Summary
A terapia baseada em células-tronco emergiu como uma estratégia eficiente para reparar tecidos cardíacos feridos após o infarto do miocárdio. Fornecemos uma aplicação in vivo ideal para transplante de células-tronco usando hidrogéis de gelatina que são capazes de ser enzimaticamente intercessos.
Abstract
Um dos principais problemas enfrentados pelas atuais terapias de células-tronco cardíacas para prevenir a insuficiência cardíaca pós-infarto é a baixa retenção e as taxas de sobrevivência das células transplantadas dentro do miocárdio ferido, limitando sua eficácia terapêutica. Recentemente, o uso de biomateriais de andaimes ganhou atenção para melhorar e maximizar a terapia com células-tronco. O objetivo deste protocolo é introduzir uma técnica simples e simples para transplantar células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSCs) utilizando hidrogéis de ácido propínico hidroxifenil injetável (GH); os hidrogéis são favoráveis como uma plataforma de entrega de células para aplicações de engenharia de tecidos cardíacos devido à sua capacidade de estar intercingo in situ e alta biocompatibilidade. Apresentamos um método simples para fabricar hidrogéis GH de carregamento de MSC (MSC/hidrogéis) e avaliar sua sobrevivência e proliferação na cultura in vitro tridimensional (3D). Além disso, demonstramos uma técnica para transplante intramialárdio de MSC/hidrogéis em camundongos, descrevendo um procedimento cirúrgico para induzir o infarto do miocárdio (MI) através da ligadura da artéria coronária descendente anterior (LAD) e posterior transplante de MSC/hidrogéis.
Introduction
A terapia com células-tronco cardíacas emergiu como uma abordagem potencial para reparação e regeneração do miocárdio1,2. Apesar dos resultados positivos recentes em modelos animais e ensaios clínicos, a aplicação de terapia baseada em células-tronco para reparação do miocárdio é limitada devido à baixa retenção e má sobrevivência das células injetadas nos tecidos cardíacos infartados3,4. Como resultado, o uso de engenharia de tecidos baseados em células, incluindo biomateriais injetáveis5, patches cardíacos6e folhas de células7, tem sido intensamente estudado para melhorar a retenção e integração celular dentro do miocárdio hospedeiro.
Entre as várias abordagens potenciais para a reparação de tecidos cardíacos bioengenharia, hidrânis injetáveis combinados com tipos de células apropriadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são uma opção atraente para efetivamente entregar células nas regiões miocárdias8,9. A gelatina, um polímero natural bem conhecido, pode ser usada como uma matriz injetável devido à sua grande biocompatibilidade, biodegradabilidade considerável e imunogenicidade reduzida quando comparada com uma ampla gama de biomaterias usados em aplicações biomédicas. Embora as plataformas injetáveis à base de gelatina tenham grande potencial, sua aplicabilidade in vivo permanece limitada com base em sua baixa rigidez mecânica e fácil degradabilidade no ambiente fisiológico.
Para superar essas limitações, foi proposto um design novo e simples de hidrogéis à base de gelatina, compostos por ácido propiônico hidroxifenil. Os conjugados de ácido propiônico gelatino-hidroxifenil (GH) podem ser interligados in situ na presença de uma enzima, peroxidase de rabanete (HRP) e, posteriormente, encapsular várias drogas, biomoléculas ou células dentro do hidrogel, sugerindo grande potencial nas aplicações de engenharia de tecidos10,11,12,13,14. Além disso, recentemente investigamos os efeitos terapêuticos dos hidrogéis GH contendo MSCs encapsulados e demonstramos seu uso em reparo e regeneração cardíaca bem-sucedido após a MI em um modelo murino15. Neste protocolo, descrevemos uma técnica simples para o encapsulamento e a proliferação tridimensional in vitro (3D) de MSCs dentro de hidrogéis GH. Também introduzimos um procedimento cirúrgico projetado para gerar um modelo mi murina através da ligadura da artéria coronária e transplante intramocárdio de hidrogéis GH que carregam MSC no coração infartado.
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Protocol
Todos os procedimentos de pesquisa animal foram fornecidos de acordo com a Lei de Bem-Estar dos Animais de Laboratório, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e as Diretrizes e Políticas para Experimentos de Roedores fornecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Faculdade de Medicina da Universidade Católica da Coreia.
1. Preparação de MSCs e hidrogéis de gelatina injetáveis
- MSCs de cultura em um prato de cultura de 100 mm a 37 °C e 5% DE CO2. Quando o crescimento das MSCs atingir 80% de confluência, lave o prato duas vezes com DPBS e adicione 1 mL de trippsina-substituto a 37 °C por 3 min.
NOTA: Os MSCs foram isolados da medula óssea murina após os procedimentos convencionais16, cultivados no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de solução antimíctica antibiótico,e utilizado entre a passagem 7\u20129 para este estudo. - Adicione 9 mL de cultura média e centrífuga a 500 x g por 3 min. Em seguida, descarte o supernaente resultante, resuspenque as células em 1 mL de PBS, e mantenha a suspensão celular no gelo.
- Diluir 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul Trypan e obter a concentração celular usando um contador celular automatizado.
- Resuspend e transfira MSCs para um tubo de 1 mL a uma densidade de 1 x 107 células/mL.
- Prepare uma solução conjugada de 6,25 wt% de GH em PBS e separe em 2 frascos. Em seguida, misture as soluções GH com 6 μg/mL de HRP (solução GH A) ou 0,07 wt% de H2O2 (solução GH B).
NOTA: Prepare os conjugados de ácido propiônico gelatin-hidroxifenil (GH) de acordo com os protocolos publicados12,15.- Mantenha uma razão volumosa de 9:1 da solução conjugada GH para hrp (solução GH solução A) e solução conjugada GH para H2O2 (solução B DE GH), respectivamente.
- Antes de misturar os MSCs com a solução GH A, centrifufique brevemente a suspensão celular a 1.000 x g e aspire cuidadosamente o supernanato resultante. Posteriormente, misture a pelota contendo MSCs com a solução GH A.
2. In situ MSC-loading e tridimensional cultura in vitro
- Solução de carga GH A (contendo MSCs) e solução GH B em ambos os lados de uma seringa dupla. Placa 300 μL das soluções GH combinadas com MSCs a uma densidade final de 5 x 106 células/mL em um slide de câmara de oito poços.
- Após a formação de hidrogel in situ e posterior encapsulamento msc via ligação cruzada enzimática, adicione 700 μL de DMEM contendo 10% de FBS e 1% de solução antimicomolítica.
- Incubar o slide a 37 °C e 5% de CO2 e substituir o meio de cultura a cada 2\u20123 dias.
3. Confirmação da proliferação in vitro e sobrevivência de MSCs dentro de hidrogéis GH
- Para determinar a viabilidade de MSCs cultivados em 3D dentro de hidrogéis GH, use um ensaio de coloração de células vivas/mortas após o tempo de incubação predeterminado.
- Após a incubação dos MSCs encapsulados em hidrogéis GH por 3, 5, 7 ou 14 dias, aspire o médio e lave o poço duas vezes com PBS.
- Prepare uma solução de coloração contendo 5 μL de calcein AM e 20 μL de ethidium homodimer-1 (EthD-1) em 10 mL de DPBS.
- Adicione 200 μL da solução de coloração ao poço e incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente.
- Aspire a solução de coloração e lave o poço duas vezes com PBS.
- Separe cuidadosamente a câmara do slide e coloque uma tampa completa sobre os hidrogéis GH. Use uma microscopia confocal para visualizar o grau de proliferação e alterações morfológicas dos MSCs encapsulados.
NOTA: As imagens fluorescentes foram adquiridas sob ampliação de 200x e imagens nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 470/540 nm para calcein e 516/607 nm para EthD-1.
4. Indução do infarto do miocárdio em camundongos
- Anestesize camundongos C57BL/6 masculinos de 7 semanas de idade (20\u201222 g) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Zoletil (30 mg/kg) e Rompun (10 mg/kg) em soro fisiológico.
- Antes da cirurgia, depilar o peito do rato usando creme de depilação e esterilizar a pele com iodo.
- Coloque o mouse sobre uma mesa de operação e entubar inserindo um cateter na traqueia para fornecer oxigênio suplementar através de ventilação mecânica.
- Corte suavemente a pele usando uma tesoura cirúrgica e, em seguida, penetre os músculos intercostais por micro tesoura. Separe as costelas esquerdas 2ª e 3ª usando uma sutura de seda 5-0 para manter uma cavidade torácica aberta.
- Ligar cuidadosamente a artéria coronária anterior esquerda (LAD) usando um suporte de agulha com um 8-0 sutura de polipropileno e corte a sutura usando eletrocauteria.
- Observe uma mudança de cor imediata na parede ventricular esquerda anterior.
5. Transplante intramyocárdio de hidrogéis GH de carregamento de MSC
- Depois de induzir o infarto do miocárdio por ligadura LAD, injete 10 μL de soluções GH de carregamento MSC em dois pontos diferentes na zona de fronteira infarto (total: 2 x 105 MSCs/20 μL) usando uma seringa dupla equipada com uma agulha de 26G.
- Seguindo o mesmo procedimento descrito na Etapa 1, prepare e transfira as soluções GH de carregamento de MSC em uma seringa dupla.
NOTA: Para avaliar o engrafamento dos hidrogéis GH de carregamento de MSC dentro da área infarto, os MSCs e os conjugados GH foram pré-rotulados com PHK26 e isoticianato de fluoresceína (FITC), respectivamente.
- Seguindo o mesmo procedimento descrito na Etapa 1, prepare e transfira as soluções GH de carregamento de MSC em uma seringa dupla.
- Restaure a cavidade torácica aberta e feche os músculos e a pele usando suturas 5-0.
NOTA: Antes do fechamento do peito, remova o ar usando uma seringa de cateter. - Remova o tubo traqueal e coloque o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada infravermelha durante a recuperação.
- Para analgesia pós-operatória, administre injeções subcutâneas de Cetoprofeno (5 mg/kg por dia) por um mínimo de 72 h. Todos os camundongos devem ser monitorados de perto por um tempo adequado para garantir a recuperação adequada após os procedimentos cirúrgicos, bem como o tratamento adequado da dor.
6. Ecocardiografia
- Quatro semanas após o transplante, inicialmente anestesiar o camundongo com 5% de isoflurane e, em seguida, ajustar a concentração de isoflurane para 1%.
- Despito o baú usando creme de depilação e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento. Aplique gel transdutor de ultrassom no peito.
- Adquira vistas bidimensionais de eixo curto e registre traçados no modo M ao nível do músculo papilar.
NOTA: Coloque um transdutor de matriz linear (7\u201215 MHz) na linha parasternal esquerda e visualize as estruturas anatômicas. - Meça linhas correspondentes para LVAW, LVID e LVPW para obter espessura da parede cardíaca, dimensão da câmara e encurtamento fracionado.
NOTA: Compare a função cardíaca, incluindo a fração de ejeção (EF), encurtamento fracionado (FS) e volume sistólico final (ESV) ao nível do músculo papilar para garantir a avaliação adequada no mesmo local anatômico.
7. Avaliação histológica
- No tempo predeterminado após o transplante de hidrogéis GH carregados de MSC no coração infartado, eutanize o rato em uma câmara de CO2 e colete o coração para análise histológica15.
- Para hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrática (MT) de Masson, fixar os tecidos cardíacos dissecados em 4% de paraformaldeído (PFA) e incorporar em parafina. Em seguida, corte os blocos cardíacos incorporados à parafina em seções seriais de 4 μm usando um microtome e colora as seções com mancha DE MT de acordo com os protocolos padrão17.
- Adquira imagens em um scanner de slides a 20x de ampliação e calcule o tamanho do infarto dos grupos de tratamento.
Tamanho do infarto (%) = circunferência total infarto / circunferência total de LV x 100 - Calcule ambas as circunferências por medição de comprimento médio. Para circunferências da linha média LV, meça os comprimentos da linha central entre as superfícies endocárdia e epicoardial. Para circunferências infartos midline, meça os comprimentos do infarto, incluindo mais de 50 % de toda a espessura do miocárdio18.
NOTA: Todas as análises de imagem foram realizadas por meio do software ImageJ. - Meça a espessura da parede da cicatriz nos níveis musculares papilares.
- Calcule a fração da área de colágeno.
Área de colágeno (%) = área total de fibrose intersticial/área de miócito x 100
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Representative Results
Para efetivamente fornecer MSCs ao miocárdio infartado, foram utilizados neste protocolo o carregamento de MSC em hidrogéis transfronteiriços descritos na Figura 1. Antes do transplante in vivo, a proliferação e sobrevivência de MSCs em hidrogéis GH foram confirmadas por um ensaio de coloração de células mortas/in vitro 3D (ao vivo: verde; morto: vermelho). Como mostrado na Figura 2,imagens representativas exibiram proliferação suficiente de MSCs, mostrando redes ramificadas dentro de hidrogéis GH. Além disso, uma extensa estrutura 3D multicelular de MSCs foi claramente observada no dia 14, indicando que os hidrogéis GH poderiam fornecer um microambiente adequado para as células encapsuladas.
Após a indução de MI via ligadura LAD, hidrogéis GH de carregamento DE MSC foram transplantados intramocardialmente em áreas peri-infarto(Figura 3A). Como mostrado na Figura 3B,os MSCs e o gel foram devidamente sustentados dentro da região infarta. Os MSCs, manchados com PHK26 (vermelho), foram bem integrados em hidrogéis GH, manchados com FITC (verde), apresentando enxerto bem-sucedido e retenção nos corações infartados para aplicação in vivo.
Para verificar os efeitos terapêuticos dos hidrogéis GH de carregamento de MSC em um modelo mi murino, as alterações na função e estrutura cardíaca foram avaliadas pela ecocardiografia e análise histológica no dia 28 pós-transplante e comparadas entre os diferentes grupos de tratamento. A ecocardiografia representativa apresentou melhores funções cardíacas, incluindo FS, EF e ESV, no grupo tratado MSC/gel em comparação com os outros grupos (Figura 4). Além disso, a análise histológica apresentou menos fibrose, paredes infartadas mais grossas e menor tamanho de infarto no grupo tratado de MSC/gel do que nos outros grupos, indicando que este protocolo contribuiu com efeitos benéficos ao atenuar significativamente a remodelação da LV(Figura 5).
Figura 1: Esquema do processo para melhorar a retenção e o enxerto de células-tronco usando hidrogéis injetáveis. Em hidrogéis GH transversíveis que continham MSCs derivados da medula óssea foram preparados e transplantados por injeção intramocárida no coração infartado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Proliferação in vitro 3D MSC dentro de hidrogéis GH. Imagens representativas de MSCs vivos (verdes)/mortos (vermelho) obtidas através de uma microscopia confocal após coloração de células vivas/mortas após 3, 5, 7 e 14 dias de incubação (ampliação de 200x; escala = 100 μm). As imagens e o vídeo foram parcialmente adaptados com permissão de Kim et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Transplante in vivo de MSC/Hidrogéis. (A) Um diagrama esquemático mostrando transplante intramocárdio após a indução de MI. (B) Imagens representativas de MSCs transplantados e hidrogéis GH rotulados com PKH26 (vermelho) e FITC (verde), respectivamente. Os camundongos foram sacrificados após 1, 3, 5 ou 7 dias de transplante e seus corações foram então extirpados para avaliar o grau de engrafamento de hidrogel MSC e GH. Os corações excisados foram crio-fixados, preparados em seções seriais e retratados através de uma microcopia confocal (ampliação de 200x; escala = 100 μm). As imagens foram parcialmente adaptadas com permissão de Kim et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Melhorias na função cardíaca após transplante de MSC/Hidrogéis. (A) Vídeo representativo da ecocardiografia. (B) Imagem representativa do modo M de eixo curto com medidas, incluindo espessura da parede anterior ventricular esquerda em diastole (LVAWd) e systole (LVAWs), diâmetro interno em diastole (LVIDd) e systole (LVIDs), e espessura posterior da parede em diastole (LVPWd) e sístole (LVPWs). (C\u2012E) Melhorias funcionais na fração de ejeção (EF), encurtamento fracionado (SS) e volume sistólico final (ESV) após 28 dias de transplante de todos os grupos de tratamento. Os dados foram representados como ± desvio padrão (*p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001; n = 9\u201212 por grupo). Os vídeos e os resultados foram parcialmente adaptados com permissão de Kim et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Melhorias na estrutura cardíaca após transplante de MSC/Hidrogéis. (A) Imagens representativas da avaliação histológica. (B\u2012D) Foram observadas melhorias estruturais no tamanho do infarto, juntamente com menor afinamento da parede infarto e fibrose. Escala = 1 mm. Os dados são representados como o desvio padrão ± médio (*p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001; n = 4\u20127 por grupo). As imagens e os resultados foram parcialmente adaptados com permissão de Kim et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os hidrogéis GH injetáveis têm grande potencial para aplicações in vivo devido à sua capacidade de incorporar homogêneo agentes terapêuticos in situ. Além disso, suas propriedades físicas e bioquímicas podem ser facilmente manipuladas com base em requisitos dependentes de doenças. Nesse sentido, hidrogéis injetáveis têm sido propostos para abordar as principais limitações na atual terapia de células-tronco cardíacas dificultadas pela má sobrevida e retenção celular (ou seja, < 10% dentro de 24h após o transplante) no coração ferido19,20. Para superar esse resultado ruim, o protocolo aqui descrito fornece um método simples e viável para melhorar a retenção e a sobrevivência celular usando hidrogéis GH que podem ser intersetos in situ após o transplante do miocárdio, que demonstraram efeitos favoráveis na estrutura cardíaca e função em um modelo de MI murina.
A principal vantagem desta técnica é sua ampla aplicabilidade in vivo com qualquer tipo de célula e biomolécula, que pode ser carregada simplesmente misturando-se com a solução de GH pré-gel antes da injeção. Além disso, para obter uma compreensão abrangente das interações entre doadores e hospedeiros, uma abordagem de rotulagem direta dos conjugados gh conjugados e/ou biomoléculas encapsuladas pode ser adaptada para acompanhar mudanças em sua estabilidade in vivo, integração do host e cinética de resorção. Pelo que sabemos, o uso de hidrogéis injetáveis à base de gelatina combinados com células-tronco terapêuticas foi o primeiro a validar o potencial restaurador do tecido cardíaco in vitro e in vivo15.
Na fase atual desta pesquisa, hidrogéis GH carregados com MSCs, injetados e inter-ligados in situ foram usados como prova de conceito para avaliar sua aplicabilidade em um modelo MI murino. Embora este método aparentemente melhore o enxerto e retenção de MSC nos tecidos cardíacos transplantados, as condições detalhadas durante a injeção devem ser consideradas para otimizar a eficácia terapêutica, como a localização do local de injeção (ou seja, zona peri-infarto ou zona infarto), volume e número de injeções, e rigidez do hidrogel (ou seja, difícil de injetar ou fácil de vazar).
Em conclusão, demonstramos um protocolo para um modelo mim de murina representativo por ligadura LAD e um método prático para transplante intramocárdio de células-tronco usando hidrogéis interligados in situ para melhorar a retenção e engrafia de MSCs transplantados. Essas técnicas fornecem um método eficaz para transplante intramialárdio de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC e destacam seu grande potencial de aplicação em animais de grande porte e tradução clínica.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar com este trabalho.
Acknowledgments
Esta pesquisa é apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo Ministério da Educação (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
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