de fichiers fasta et exécutez la recherche de bases de données.
- Chargez le fichier txt des sites Phospho (STY) sur le logiciel Perseus au fur et à mesure que la recherche est effectuée.
REMARQUE : Les didacticiels détaillés du logiciel Persée peuvent être trouvés https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtrer les sites de phosphorylation inverse. Filtrer les sites de phosphorylation non localisés en utilisant la probabilité de localisation de 75 % comme coupure.
- Utiliser les intensités des sites de phosphorylation pour l’analyse statistique.
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Representative Results
Pour démontrer les performances de ce flux de travail, nous avons exploité la pointe de scène IMAC couplée à la fractionnement de pointe de stade Hp-RP pour mesurer les changements phosphoproteomic dans les semis mutants de type sauvage et snrk2-dec avec ou sans traitement de mannitol pendant 30 minutes. Chaque échantillon a été effectué dans des triplicates biologiques, et le flux de travail expérimental est représenté à la figure 1. Les peptides digérés (400 μg) de chaque échantillon ont été étiquetés avec un canal TMT-6plex, mis en commun et désaltés. Les phosphopeptides ont été enrichis à l’aide d’une pointe de scène IMAC, et les phosphopeptides purifiés ont ensuite été fractionnés en huit fractions par une pointe de scène Hp-RP. Chaque fraction a été analysée par une analyse de gradient de LC de 90 min. Les fichiers bruts ont été recherchés à l’aide d’un moteur de recherche contre la base de données Arabidopsis thaliana.
Un total de 11 077 phosphopeptides uniques ont été identifiés correspondant à 3 630 phosphoprotéines avec 6 852 sites localisés de phosphorylation (classe I, probabilité de localisation > 0,75), ce qui indique la large couverture du phosphoprotéome arabidopsis. Un total de 8 107 et 7 248 phosphopeptides ont été identifiés à partir d’échantillons mutants de type sauvage et de snrk2-dec, respectivement. Cela illustre l’efficacité du flux de travail en fournissant une couverture approfondie pour délimité la vision globale de la transduction du signal dans Arabidopsis. Nous avons comparé le nombre de phosphopeptides identifiés sur 8 fractions. Quelques phosphopeptides ont été identifiés dans les deux premières fractions, la fraction 1 et 2. Toutefois, la majorité des phosphopeptides ont été répartis uniformément dans les 6 fractions les plus importantes (figure 2A), ce qui suggère que cette approche permet de séparer les phosphopeptides complexes du phosphoprotéome végétal. Afin de démontrer davantage l’efficacité de séparation de ce flux de travail, nous avons évalué le chevauchement des phosphopeptides entre deux fractions adjacentes (eq. F1-to-F2). Moins de 5 % de phosphopeptides se chevauchent dans les fractions adjacentes, ce qui indique une efficacité de fractionnement robuste de la pointe de l’étape Hp-RP (figure 2B).
En utilisant les données obtenues par le flux de travail, nous avons comparé les profils phosphoproteomic de type sauvage et mutant snrk2-dec sur le traitement au mannitol. Un total de 433 et 380 emplacements de phosphorylation ont été augmentés après traitement de mannitol dans l’échantillon mutant sauvage-type et snrk2-dec, respectivement (figure 3). Parmi ceux-ci, 312 phosphosites ont montré l’induction (FDR et 0,01) dans le type sauvage, mais pas dans les plantes mutantes snrk2-dec. L’analyse de Gene Ontology (GO) a révélé que la fonction de phosphorylation et d’activation de la kinase protéique, la régulation du processus métabolique du phosphate, la transduction du signal, sont significativement enrichies dans les phosphoprotéines dépendantes du SnRK2. Fait intéressant, le terme GO lié au développement des racines a également été enrichi dans le groupe dépendant du SnRK2, compatible avec le phénotype du retard de croissance des racines sous l’effort osmotique6. Nous avons également identifié 116 phosphosites jusqu’à régulées par le traitement au mannitol chez les mutants de type sauvage et snrk2-dec. Ces phosphoprotéines étaient indépendantes de SnRK2, ou des candidats qui médient la signalisation osmotique déclenchée par le stress avant l’activation de SnRK2s. Nous avons observé que plusieurs RAF du sous-groupe B4 tels que RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) et RAF42 (AT3G46920) étaient significativement régulés par le stress osmotique. Une étude plus approfondie a révélé que les kinases RAF sont rapidement activées par le stress osmotique et nécessaires à la phosphorylation et à l’activation des SnRK2s20.
Figure 1 : Flux de travail de la méthode phosphoproteomic à base de pointes de stade. La protéine a été extraite et digérée à partir de semis mutants de type sauvage et snrk2-dec traités avec ou sans mannitol. Les peptides digérés de chaque réplique ont été étiquetés avec un canal TMT6-plex unique. Les phosphopeptides ont été mis en commun, puis enrichis à l’aide d’une pointe de scène IMAC. Les phosphopeptides purifiés ont été séparés par une pointe d’étape hp-RP. Chaque fraction a été analysée par spectromètre de masse. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Profilage phosphoproteomic des semis mutants de type sauvage et snrk2 par pointe de scène IMAC et fractionnement Hp-RP. (A) Le nombre de phosphopeptides identifiés par fraction. (B) L’efficacité de séparation de la chromatographie Hp-RP basée sur la pointe de la scène. Le chevauchement entre les fractions adjacentes est représenté par le pourcentage du même peptide identifié dans les fractions adjacentes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Quantification des changements phosphoproteomic en réponse au stress osmotique. Les parcelles volcaniques montrent le changement de pli log2 des sites de phosphorylation dans (A) de type sauvage et (B) snrk2-dec semis mutants en réponse au traitement au mannitol. Le cercle noir représente les sites de phosphorylation de kinase induits par le mannitol. Le cercle rouge indique les sites de phosphorylation des RAF régulés en réponse au mannitol. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampon A | Formate ammonium de 200 mM (NH4HCO2), pH 10,0. | |
| Tampon B | 100% ACN. | |
| Tampon 1 | 5% Tampon B, 95% Tampon A. | |
| Tampon 2 | 8% Tampon B, 92% Tampon A. | |
| Tampon 3 | 11% Tampon B, 89% Tampon A. | |
| Tampon 4 | 14% Tampon B, 86% Tampon A. | |
| Tampon 5 | 17% Tampon B, 83% Tampon A. | |
| Tampon 6 | 20% Tampon B, 80% Tampon A. | |
| Tampon 7 | 23% Tampon B, 77% Tampon A. | |
| Tampon 8 | 80% Tampon B, 20% Tampon A. | |
Tableau 1 : Tampons pour la fractionnement de pointe de l’étape Hp-RP.
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Discussion
La plage dynamique et la complexité du protéome végétal et du phosphoprotéome sont toujours un facteur limitant à la profondeur des analyses phosphoproteomics. Malgré la capacité de l’analyse LC-MS/MS à durée unique d’identifier 10 000 sites de phosphorylation21,22, la couverture de l’ensemble du phosphoprotéome végétal est encore limitée. Par conséquent, un flux de travail phosphoproteomic qui fournit une sensibilité élevée et une efficacité de séparation supérieure est nécessaire pour profiler la vue globale des réseaux de signalisation végétale en réponse au stress environnemental. La chromatographie commerciale à haute pression à base de colonnes à haute pression (HPLC) est une méthode courante pour réduire la complexité du peptide avant l’analyse de laSP 23,24. Toutefois, les étapes fastidieuses de collecte d’échantillons et le volume d’élitution important sont les principaux défis des méthodes basées sur hplc en termes de sensibilité et de débit. la pointe d’étape est une approche alternative pour exécuter la pré-fractionnement ou l’enrichissement de peptide pour des travaux à haute sensibilité et à haut débit. Ce nouveau flux de travail phosphoproteomic exploitant l’étiquetage isobarique couplé avec l’enrichissement et la fractionnement de phosphopeptide fournit une meilleure couverture et profondeur de phosphoproteomics végétaux au-dessus d’autres workflows phosphoproteomic25,26.
La valeur pH des échantillons est le facteur crucial qui détermine la spécificité d’enrichissement des phosphopeptides. La valeur du pH peut être affectée par l’étape précédente de la préparation de l’échantillon, il est donc essentiel de vérifier la valeur du pH avant le chargement de l’échantillon. Si le pH est déplacé, ajouter de l’acide acétique ou de l’hydroxyde de sodium aux échantillons pour ajuster le pH à 3,0. Nous exécutons ce protocole pour l’éution simultanée et le chargement des phosphopeptides sur la pointe de l’étape C18. Par conséquent, il est important d’équilibrer la pointe du stade de l’IMAC avant l’éution du phosphopeptide afin de s’assurer que la concentration d’ACN est inférieure à 5 %.
Le nombre de fractions dépend de la complexité et de la taille des échantillons. En règle générale, 5 à 8 fractions sont suffisantes pour fournir une large couverture de l’identification du phosphopeptide chez les plantes. La concentration d’ACN dans les tampons de fractionnement peut être ajustée en fonction de l’hydrophobicité des échantillons. La plupart des phosphopeptides sont éfuqués des perles C18 en utilisant la gamme de 5% à 25% de concentration d’ACN. Les phosphopeptides sont généralement plus hydrophiles que les peptides non phosphorylatés en raison des charges négatives supplémentaires du groupe phosphaté. Cependant, l’étiquetage du reagent TMT sur N-terminus de peptide conduit à une augmentation de l’hydrophobicité des peptidesétiquetés 27, ce qui peut expliquer pourquoi moins de phosphopeptides ont été identifiés dans les deux premières fractions dans notre cas (Figure 2A). Ainsi, un test à l’aide d’un reagent TMT-zero et d’un aliquot d’échantillons peut être utilisé pour évaluer le nombre de fractions et la concentration d’ACN dans chaque tampon de fractionnement. Les tampons optimisés peuvent se traduire par une meilleure efficacité de séparation des phosphopeptides étiquetés TMT-6plex.
Les limites de la fractionnement à base de pointes de stade sont le nombre de fractions et la capacité des pourboires. Il est difficile d’augmenter le nombre de fractions dans la séparation des pointes de stade parce que les tampons de gradient discontinus sont utilisés pour la fractionnement des pointes de scène. D’autre part, un gradient continu peut être appliqué sur les colonnes HPLC pour atteindre un nombre élevé de fractions. La capacité des pourboires est un autre facteur qui limite l’application des conseils de scène. Pour l’analyse phosphoproteomics à grande échelle (> 10 mg de protéines), il est préférable d’utiliser l’enrichissement à base de HPLC avec une longueur de colonne plus longue emballée avec plus de perles C18 et la fractionnement, qui est au-delà de l’échelle analytique des pointes de stade. Pris ensemble, l’enrichissement et la fractionnement du phosphopeptide à base de pointes de stade est une méthode utile pour les analyses phosphoproteomics à petite et moyenne échelle. Cette approche peut être intégrée à l’étiquetage isobarique pour parvenir à une quantification multiplexe. Les résultats ont également démontré qu’il pourrait être utilisé pour le profilage et la quantification en profondeur de la phosphoprotéomics végétale. Ce flux de travail s’applique à d’autres espèces et à différents types de tissus pour la délimitation de réseaux de signalisation spécialisés.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le Programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des sciences, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
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