Summary
ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。
Abstract
タンパク質リン酸化は、浸透状態下での酵素活性と遺伝子発現の調節に不可欠です。質量分析法(MS)ベースのホスホプロテオミクスは、植物シグナル伝達の研究方法を変えました。しかし、カバレッジの深さを達成するための多くの出発材料と長期のMS測定時間の要件は、植物の世界的なホスホプロテオミクス変化のハイスループット研究の制限要因となっています。植物ホスホプロテオミクスの感度とスループットを向上させるために、浸透応力に応答して植物リン酸化摂動の迅速かつ包括的な分析のためのタンデムマスタグ(TMT)標識と相まって、ストップアンドゴー抽出(ステージ)チップベースのホスホプロテオミクスアプローチを開発しました。ステージチップ技術のシンプルさと高スループットを活用して、全体の手順は、リンペプチド濃縮、分画、およびサンプルクリーニングステップを完了するために2つのヒントを使用して約1時間を要し、アプローチの使いやすく、高い効率を示唆しています。このアプローチは、植物のリンプロテオミクス分析(>11,000リンペプチド同定)を提供するだけでなく、隣接する分画間の優れた分離効率(<5%のオーバーラップ)を示します。また、TMT標識を用いて多重化が行われ、野生型および snrk2 デクプル変異型植物のホスホプロテオミクス変化を定量化した。このアプローチは、陸上植物における初期の浸透シグナル伝達の理解に光を当てる浸透性ストレスに応答して、Raf様キナーゼのリン酸化事象を明らかにするためにうまく使用されている。
Introduction
高いサリン性、低温、干ばつは浸透応力を引き起こし、これは植物の生産性1,2に影響を与える主要な環境要因である。タンパク質リン酸化は、浸透ストレス3、4、5に対する植物応答におけるシグナル知覚および伝達を媒介する最も重要な翻訳後修飾の1つである。SNF1関連プロテインキナーゼ2s(SnRK2s)は、浸透性ストレスシグナル伝達6に関与している。SnRK2ファミリーの10人のメンバーのうち9人は、浸透性ストレス7、8に応答して有意な活性化を示す。snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 10デクサプル(snrk2-dec)全10個のSnRK2に変異を有する変異体は、浸透圧ストレスに対する過敏症を示した。snrk2-dec変異体において、イノシトール1,4,5-トリスリン酸(IP3)の浸透ストレス誘導蓄積、アブシジン酸(ABA)生合成、および遺伝子発現が強く減少し、浸透応力応答におけるSnRK2sの重要な役割を強調する6。しかし、SnRK2sキナーゼがこれらの生物学的プロセスをどのように調節するのかはまだ不明である。浸透性ストレスに応答してホスホプロテオミクスの変化をプロファイリングすることは、このギャップを埋め、植物の浸透性ストレス誘発防御メカニズムを引き出す効率的な方法です。
質量分析法(MS)は植物ホスホプロテオーム9をマッピングするための強力な技術です。しかし、植物ホスホプロテオミクスの特性評価は、植物プロテオームのダイナミックレンジと植物のリセート4の複雑さのために依然として課題である。これらの課題を克服するために、光合成顔料や二次代謝産物などの望ましくない干渉を排除し、植物ホスホプロテオーム10の深い被覆を可能にする普遍的な植物ホスホプロテオミクスワークフローを開発しました。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)や金属酸化物クロマトグラフィー(MOC)などのいくつかのリンペプチド濃縮方法は、MS分析11、12、13、14、15、16の前にリンペプチドを濃縮するために開発されています。リンペプチドと共に精製する酸性非リンペプチドは、リンペプチド検出のための主要な干渉である。以前は、非リンペプチドの結合を排除するためにIMACローディングバッファーのpH値および有機酸濃度を標準化し、前分画工程11をバイパスして90%以上の濃縮特異性を得た。
リンペプチド濃縮および分画の多段階プロセスにおけるサンプル損失は、リンペプチド同定の感度およびリンタンパク質被覆の深さを妨げる。ストップアンドゴー抽出のヒント(ステージのヒント)は、先端の端部をキャップする小さなディスクを含むピペットチップであり、ペプチド分画および洗浄17のためのクロマトグラフィーと組み込むことができる。段階の先端プロシージャの間のサンプル損失は管間のサンプルの移動を避けることによって最小にすることができる。Ga3+-IMACおよびFe3+-IMACでは、低い多量リン酸化ペプチドを単一リン酸化ペプチドから分離し、ヒトホスホプロテオーム15の深さを改善したステージチップの導入に成功しました。また、高pH逆相(Hp-RP)ステージ先端の使用は、強いカチオン交換(SCX)および強いアニオン交換(SAX)クロマトグラフィー18と比較して、ヒト膜プロテオームの広い範囲を実証している。そのため、IMAC と Hp-RP ステージチップ技術を統合することで、簡単さ、高い特異性、高スループットで植物のホスホプロテオームのカバレッジを向上させることができます。我々は、この戦略が、植物ホスホプロテオーム19の強化された深さを表す、シロイヌナズナの苗から20,000以上のリン酸化部位を同定したことを実証した。
ここでは、 シロイヌナズナ におけるホスホプロテオミクスプロファイリングのためのステージ先端ベースのホスホプロテオミクスプロトコルを報告する。このワークフローは、浸透応力に応答して野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス摂動を研究するために適用された。ホスホプロテオミクス解析では、キナーゼ活性化と初期浸透ストレスシグナル伝達に関与するリン酸化部位が明らかになった。野生型と snrk2-dec 変異型ホスホプロテオームデータの比較分析は、高植物におけるオスモアストレスシグナル伝達において重要な役割を果たすRaf様キナーゼ(RAF)-SnRK2キナーゼカスケードの発見を導いた。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. サンプル準備
- コントロールとストレス処理苗(1 g)をアルミニウム箔で収穫し、液体窒素でサンプルを凍結フラッシュします。
注:通常、成熟した植物よりも2週齢の苗からより高いタンパク質濃度が観察されます。1グラムの苗木は約10mgのタンパク質ライセートを生成し、MS分析には十分です。すべての遠心段階は、ステップ1で16,000 x g で行われます。 - 液体窒素で満たされた乳鉢と害虫を使用して、冷凍苗を細かい粉末に粉砕します。
- 10 mM トリス(2-カルボキセチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、40 mM 2-クロロアセタミド(CAA)、プロテアーゼおよびインヒビターアセクターゼ阻害剤を1mL加えて、乳鉢の中で、100 mMトリス-HCl、pH 8.5)を加えて、乳鉢を混ぜます。
- 植物のライゼートを1.5mLチューブに移し、95°Cで5分間加熱します。
- チューブを氷の上に10分間置きます。10 sの氷の上にチューブを超音波処理し、10 sのために一時停止し、3回繰り返します。
- 20分間チューブを遠心分離し、植物の150 μLを1.5 mLチューブに入れ、
- チューブに600μLの100%メタノールを加えます。渦とチューブをスピンダウン。
- 100%クロロホルムの150μLをチューブに加えます。渦とチューブをスピンダウン。
- 450 μLの ddH2O をチューブに加えます。3分間のボルテックスと遠心分離管。
- 上の水層を破棄します。チューブに600μLの100%メタノールを加えます。チューブを3分間遠心し、溶液を捨てます。
- 600 μLのメタノールを600 μLで洗浄します。溶液を捨て、空気乾燥してプロテインペレットを乾燥させます。
- タンパク質ペレットを600 μLの消化バッファー(12 mM ナトリウムデオキシコール酸ナトリウム(SDC)/12 mM ラウロイルサルコシナートナトリウム(SLS)を 100 mM Tris-HCl、pH 8.5 で再懸濁します。懸濁液が均質化されるまでチューブを超音波処理します。
- BCAキットを使用してタンパク質濃度を測定し、消化バッファーで濃度を4 μg/μLに調整します。100 μLのライセート(400 μgタンパク質)を新しいチューブに移します。
- 292 μLの50 mMの重炭酸トリエチラムモニウム(TEAB)と8 μLのLys-C(2.5単位/mL)をチューブに加えます。37°Cで3時間インキュベートする。
- チューブに8 μgのトリプシンを含む50 mM TEABの100 μLを加えます。37°Cで12時間インキュベートする。
- 25 μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)をチューブに加えます。4°Cで20分間、ボルテックスと遠心分離機を使用します。
- 上清を、脱塩用のコンディショニングデソルトカラムに移します。真空遠心濃縮器を使用して溶出液を乾燥させます。
注:メタノール1mLで樹脂を活性化し、その後に0.1%TFAの1mLを80%アセトニトリル(ACN)で活性化します。5%ACNで0.1%TFAの少なくとも3 mLの有機溶媒を洗い流してください。工程1.16で調製した酸性化ペプチドサンプルをカラムにロードし、その後、少なくとも3 mLの0.1%TFAを5%ACNで洗浄した。高塩濃度のサンプルに対して、より多くのせい剤が必要な場合があります。80% ACNで0.1%TFAの1 mLでリンペプチドをエルプ。
2. タンデムマスタグ(TMT)ラベル付け
- 乾燥したペプチドを100 μLの200 mM 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)、pH 8.5に再懸濁します。
- 各チャネル(0.8mg)のTMT試薬を40μLの無水ACNに溶解します。5分間のTMT試薬チューブをボルテックスし、それをスピンダウンします。
- 40 μLのTMTをサンプルチューブに移し、室温で1時間インキュベートします。
注:この実験では、チャネル126〜128をマンニトール処理なしで植物の3つの生物学的複製で標識し、チャネル129〜131はマンニトール処理を伴う植物の3つの生物学的複製で標識した。 - 5%のヒドロキシルアミンを8μL加え、15分間インキュベートします。
- 5 mLチューブに6サンプルを混ぜ、10%TFAの14 μLを加えます。
- チューブに0.1%TFAの3,876 μLを加えます。渦とスピンダウン。
- 溶液を、脱塩用のコンディショニング脱塩カラムに移します。エマルエーターを使用して溶出物を乾燥させます。
3. IMAC ステージチップの作成
- ポリプロピレンフリットディスクを貫通するために16G鈍エンドの針を使用してください。
注: ディスクの表面に対してカッターを垂直に保持し、カッターを数回ロールして、ディスクが完全に切除されていることを確認します。保管のためにペトリ皿にディスクを置きます。針を200μLのピペットチップに入れ、プランジャーを使用してフリットを先端に押し込みます。 - プランジャーを使用して先端にそっとフリットを押し込み、先端の端をキャップします。
- 同じ圧力でフリットディスクをチップに入れ、再現性を向上させます。ステージチップの再現性は、遠心分離機のタイミングと技術的な複製の再現性に影響を与える一定の背圧にとって重要です。
- ステージのヒントがコンディショニングステップ中に高い背圧を示す場合は、サンプルをロードする際にチップが詰まらないようにチップを捨てます。ディスクが強く押し込みすぎて位置に収められている可能性があります。
- Ni-NTAスピンカラムを反転し、1.5 mLチューブに配置します。
- プランジャーを使用してNi-NTAビーズのフリットを軽く押し、ビーズをチューブに押し込みます。
注:スピンカラムでビードの損失や吸着を防ぐために、フリットを軽く押してください。
4. Hp-RP ステージチップの準備
- C8 ディスクを使用して IMAC ステージチップの説明に従って、Hp-RP ステージチップを準備します。
注:ディスクに大きな力を加えないでください。すべての遠心段階はステップ4の5分のための1,000 x g で行われる。 - 100 μL 100%メタノールに1mgのC18ビーズをサスペンドし、ビーズ溶液をチップに通します。
- 20 μLのバッファー 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2、pH10.0) をステージチップに加え、遠心分離によりチップを通過してバッファー 8 を通過します。
- ステージ先端にバッファA(200 mM NH4HCO2)の20μLを加え、遠心分離によって先端を通してバッファAを通過します。
注:使用中に遠心分離機のバランスをとり、Hp-RPステージチップが完全に乾燥していないことを確認してください。
5. スピンアダプターの準備
- 1.5 mLチューブの蓋の中央に穴を穿刺するために鋭い端ピンセットを使用してください。
- スピンアダプタの穴にIMACステージチップまたはHp-RPステージチップを挿入します。
メモ:ステージの先端がスピンアダプタの底部に近くないことを確認します。
6. IMAC ステージチップを用いたリンペプチド濃縮
- 400 μLのローディングバッファー(6%酢酸(AA)、pH 3.0)を含む 10 mg の Ni-NTA ビーズをサスペンドし、すべてのビーズ溶液をチップごとにロードします。遠心分離によって先端を通して溶液を渡す。
注:すべての遠心段階のステップはステップ6.8以外のステップ6で3分の200 x g で行われます。 - 50 mM エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の100 μLを負荷し、IMAC ステージチップからニッケルイオンを取り除き、遠心分離によって溶液を先端に通します。
- 100 μLの負荷バッファをステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を渡します。
- 50 mM FeCl3 の 100 μL を 6% AA でステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。Fe3+ イオンはIMACステージチップにキレートします。
- 100 μLの負荷バッファをロードしてステージチップを調整し、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。
- ステップ2.7で調製したサンプルペプチドを用いた負荷バッファーの100 μLをステージ先端にロードし、遠心分離により溶液を先端に通します。
注:新しいチューブをスピンアダプタとして取り、サンプルのフロースルーを収集し、フロースルーを冷凍庫に保存して今後の解析を行います。 - 100 μLの洗浄バッファー (4.5% AA および 25% ACN) をステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。
- 2回目の洗浄は、ローディングバッファで行います。100 μLの負荷バッファをステージチップにロードし、1000×g遠心分離機を使用してチップを通して溶液を3分間渡します。
注:洗浄バッファーをステージチップにローディングバッファで置き換え、溶出工程中のリンペプチドの損失を排除します。リンペプチド溶出前にIMACステージ先端を平衡化し、ACNの濃度が5%未満であることを確認した。 - IMAC ステージの先端をハサミで前面にトリムし、トリミングした IMAC ステージチップを Hp-RP チップの内側に配置します。ステージの先端の2つの層が遠心分離機のふたに触れないようにしてください。
7. Hp-RP C18ステージチップを使用したリンペプチド分画
- 100 μL の溶出バッファー (200 mM リン酸アンモニウム (NH4H2PO4))をトリミングした IMAC ステージチップに加え、遠心分離によりステージチップの 2 層を通過します。
メモ:ソリューションがステージチップを通過しない場合は、スピンダウンの速度を上げます。すべての遠心段階はステップ7の5分のための1,000 x g で行われる。Hp-RP バッファはすべて 表 1にリストされています。 - ピンセットを使用してIMACステージチップを廃棄し、20 μLのバッファAをHp-RPステージチップに追加し、遠心分離によって先端を通してバッファを通過させます。
メモ:すべての溶出バッファが破棄する前にIMACステージチップを通過していることを確認してください。 - 20 μLのバッファー 1 を加えて分数 1 を溶出し、遠心分離によって新しいチューブに溶出物を集めます。バッファー 2、3、4、5、6、7、および 8 でプロセスを繰り返し、各分数を新しいチューブに集めます。真空濃縮器を使用して各画分の最終的な溶出物を乾燥させます。
注: 新しい分画バッファを準備します。各画分のスピンアダプターとして8つの新しいチューブを取ります。異なるスピンアダプターで各分数の溶出を収集します。リンペプチドは塩基性条件下では安定ではないので、濃縮器により溶出液を乾燥させるか、または10%TFAで直ちに酸性化する。
8. LC-MS/MS分析とデータ分析
- 0.1%のギ酸(FA)の5μLを加え、質量分析計でサンプルを分析します。
- 各画分に対して、6~30%のバッファB(80%ACNと0.1%FA)で90分の勾配を実行します。
- 高い衝突エネルギー解離(HCD)を用いて上位10個の標識ペプチドをフラグメント化する。データベース検索を完了してリン酸化部位を特定します。
- MaxQuant ソフトウェアに生のファイルをロードし、実験に名前を付け、分数と PTM を設定します。
注: MaxQuant ソフトウェアのチュートリアルは、https://www.maxquant.org/ で見つけることができます。 - LC-MS/MS 実行のタイプでレポーターイオン MS2 を、アイソバリックラベルとして 6plex TMT を選択します。PIF 関数によるフィルターを有効にし、最小 PIF を 0.75 に設定します。
- アセチル(プロテインN-用語)、酸化(M)、およびホスホ(STY)を可変修飾のパネルに選択します。固定修正としてカルバミドメチル(C)を選択します。
- 特定のダイジェストモードを設定し、消化酵素としてトリプシン/Pを選択し、2つの切断を逃しました。
- PSM 偽検出率 (FDR) およびプロテイン FDR を 0.01 に設定します。変更ペプチドの最小スコアを40に設定します。
- ファスタファイルのパネルに シロイヌナナ・タリアナ データベースを追加し、データベース検索を実行します。
- 検索が完了したら、ホスホ (STY) サイトの txt ファイルを Perseus ソフトウェアに読み込みます。
注:ペルセウスソフトウェアの詳細なチュートリアルは、https://www.maxquant.org/perseus/ で見つけることができます。 - 逆リン酸化部位を除外します。ローカライズ確率 75% をカットオフとして使用して、ローカライズされていないリン酸化部位を除外します。
- リン酸化部位の強度を使用して統計分析を行います。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このワークフローの性能を実証するために、IMACステージチップとHp-RPステージチップ分画を利用して、マンニトール処理の有無にかかわらず野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス変化を30分間測定しました。各サンプルは生物学的三数で行われ、実験ワークフローは 図1に示されている。各サンプルの消化されたペプチド(400 μg)を1つのTMT-6plexチャネルで標識し、プールして脱塩した。このリンペプチドをさらにIMACステージチップを用いて濃縮し、精製されたリンペプチドをHp-RPステージチップによって8つの分画に分画した。各画分を90分LC勾配分析で分析した。生ファイルは、 シロイヌナズナのthaliana データベースに対する検索エンジンを使用して検索されました。
6,852の局所リン酸化部位(クラスI、局在化確率>0.75)を有する3,630リン酸化タンパク質に対応する11,077個のユニークなリンペプチドが同定され、シロイヌナズプシスホスホプロテオームの広い範囲を示す。野生型およびsnrk2-dec変異体サンプルからそれぞれ8,107および7,248リンペプチドを同定した。これは、シロイヌナズナのシグナル伝達のグローバルビューを描き出す詳細なカバレッジを提供するワークフローの効率を示しています。同定されたリンペプチドの数を8画分にわたって比較した。いくつかのリンペプチドは、最初の2つの画分、分画1および2で同定された。しかし、大部分のリンペプチドは、残りの6画分(図2A)で均等に分布し、このアプローチは、植物性ホスホプロテオームから複雑なリンペプチドを分離する能力を提供することを示唆している。このワークフローの分離効率をさらに実証するために、2つの隣接する分画(eq. F1-f2)間のリンペプチドの重複を評価した。5%未満のリンペプチドが隣接する画分内で重なり合い、Hp-RPステージ先端の強い分画効率を示す(図2B)。
ワークフローで得られたデータを用いて、マンニントール処理時の野生型および snrk2-dec 変異体のホスホプロテオミクスプロファイルを比較した。野生型および snrk2-dec 変異体試料におけるマンニトール処理後、それぞれ433および380リン酸化部位を増加した(図3)。その中で、312のホスホサイトは野生型で誘導(FDR<0.01)を示したが 、snrk2-dec 変異型植物では示さなかった。遺伝子オントロジー(GO)分析は、リン酸化およびタンパク質キナーゼの活性化の機能、リン酸代謝プロセスの調節、シグナル伝達がSnRK2依存性リンフォタンパク質において有意に富化することを明らかにした。興味深いことに、根の発達に関連するGO用語はSnRK2依存群においても富化され、浸透応力6の下で根成長遅滞の表現型と一致した。また、野生型および snrk2-dec 変異体の両方でマンニトール処理によってアップレギュレートされた116のホスホサイトを同定した。これらのリンタンパク質はSnRK2、またはSnRK2s活性化前に浸透ストレス誘発シグナル伝達を媒介する候補とは無関係であった。我々は、RAF18(AT1G16270)、RAF24(AT2G35050)、RAF42(AT3G46920)などのいくつかのB4サブグループRAFsが浸透ストレスによって有意にアップレギュレートされていることを観察した。さらなる研究は、RAFキナーゼが浸透力学的ストレスによって迅速に活性化され、SnRK2s20のリン酸化および活性化に必要であることを明らかにした。
図1:ステージ先端系ホスホプロテオミクス法のワークフロータンパク質を抽出し、マンニントールの有無にかかわらず処理した野生型および snrk2-dec 変異苗から消化した。各複製の消化されたペプチドを、固有のTMT6-plexチャネルで標識した。リンペプチドをプールし、次いでIMACステージチップを使用して濃縮した。精製されたリンペプチドをHp-RPステージ先端により分離した。各分画を質量分析計で分析した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:IMACステージ先端およびHp-RP分画による野生型およびsnrk2デクプル変異苗のホスホプロテオミクスプロファイリング。(A)1画分当たりの同定されたリンペプチド数。(B) ステージ先端ベースのHp-RPクロマトグラフィーの分離効率。隣接する画分間の重複は、隣接する画分で同定された同一ペプチドの割合で表される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:浸透応力に応答したホスホプロテオミクス変化の定量化。火山プロットは、マンニトール処理に応答して(A)野生型および(B)snrk2-dec変異苗のリン酸化部位の2倍の変化を示す。 黒丸はマンニトールによって誘導されるキナーゼリン酸化部位を表す。赤い円は、マンニトールに応答してアップレギュレートされたRAFsのリン酸化部位を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファ A | 200 mM アンモニウム・フォーマット(NH4HCO2)、pH 10.0 | |
| バッファB | 100%ACN。 | |
| バッファ 1 | 5%バッファB、95%バッファA。 | |
| バッファ 2 | 8%バッファB、92%バッファA。 | |
| バッファ 3 | 11% バッファー B、89% バッファー A。 | |
| バッファ 4 | 14% バッファー B、86% バッファー A。 | |
| バッファ 5 | 17% バッファー B、83% バッファー A。 | |
| バッファ 6 | 20% バッファー B、80% バッファー A。 | |
| バッファ 7 | 23% バッファー B、77% バッファー A。 | |
| バッファ 8 | 80%バッファB、20%バッファA。 | |
表 1: Hp-RP ステージチップ分画用のバッファ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
植物プロテオームとホスホプロテオームのダイナミックレンジと複雑さは、依然としてホスホプロテオミクス分析の深さに対する制限要因です。10,000リン酸化部位21、22を同定するLC-MS/MS分析の単回実行の能力にもかかわらず、植物全体のホスホプロテオームのカバレッジは依然として限られている。そのため、環境ストレスに対応した植物信号ネットワークのグローバルな視野をプロファイリングする際には、高感度かつ優れた分離効率を提供するホスホプロテオミクスワークフローが必要とされています。市販の高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムベースクロマトグラフィーは、MS分析23,24の前にペプチドの複雑さを低減する一般的な方法である。しかし、サンプル収集の手順や大溶出量は、感度とスループットの点でHPLCベースの方法の主要な課題です。stage tip は、ペプチドの事前分画または濃縮を実行して、高感度で高スループットの作業を行うための代替アプローチです。この新しいホスホプロテオミクスワークフローは、ホスホペプチド濃縮および分画と相まって等圧標識を利用して、他のホスホプロテオミクスワークフロー25,26よりも植物ホスホプロテオミクスのより良いカバレッジと深さを提供する。
サンプルのpH値は、リンペプチドの濃縮特異性を決定する重要な因子です。pH値は、サンプル調製の前のステップの影響を受ける可能性がありますので、サンプルの読み込み前にpH値を確認することが不可欠です。pHがシフトする場合、サンプルに酢酸または水酸化ナトリウムを添加し、pHを3.0に調整する。このプロトコルは、C18ステージ先端へのリンペプチドの同時溶出とローディングのために実行します。従って、リンペプチド溶出前にIMACステージ先端を平衡化することが重要であり、ACNの濃度が5%未満であることを確認する。
分数の数は、複雑さとサンプルサイズに依存します。典型的には、5〜8分の一は植物におけるリンペプチド同定の広範なカバレッジを提供するのに十分である。分画バッファーにおける ACN の濃度は、サンプルの疎水性に従って調整できます。ほとんどのリンペプチドは、5%〜25%のACN濃度の範囲を使用してC18ビーズから溶出される。リンペプチドは、典型的には、リン酸基の追加の負電荷に起因する非リン酸化ペプチドと比較してより親水性である。しかし、TMT試薬をペプチドのN末端にタグ付けすると、標識ペプチド27の疎水性の増加を招き、その理由は、我々の場合の最初の2つの画分で同定されたリンペプチドが少ない理由を説明するかもしれない(図2A)。したがって、TMT-ゼロ試薬とサンプルのアリコートを用いた試験を用いて、各分画バッファーにおける分数およびACN濃度を評価することができる。最適化されたバッファーは、TMT-6plex標識リンペプチドのよりよい分離効率をもたらす可能性があります。
ステージの先端ベースの分数の制限は、分数の数とチップの容量です。不連続な勾配バッファーがステージ先端分画に使用されるため、ステージ先端分離における分数の拡大は困難です。一方、HPLCカラムに連続勾配を適用して、高い分数を達成することができます。ヒントの容量は、ステージのヒントの適用を制限するもう一つの要因です。大規模ホスホプロテオミクス分析(>10 mgタンパク質)では、より長いカラム長のC18ビーズと分画を詰め込んだHPLCベースの濃縮を使用する方が良いです。一緒に取ると、ステージチップベースのリンペプチド濃縮および分画は、ホスホプロテオミクス分析の中小〜中規模の分析に有用な方法です。このアプローチは、アイソバリックラベリングと統合して、多重化された定量化を実現することができます。この結果は、植物のホスホプロテオミクスのプロファイリングと定量に使用できることも実証した。このワークフローは、特殊なシグナリングネットワークの線引きのために他の種や異なる組織タイプに適用されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム、グラントXDB27040106によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
