Summary
La terapia a base di cellule staminali è emersa come una strategia efficiente per riparare i tessuti cardiaci feriti dopo l'infarto del miocardio. Forniamo un'applicazione in vivo ottimale per il trapianto di cellule staminali utilizzando idrogel di gelatina che possono essere enzimaticamente incrociati.
Abstract
Uno dei principali problemi che devono affrontare le attuali terapie con cellule staminali cardiache per prevenire l'insufficienza cardiaca postinfarct è il basso tasso di ritenzione e sopravvivenza delle cellule trapiantate all'interno del miocardio ferito, limitandone l'efficacia terapeutica. Recentemente, l'uso di biomateriali impalcatura ha attirato l'attenzione per migliorare e massimizzare la terapia con cellule staminali. L'obiettivo di questo protocollo è introdurre una tecnica semplice e diretta per trapiantare le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (MSC) utilizzando idrogel di acido propionico idrossifenile iniettabile (GH); gli idrogel sono favorevoli come piattaforma di somministrazione cellulare per applicazioni di ingegneria dei tessuti cardiaci a causa della loro capacità di essere collegati in situ incrociati e dell'elevata biocompatibilità. Presentiamo un metodo semplice per fabbricare idrogel GH a caricamento MSC (MSC/idrogel) e valutarne la sopravvivenza e la proliferazione in coltura tridimensionale (3D) in vitro. Inoltre, dimostriamo una tecnica per il trapianto intramiocardico di MSC / idrogel nei topi, descrivendo una procedura chirurgica per indurre l'infarto miocardico (MI) tramite la legatura coronarica discendente anteriore sinistro (LAD) e il successivo trapianto MSC / idrogels.
Introduction
La terapia con cellule staminali cardiache è emersa come un potenziale approccio per la riparazione e la rigenerazione delmiocardio 1,2. Nonostante i recenti risultati positivi nei modelli animali e negli studi clinici, l'applicazione della terapia a base di cellule staminali per la riparazione del miocardio è limitata a causa della bassa ritenzione e della scarsa sopravvivenza delle cellule iniettate nei tessuti cardiaci infarti3,4. Di conseguenza, l'uso dell'ingegneria tissutale a base cellulare, compresi i biomateriali iniettabili5,le chiazze cardiache6e ifogli cellulari 7,è stato intensamente studiato per migliorare la ritenzione cellulare e l'integrazione all'interno del miocardio ospite.
Tra i vari approcci potenziali alla riparazione del tessuto cardiaco bioingegnerato, gli idrogel iniettabili combinati con tipi di cellule appropriati, come le cellule staminali mesenchimali (MCC), le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC), sono un'opzione interessante per fornire efficacemente le cellule nelle regioni del miocardio8,9. La gelatina, un noto polimero naturale, può essere utilizzata come matrice iniettabile grazie alla sua grande biocompatibilità, alla notevole biodegradabilità e alla ridotta immunogenicità rispetto a una vasta gamma di biomateriali utilizzati in applicazioni biomediche. Sebbene le piattaforme iniettabili a base di gelatina abbiano un grande potenziale, la loro applicabilità in vivo rimane limitata in base alla loro bassa rigidità meccanica e alla facile degradabilità nell'ambiente fisiologico.
Per superare questi limiti, è stato proposto un nuovo e semplice design di idrogel a base di gelatina costituiti da acido propionico idrossifenile per applicazioni in vivo. I coniugati gelatino-idrossifenil propionico (GH) possono essere reticolati in situ in presenza di un enzima, la perossidasi di rafano (HRP), e successivamente incapsulare vari farmaci, biomolecole o cellule all'interno dell'idrogel, suggerendo un grande potenziale nelle applicazioni di ingegneriatissutale 10,11,12,13,14. Inoltre, abbiamo recentemente studiato gli effetti terapeutici degli idrogel gh contenenti MSC incapsulati e dimostrato il loro uso nella riparazione e rigenerazione cardiaca di successo dopo l'MI in un modello murino15. In questo protocollo, descriviamo una semplice tecnica per l'incapsulamento e la proliferazione tridimensionale in vitro (3D) dei CCI all'interno degli idrogel GH. Introduciamo anche una procedura chirurgica progettata per generare un modello MI murino attraverso la legatura dell'arteria coronarica e il trapianto intramiocardico di idrogel GH a caricamento MSC nel cuore infarto.
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Protocol
Tutte le procedure di ricerca sugli animali sono state fornite in conformità con il Laboratory Animals Welfare Act, la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida e le politiche per gli esperimenti sui roditori fornite dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) nella School of Medicine dell'Università Cattolica della Corea.
1. Preparazione di CSC e idrogel di gelatina iniettabili
- CCI della cultura in un piatto da coltura da 100 mm a 37 °C e 5% CO2. Quando la crescita degli MSC raggiunge l'80% di confluenza, lavare il piatto due volte con DPBS e aggiungere 1 mL di sostituto della tripsiderina a 37 °C per 3 min.
NOTA: I CSC sono stati isolati dal midollo osseo murino seguendole procedure convenzionali 16, coltivati nel Mezzo dell'Aquila Modificata (DMEM) di Dulbecco contenenti il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di soluzione antibiotico-antimicotica, e utilizzati tra il passaggio 7\u20129 per questo studio. - Aggiungere 9 mL di mezzo di coltura e centrifuga a 500 x g per 3 min. Successivamente, scartare il supernatante risultante, rimescolare le cellule in 1 mL di PBS e mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
- Diluire 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di blu Trypan e ottenere la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di celle automatizzato.
- Resuspend e trasferire i MBC su un tubo da 1 ml ad una densità di 1 x 107 celle/ml.
- Preparare un 6,25 wt% di soluzione coniugata GH in PBS e separare in 2 flaconcini. Quindi, mescolare le soluzioni GH con 6 μg/mL di HRP (soluzione GH A) o 0,07 wt% di H2O2 (soluzione GH B).
NOTA: Preparare coniugati gelatina-idrossifenil propionico (GH) secondo i protocollipubblicati 12,15.- Mantenere un rapporto volumetrico 9:1 di soluzione coniugata GH a soluzione coniugata HRP (GH soluzione A) e GH coniugata rispettivamente a H2O2 (soluzione GH B).
- Prima di miscelare i CBC con la soluzione GH A, centrifugare brevemente la sospensione cellulare a 1.000 x g e aspirare con cura il supernatante risultante. Successivamente, mescolare il pellet contenente MSC con la soluzione GH A.
2. In situ MSC-loading e coltura tridimensionale in vitro
- Caricare gh soluzione A (contenente MSC) e GH soluzione B su entrambi i lati di una doppia siringa. Piastra 300 μL delle soluzioni GH combinate con MBC ad una densità finale di 5 x 106 celle/mL su uno scivolo a camera a otto poi.
- Dopo la formazione di idrogel in situ e la successiva incapsulamento MSC tramite cross-linking enzimatico, aggiungere 700 μL di DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di soluzione antibiotico-antimicotica.
- Incubare lo scivolo a 37 °C e 5% di CO2 e sostituire il mezzo di coltura ogni 2\u20123 giorni.
3. Conferma della proliferazione in vitro e della sopravvivenza dei CG MSC all'interno degli idrogel gh
- Per determinare la fattibilità dei CBC coltivati in 3D all'interno degli idrogel GH, utilizzare un saggio di colorazione delle cellule vive / morte dopo il tempo di incubazione predeterminato.
- Dopo l'incubazione dei CBC incapsulati negli idrogel GH per 3, 5, 7 o 14 giorni, aspirare il mezzo e lavare il pozzo due volte con PBS.
- Preparare una soluzione di colorazione contenente 5 μL di calceina AM e 20 μL di omodimero di etidio-1 (EthD-1) in 10 mL di DPBS.
- Aggiungere 200 μL della soluzione di colorazione al pozzo e incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
- Aspirare la soluzione di colorazione e lavare il pozzo due volte con PBS.
- Separare accuratamente la camera dallo scivolo e posizionare un coverslip completo sugli idrogel GH. Utilizzare una microscopia confocale per visualizzare il grado di proliferazione e i cambiamenti morfologici degli MSC incapsulati.
NOTA: Le immagini fluorescenti sono state acquisite con ingrandimento inferiore a 200x e immagini alle lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 470/540 nm per la calceina e 516/607 nm per EthD-1.
4. Induzione dell'infarto del miocardio nei topi
- Anestetizzare topi maschi C57BL/6 di 7 settimane (20\u201222 g) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Zoletil (30 mg/kg) e Rompun (10 mg/kg) in soluzione salina.
- Prima dell'intervento chirurgico, depilate il torace del topo usando la crema per la depilazione e sterilizzare la pelle con iodio.
- Posizionare il mouse su un tavolo operatorio e intubare inserendo un catetere nella trachea per fornire ossigeno supplementare attraverso la ventilazione meccanica.
- Tagliare delicatamente la pelle usando forbici chirurgiche e quindi penetrare nei muscoli intercostali con micro forbici. Separare la seconda e la terza costola sinistra usando una sutura di seta 5-0 per mantenere una cavità toracica aperta.
- Legare con cura l'arteria coronarica discendente anteriore sinistro (LAD) utilizzando un portaaghi con un 8-0 sutura in polipropilene e tagliare la sutura usando l'elettrocauteria.
- Osservare un cambiamento di colore immediato nella parete ventricolare sinistra anteriore.
5. Trapianto intramiocardico di idrogel GH a carico di MSC
- Dopo aver indotto l'infarto del miocardio mediante legatura LAD, iniettare 10 μL di soluzioni GH a caricamento MSC in due punti diversi nella zona di confine infarto (totale: 2 x 105 MSC/20 μL) utilizzando una doppia siringa dotata di un ago 26G.
- Seguendo la stessa procedura descritta nella fase 1, preparare e trasferire le soluzioni GH a caricamento MSC in una doppia siringa.
NOTA: Per valutare l'innesto degli idrogel GH a carico di MSC all'interno dell'area infarcted, gli MSC e i coniugati GH sono stati preetichetti rispettivamente con PHK26 e isotiocianato di fluoresceina (FITC).
- Seguendo la stessa procedura descritta nella fase 1, preparare e trasferire le soluzioni GH a caricamento MSC in una doppia siringa.
- Ripristinare la cavità toracica aperta e chiudere i muscoli e la pelle usando 5-0 suture.
NOTA: Prima della chiusura del torace, rimuovere l'aria usando una siringa catetere. - Rimuovere il tubo tracheale e posizionare il mouse in una gabbia sotto una lampada a infrarossi durante il recupero.
- Per l'analgesia postoperatoria, somministrare iniezioni sottocutanee di Chetoprofene (5 mg/kg al giorno) per un minimo di 72 ore. Tutti i topi devono essere attentamente monitorati per un tempo appropriato per garantire un corretto recupero dopo le procedure chirurgiche e un adeguato trattamento del dolore.
6. Ecocardiografia
- Quattro settimane dopo il trapianto, inizialmente anestetizza il topo con il 5% di isoflurane e quindi regola la concentrazione di isoflurane all'1%.
- Depilate il petto usando la crema per la depilazione e posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante. Applicare il gel trasduttore ad ultrasuoni sul petto.
- Acquisire viste bidimensionali parasternali a basso asse e registrare tracciati in modalità M a livello del muscolo papillare.
NOTA: Posizionare un trasduttore di array lineare (7\u201215 MHz) nella linea parasternale sinistra e visualizzare le strutture anatomiche. - Misurare le linee corrispondenti per LVAW, LVID e LVPW per ottenere lo spessore della parete cardiaca, la dimensione della camera e l'accorciamento frazionato.
NOTA: Confrontare la funzione cardiaca tra cui la frazione di espulsione (EF), l'accorciamento frazionato (FS) e il volume estolico finale (ESV) a livello del muscolo papillare per garantire una corretta valutazione nella stessa posizione anatomica.
7. Valutazione istologica
- Al momento predeterminato dopo il trapianto di idrogel GH a carico di MSC nel cuore infarto, eutanasiare il topo in una camera di CO2 e raccogliere il cuore per l'analisi istologica15.
- Per la colorazione tricromatica ed eosina (H&E) e tricromo (MT) di Masson, fissare i tessuti cardiaci sezionati in paraformaldeide (PFA) al 4% e incorporare nella paraffina. Successivamente, tagliare i blocchi cardiaci incorporati nella paraffina in sezioni seriali da 4 μm utilizzando un microtomo e macchiare le sezioni con macchia MT secondo i protocolli standard17.
- Acquisire immagini su uno scanner di diapositive con ingrandimento 20x e calcolare la dimensione infaritta dei gruppi di trattamento.
Dimensioni infarct (%) = circonferenza totale infarct / circonferenza totale LV x 100 - Calcolare entrambe le circonferenze in base alla misurazione della lunghezza della linea mediana. Per le circonferenze della linea mediana LV, misurare le lunghezze dell'linea centrale tra le superfici endocardiale ed epicardiale. Per le circonferenze infariche della linea mediana, misurare le lunghezze di infarto, compreso più del 50 % dello spessore intero del miocardio18.
NOTA: Tutte le analisi delle immagini sono state eseguite utilizzando il software ImageJ. - Misurare lo spessore della parete della cicatrice ai livelli muscolari papillari.
- Calcola la frazione dell'area del collagene.
Area di collagene (%) = superficie totale della fibrosi interstiziale/area del miocita x 100
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Representative Results
Per fornire efficacemente i CFC al miocardio infartuato, in questo protocollo sono stati utilizzati idrogel collegabili incrociati in situ a caricamento MSC descritti nella figura 1. Prima del trapianto in vivo, la proliferazione e la sopravvivenza dei MBC negli idrogel gh sono stati confermati da un saggio di colorazione in cellule vive / morte in vitro 3D (vivo: verde; morto: rosso). Come mostrato nella figura 2, le immagini rappresentative mostravano una sufficiente proliferazione di MSC, mostrando reti ramificate all'interno degli idrogel gh. Inoltre, una vasta struttura 3D multicellulare degli MSC è stata chiaramente osservata al giorno 14, indicando che gli idrogel gh potrebbero fornire un microambiente adeguato per le cellule incapsulate.
Dopo l'induzione dell'MI tramite legatura LAD, gli idrogel GH a caricamento MSC sono stati trapiantati intramiocardialmente in aree peri-infarct(figura 3A). Come illustrato nella figura 3B, gli MCC e il gel sono stati adeguatamente sostenuti all'interno della regione infarittata. Gli MSC, macchiati di PHK26 (rosso), erano ben integrati negli idrogel GH, macchiati con FITC (verde), presentando un accinnesto e una ritenzione di successo nei cuori infarsi per l'applicazione in vivo.
Per verificare gli effetti terapeutici degli idrogel GH a caricamento MSC in un modello MI murino, i cambiamenti nella funzione cardiaca e nella struttura sono stati valutati mediante ecocardiografia e analisi istologica al giorno 28 dopo il trapianto e confrontati tra i diversi gruppi di trattamento. L'ecocardiografia rappresentativa ha mostrato un miglioramento delle funzioni cardiache, tra cui FS, EF ed ESV, nel gruppo trattato MSC/gel rispetto agli altri gruppi (Figura 4). Inoltre, l'analisi istologica ha mostrato meno fibrosi, pareti infarcite più spesse e una dimensione infarto più piccola nel gruppo trattato MSC/gel rispetto agli altri gruppi, indicando che questo protocollo ha contribuito con effetti benefici attenuando significativamente il rimodellamento della LV (Figura 5).
Figura 1: Schema del processo per migliorare la ritenzione e l'innesto delle cellule staminali mediante idrogel iniettabili. Gli idrogel GH collegabili in situ contenenti MSC derivati dal midollo osseo sono stati preparati e trapiantati mediante iniezione intramiocardica nel cuore infarto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Proliferazione 3D MSC in vitro all'interno degli idrogel GH. Immagini rappresentative di MSC vivi (verdi)/morti (rossi) ottenuti tramite una microscopia confocale a seguito della colorazione di cellule vive/morte dopo 3, 5, 7 e 14 giorni di incubazione (ingrandimento 200x; scala = 100 μm). Le immagini e il video sono stati in parte adattati con il permesso di Kim etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Trapianto in vivo di MSC/Hydrogels. (A) Un diagramma schematico che mostra il trapianto intramiocardico dopo l'induzione di MI. (B) Immagini rappresentative di MSC trapiantati e idrogel gh etichettati rispettivamente con PKH26 (rosso) e FITC (verde). I topi sono stati sacrificati dopo 1, 3, 5 o 7 giorni di trapianto e i loro cuori sono stati poi asportati per valutare il grado di innesto di idrogel MSC e GH. I cuori asportati erano crio-fissi, preparati in sezioni seriali e immagini attraverso una microscopia confocale (ingrandimento 200x; scala = 100 μm). Le immagini sono state in parte adattate con il permesso di Kim etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Miglioramento della funzione cardiaca in seguito al trapianto MSC/Hydrogels. (A) Video rappresentativo dell'ecocardiografia. (B) Immagine rappresentativa in modalità M ad asse corto con misurazioni, compreso lo spessore della parete anteriore ventricolare sinistra in diastole (LVAWd) e sistole (LVAW), diametro interno in diastole (LVIDd) e sistole (LVID) e spessore della parete posteriore in diastole (LVPWd) e sistole (LVPW). (C\u2012E) Miglioramenti funzionali nella frazione di espulsione (EF), accorciamento frazionato (FS) e volume sistolico finale (ESV) dopo 28 giorni di trapianto di tutti i gruppi di trattamento. I dati erano rappresentati come media ± deviazione standard (*p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001; n = 9\u201212 per gruppo). I video e i risultati sono stati in parte adattati con il permesso di Kim etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Miglioramento della struttura cardiaca a seguito del trapianto MSC/Hydrogels. (A) Immagini rappresentative della valutazione istologica. (B\u2012D) Sono stati osservati miglioramenti strutturali nelle dimensioni infartuate, insieme a un diradamento delle pareti meno infarto e fibrosi. Scala = 1 mm. I dati sono rappresentati come la deviazione standard ± media (*p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001; n = 4\u20127 per gruppo). Le immagini e i risultati sono stati in parte adattati con il permesso di Kim etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli idrogel GH iniettabili hanno un grande potenziale per applicazioni in vivo grazie alla loro capacità di incorporare omogeneamente diversi agenti terapeutici in situ. Inoltre, le loro proprietà fisiche e biochimiche possono essere facilmente manipolate in base a requisiti dipendenti dalla malattia. A questo proposito, sono stati proposti idrogel iniettabili per affrontare le principali limitazioni dell'attuale terapia con cellule staminali cardiache ostacolate dalla scarsa sopravvivenza e ritenzione cellulare (cioè , < 10% entro 24 ore dopo il trapianto) nel cuore ferito19,20. Per superare questo scarso risultato, il protocollo qui descritto fornisce un metodo semplice e fattibile per migliorare la ritenzione cellulare e la sopravvivenza utilizzando idrogel GH che possono essere collegati in situ incrociati dopo il trapianto di miocardio, che hanno dimostrato effetti favorevoli sulla struttura cardiaca e sulla funzione in un modello MI murino.
La caratteristica principale di vantaggio di questa tecnica è la sua ampia applicabilità in vivo con qualsiasi tipo di cellula e biomolecola, che può essere caricata semplicemente mescolando con la soluzione gh pregel prima dell'iniezione. Inoltre, per ottenere una comprensione completa delle interazioni donatore-ospite, è possibile adattare un approccio di etichettatura semplice dei coniugati GH e/o delle biomolecole incapsulate per tenere traccia dei cambiamenti nella loro stabilità in vivo, integrazione dell'ospite e cinetica di riassorbimento. Per quanto ne so, l'uso di idrogel iniettabili a base di gelatina combinati con cellule staminali terapeutiche è stato il primo a convalidare il potenziale riparatore del tessuto cardiaco in vitro e in vivo15.
Nella fase attuale di questa ricerca, gli idrogel GH carichi di MSC, iniettati e in situ collegati incrociati sono stati utilizzati come prova di concetto per valutarne l'applicabilità in un modello MI murino. Sebbene questo metodo apparentemente migliorasse l'innesto msc e la ritenzione nei tessuti cardiaci trapiantati, le condizioni dettagliate durante l'iniezione dovrebbero essere prese in considerazione per ottimizzare l'efficacia terapeutica, come la posizione del sito di iniezione (cioè, zona peri-infarto o zona infarto), volume e numero di iniezioni e rigidità dell'idrogel (cioè difficile da iniettare o facile da perdere).
In conclusione, abbiamo dimostrato un protocollo per un modello mi murino rappresentativo mediante legatura LAD e un metodo pratico per il trapianto intramiocardico di cellule staminali utilizzando idrogel incrociati in situ per migliorare la ritenzione e l'innesto delle MCC trapiantate. Queste tecniche forniscono un metodo efficace per il trapianto intramiocardico di idrogel iniettabili a carico MSC ed evidenziano il loro grande potenziale di applicazione in animali di grandi dimensioni e traduzione clinica.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare con questo lavoro.
Acknowledgments
Questa ricerca è supportata dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero dell'Istruzione (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
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