Summary
幹細胞ベースの治療は、心筋梗塞後に負傷した心臓組織を修復するための効率的な戦略として浮上している。酵素的に架橋できるゼラチンハイドロゲルを用いた幹細胞移植に最適なインビボアプリケーションを提供します。
Abstract
梗塞後の心不全を予防するための現在の心臓幹細胞療法が直面している主要な問題の1つは、負傷した心筋内の移植細胞の低い保持率と生存率であり、治療効果を制限する。近年、スキャフォールディング生体材料の使用は、幹細胞治療の改善と最大化に注目されています。このプロトコルの目的は、注射用ヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)ヒドロゲルを使用して骨髄由来間葉系幹細胞(MCC)を移植するための簡単で簡単な技術を導入することです。ヒドロゲルは、その場で架橋され、高い生体適合性を持つ能力のために、心臓組織工学アプリケーション用の細胞送達プラットフォームとして好ましい。MSC負荷GHヒドロゲル(MSC/ヒドロゲル)を製造し、その生存と増殖を3次元(3D)インビトロ培養で評価する簡単な方法を紹介します。また、マウスにおけるMSC/ヒドロゲルの心筋内移植の手法を示し、左前下降(LAD)冠動脈結紮術とその後のMSC/ヒドロゲル移植を介して心筋梗塞(MI)を誘導する外科的処置を説明する。
Introduction
心臓幹細胞療法は、心筋修復および再生1,2の潜在的アプローチとして出現した。動物モデルおよび臨床試験における最近の肯定的な結果にもかかわらず、心筋修復のための幹細胞ベース療法の適用は、梗塞した心臓組織3、4における注入された細胞の低い保持および生存不良のために制限される。その結果、細胞系組織工学の使用は、注射可能な生体材料5、心臓パッチ6、および細胞シート7を含む、宿主心筋内の細胞の保持および統合を改善するために集中的に研究されてきた。
生体工学的心臓組織修復に対する様々な潜在的アプローチの中で、間葉系幹細胞(MSC)、胚性幹細胞(ESC)、および人工多能性幹細胞(iPSC)などの適切な細胞タイプと組み合わせた注射可能なヒドロゲルは、心筋領域8,9に細胞を効果的に送達するための魅力的な選択肢である。ゼラチンは、よく知られている天然ポリマーであり、生物医学用途で使用される幅広い生体材料と比較して、その優れた生体適合性、かなりの生分解性、および免疫原性の低下により、注射可能なマトリックスとして使用することができます。ゼラチンベースの注入プラットフォームは大きな可能性を秘めていますが、生体内での適用性は、低い機械的剛性と生理学的環境における容易な劣化性に基づいて制限されたままです。
これらの制限を克服するために、インビボ用途に対してヒドロキシフェニルプロピオン酸からなるゼラチン系ヒドロゲルの新規かつシンプルな設計が提案されている。ゼラチンヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)コンジュゲートは、酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の存在下でその時に架橋することができ、その後、様々な薬物、生体分子、またはヒドロゲル内の細胞を封入し、組織工学アプリケーション10、11、12、13、14に大きな可能性を示唆している。さらに、我々は最近、カプセル化されたMSCを含むGHヒドロゲルの治療効果を調査し、マウスモデル15におけるMI後の心臓修復および再生に成功した心臓修復および再生におけるそれらの使用を実証した。本プロトコルでは、GHヒドロゲル内のMCのカプセル化およびインビトロ3次元(3D)増殖に関する簡単な手法について述べた。また、梗塞した心臓へのMSC負荷GHヒドロゲルの冠動脈結紮および筋膜内移植を介してマウスMIモデルを生成するように設計された外科的処置を導入する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物研究手順は、実験動物福祉法、実験動物のケアと使用のためのガイド、および韓国カトリック大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が提供するげっ歯類実験のガイドラインと方針に従って提供されました。
1. MSCおよび注射ゼラチンハイドロゲルの調製
- 37°Cと5%CO2で100mm培養皿で培養MSC.CSの成長が80%の合流に達したら、DPBSで皿を2回洗い、37°Cでトリプシン置換の1 mLを3分間加えます。
注:MSCは、従来の手順16に従ってマウス骨髄から単離され、10%のウシ胎児血清(FBS)および1%抗生物質抗ミコティック溶液を含むダルベッコの修飾ワシ培地(DMEM)で培養され、この研究のために7\u20129の通過間に使用された。 - 培地と遠心分離機を500xgで9mL3分間加えます。次に、得られた上清を捨て、細胞をPBSの1mLで再懸濁し、細胞懸濁液を氷上に維持する。
- 10 μLのトリパンブルーで10 μLの細胞懸濁液を希釈し、自動化されたセルカウンターを使用して細胞濃度を得る。
- 1 x 107 細胞/mLの密度で1mLチューブに再中断し、MCを移します。
- PBSでGHコンジュゲート溶液の6.25重量%を調製し、2バイアルに分離します。次に、GH溶液をHRP(GH溶液A)の6μg/mLまたはH2O2(GH溶液B)の0.07重量%と混合します。
注:ゼラチン-ヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)のコンジュゲートを公開されたプロトコル12、15に従って準備します。- HRP(GH溶液A)とGH共役溶液に対するGHコンジュゲート溶液の9:1体積比をH2O2(GH溶液B)にそれぞれ保持する。
- GH溶液AとMSCを混合する前に、細胞懸濁液を1,000xgで短時間遠心分離し、得られた上清を慎重に吸引する。続いて、MCsを含むペレットをGH溶液Aと混合する。
2. SIU MSCローディングと3次元インビトロ培養
- GH溶液A(MSCを含む)とGH溶液Bを二重シリンジの両側にロードする。5 x 106 細胞/mLの最終的な密度のMSCとの結合されたGHの解決の300 μLを8ウェルの部屋のスライドに置く。
- 酵素架橋によるシトゥーヒドロゲル形成とその後のMSCカプセル化の後、10%FBSおよび1%抗生物質抗ミコティック溶液を含むDMEMの700 μLを加える。
- スライドを37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、2\u20123日ごとに培地を交換します。
3. GHヒドロゲル内のインビトロ増殖とMSCの生存の確認
- GHヒドロゲル内の3D培養MCの生存率を決定するには、所定のインキュベーション時間後に生きた/死細胞染色アッセイを使用してください。
- 3、5、7または14日間のGHヒドロゲル中のカプセル化されたMSCのインキュベーションに続き、培地を吸引し、PBSで2回洗浄した。
- カルセインAM 5 μL、エチジウムホモジマー-1(EthD-1)を10 mLのDPBSで含む染色液を調製します。
- 200 μLの染色液をウェルに加え、室温で暗闇の中で30分間インキュベートします。
- 染色液を吸引し、PBSで2回洗浄します。
- 慎重にスライドからチャンバーを分離し、GHヒドロゲルの上に完全なカバースリップを置きます。コンフォーカル顕微鏡を使用して、カプセル化されたMSCの増殖および形態学的変化の程度を可視化する。
注:蛍光画像は200倍倍の下で取得され、カルセインの場合は470/540 nm、EthD-1では516/607nmの励起/発光波長で画像化されました。
4. マウスの心筋梗塞の誘導
- 7週齢の雄C57BL/6マウス(20\u201222 g)を、ゾレチル(30mg/kg)とロンプン(10mg/kg)の混合物を生理膜内注射して生理学します。
- 手術前に、脱毛クリームを使用してマウスの胸部を脱毛し、ヨウ素で皮膚を殺菌します。
- 手術台の上にマウスを置き、カテーテルを気管に挿入して、機械的換気を介して補足的な酸素を提供します。
- 手術用ハサミを使って皮膚をそっと切り抜け、肋間筋をマイクロハサミで貫通する。5-0シルク縫合糸を使用して2番目と3番目の左肋骨を分離し、開いた胸腔を維持します。
- 8-0の針ホルダーを使用して、左前前下降(LAD)冠状動脈を慎重にリゲートするポリプロピレン縫合糸を電気焼き液を用いて縫合糸を切断する。
- 左心室前壁の色の変化を観察します。
5. MSC負荷GHヒドロゲルの心筋内移植
- LADライゲーションにより心筋梗塞を誘発した後、26G針を装着したデュアルシリンジを用いて、梗塞境界領域(合計:2 x 105 MSC/20 μL)の2つの異なる点に10μLのMSC負荷GH溶液を注入します。
- ステップ1で説明したのと同じ手順に従って、MSC-LOADING GH溶液を二重シリンジに準備し、移します。
注:梗塞領域内のMSC負荷GHヒドロゲルの生着を評価するために、MSCおよびGHコンジュゲートは、それぞれPHK26およびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で事前に標識しました。
- ステップ1で説明したのと同じ手順に従って、MSC-LOADING GH溶液を二重シリンジに準備し、移します。
- 開いた胸腔を復元し、5-0縫合を使用して筋肉と皮膚を閉じます。
注意:胸を閉める前に、カテーテルの注射器を使用して空気を取り除きます。 - 気管チューブを取り外し、回復中に赤外線ランプの下のケージにマウスを置きます。
- 術後鎮痛の場合、皮下ケトプロフェン注射剤(1日5mg/kg)を最低72時間投与する。すべてのマウスは、外科的処置と適切な疼痛治療の後に適切な回復を確実にするために適切な時間を注意深く監視する必要があります。
6. 心エコー検査
- 移植後4週間、最初に5%のイオブルランでマウスを麻酔し、イオブルラン濃度を1%に調整する。
- 脱毛クリームを使用して胸を脱退し、加熱パッドの上にマウスを置きます。胸部に超音波トランスデューサーゲルを適用します。
- 2次元の準船骨短軸ビューを取得し、乳頭筋のレベルでMモードトレースを記録します。
注: 左寄尾線に線形配列トランスデューサ(7\u201215 MHz)を配置し、解剖構造を表示します。 - LVAW、LVID、LVPWの対応するラインを測定して、心臓壁の厚さ、チャンバー寸法、および分数短縮を得ます。
注:同じ解剖学的位置で適切な評価を確実にするために、乳頭筋のレベルで、排出分率(EF)、分数短縮(FS)、および末収縮期容積(ESV)を含む心機能を比較してください。
7. 組織学的評価
- MSC負荷GHヒドロゲルを梗塞した心臓に移植した後の所定の時間に、マウスをCO2チャンバーに安楽死させ、組織学的分析用の心臓を集める。
- ヘマトキシリンとエオシン(H&E)とマッソンのトリクローム(MT)染色の場合、解剖した心臓組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に固定し、パラフィンに埋め込みます。次に、パラフィン埋め込み心臓ブロックをミクロトームを用いて4μmシリアルセクションに切断し、標準プロトコル17に従ってMT染色でセクションを染色する。
- 20倍の倍率でスライドスキャナ上の画像を取得し、治療群の梗塞サイズを計算します。
梗塞サイズ(%)=全梗塞周周/総LV周回×100 - 正中長の測定で両方の円周を計算します。LV中線周周では、心内膜面と心外膜表面の中心線の長さを測定します。中線梗塞の円周の場合、心筋18の全厚さの50%以上を含む梗塞の長さを測定する。
注:すべての画像解析は、ImageJ ソフトウェアを使用して実行されました。 - 乳頭筋レベルでの瘢痕の壁の厚さを測定します。
- コラーゲン領域の分数を計算します。
コラーゲン領域(%)=間質線維化/筋細胞領域の総面積 x 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
梗塞心筋にMCを効果的に送達するために、 図1 に記載されたシンチクロスリンク可能なヒドロゲル中のMSC負荷をこのプロトコルで使用した。インビボ移植の前に、GHヒドロゲル中のMCの増殖および生存は、3Dインビトロ生きている/死細胞染色アッセイ(生:緑;死んだ:赤)によって確認された。 図2に示すように、代表的な画像は十分なMSC増殖を示し、GHヒドロゲル内の分岐ネットワークを示した。さらに、14日目にMSCの広範な多細胞3D構造が明確に観察され、GHヒドロゲルが封入された細胞に適切な微小環境を提供できることを示した。
LADライゲーションによるMIの誘導後、MSC負荷GHヒドロゲルを梗塞周部に心内移植した(図3A)。図3Bに示すように、MSCおよびゲルは梗塞領域内で適切に持続した。PHK26(赤)で染色されたMSCは、GHヒドロゲルにうまく組み込まれ、FITC(緑色)で染色され、インビボアプリケーションのための梗塞心臓の生着および保持に成功した生着および保持を提示した。
マウスMIモデルにおけるMSC負荷GHヒドロゲルの治療効果を検証するために、心臓機能および構造の変化を、28日目の移植後の心エコー検査および組織学的分析によって評価し、異なる治療群の間で比較した。代表心エコー検査は、他の群と比較してMSC/ゲル処理群においてFS、EF、およびESVを含む心臓機能の改善を示した(図4)。また、組織学的解析は、他の群よりも少ない線維症、梗塞壁の厚さ、およびMSC/ゲル処理群の梗塞サイズが小さいことを示し、このプロトコルがLVリモデリングを有意に減衰させることによって有益な効果を寄与したことを示す(図5)。
図1:注射用ヒドロゲルを用いた幹細胞の保持および生着を改善するプロセスのスキーム。骨髄由来のMSCを含むその場面で、筋梗塞した心臓への筋膜内注射により調製及び移植した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:GHヒドロゲル内のインビトロ3D MSC増殖。3、5、7、および14日間のインキュベーション(200倍倍、スケール= 100 μm)後の共焦点顕微鏡を介して得られた生きている(緑)/死んだ(赤い)MSCの代表的な画像。画像とビデオは、Kim et al.15の許可を得て部分的に調整されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3 MSC/ヒドロゲルの生体内移植(A)MIの誘導後の筋膜内移植を示す模式図(B)PKH26(赤)およびFITC(緑色)で標識された移植されたMSCおよびGHヒドロゲルの代表的な画像。マウスは1、3、5、または7日後に屠殺され、その後、その心臓を切除してMSCおよびGHヒドロゲルの生着の程度を評価した。切除された心臓は、凍結固定され、シリアルセクションに調製され、共焦点顕微鏡(200倍倍、スケール= 100μm)を介して画像化されました。画像の一部は、Kimらの許可を得て適用されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MSC/ヒドロゲル移植後の心機能の改善(A) 心エコー検査の代表的なビデオ。(B)ダイストール(LVAWd)および収縮期(LVAW)の左心室前壁厚さ、ジストール(LVIDd)および収縮期(LVIDs)の内径、および側頭層(LVPWd)および収縮期(LVPW)の後壁厚を含む測定を用いた代表的な短軸Mモード画像。(C\u2012E)全ての治療群の移植28日後の排出分(EF)、分数短縮(FS)、及びエンドシストリック体積(ESV)の機能改善。データは平均±標準偏差 (*p < 0.05, **p < 0.001, ***p < 0.0001; n = グループあたり 9\u201212)。ビデオと結果は、キムら15の許可を得て部分的に適応された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:MSC/ヒドロゲル移植後の心臓構造の改善(A) 組織学的評価の代表的な画像。(B\u2012D)構造の改善は梗塞サイズで観察された, 少ない梗塞壁の薄化と線維化と共に.スケール = 1 mm。データは標準偏差±平均として表されます (*p < 0.05, **p < 0.001, ***p < 0.0001; n = グループあたり 4\u20127)。画像と結果は、Kim et al.15の許可を得て部分的に適合した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
注射可能なGHヒドロゲルは、多様な治療薬をその一体的にその中に組み込む能力のために、インビボアプリケーションに大きな可能性を秘めています。さらに、それらの物理的および生化学的特性は、疾患に依存する要件に基づいて容易に操作することができる。この点で、注射ヒドロゲルは、負傷した心臓19,20における生存不良および細胞保持(すなわち、<24時間以内に10%)の細胞保持によって妨げられる現在の心臓幹細胞療法における主要な制限に対処するために提案されている。この悪い結果を克服するために、本明細書に記載されているプロトコルは、心筋移植後にその中で架橋することができるGHヒドロゲルを使用して細胞の保持および生存を改善する簡単で実現可能な方法を提供し、これはマウスMIモデルにおける心臓構造および機能に好ましい影響を示している。
この技術の主な利点は、あらゆるタイプの細胞および生体分子との広いin vivoの適用性であり、注射前にプレゲルGH溶液と混合するだけでロードできる。さらに、ドナー間の相互作用を包括的に理解するために、GHコンジュゲートおよび/またはカプセル化された生体分子の簡単な標識アプローチは、生体内安定性、宿主統合、および吸収動態の変化を追跡するように適応することができる。我々の知る限りでは、治療用幹細胞と結合した注射可能なゼラチン系ヒドロゲルの使用は、インビトロおよびインビボ15における心臓組織の修復電位を初めて検証した。
本研究の現在の段階では、MCを装填したGHヒドロゲルを、注射し、架橋して、マウスMIモデルにおけるその適用性を評価する概念実証として用いられた。この方法は移植された心臓組織におけるMSCの生着および保持を改善しているように見えるが、注射部位の位置(すなわち、梗塞部または梗塞領域)、注射量および数、およびヒドロゲルの剛性(すなわち、注入しにくいか漏れやすい)のような治療的有効性を最適化するために、注射中の詳細な条件を考慮すべきである。
結論として、LADライゲーションによる代表的なマウスMIモデルのプロトコルと、移植されたMSCの保持および生着を改善するために、その中でのシンチ架橋型ヒドロゲルを用いた幹細胞の心筋内移植のための実用的な方法を実証した。これらの技術は、MSC負荷注射ハイドロゲルの心筋内移植のための効果的な方法を提供し、大型動物および臨床翻訳における応用のための彼らの大きな可能性を強調する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、この作品で宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
本研究は、文部省が出資する韓国国立研究財団(NRF)を通じて基礎科学研究プログラム(NRF-2018R1D1A1A0202049346)の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
- Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
- Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346 (2018).
- Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
- Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122 (2015).
- Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
- Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
- Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
- Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
- Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
- Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111 (2018).
- Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
- Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
- Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).
