Summary
Vi præsenterer en protokol til forberedelse af akutte skiver fra musens dorsale mellemliggende hippocampus. Vi sammenligner dette tværgående præparat med korona udskæring med hensyn til kvaliteten af optagelser og bevarelse af morfologiske træk ved registrerede neuroner.
Abstract
Selvom hippocampus generelle arkitektur er ens langs dens langsgående akse, har nylige undersøgelser afsløret fremtrædende forskelle i molekylære, anatomiske og funktionelle kriterier, der tyder på en opdeling i forskellige underkredsløb langs dens rostro-kaudale omfang. På grund af differentieret konnektivitet og funktion skelnes der mest grundlæggende mellem henholdsvis den dorsale og den ventrale hippocampus, som fortrinsvis er involveret i rumlig og følelsesmæssig behandling. Derfor har in vivo-arbejdet vedrørende rumlig hukommelsesdannelse fokuseret på den dorsale hippocampus.
I modsætning hertil er elektro-fysiologiske in vitro-optagelser fortrinsvis blevet udført på mellemliggende ventral hippocampus, hovedsagelig motiveret af faktorer som skive levedygtighed og kredsløbsintegritet. For at give mulighed for direkte korrelation af in vivo-data om rumlig behandling med in vitro-data har vi tilpasset tidligere sektionsmetoder for at opnå meget levedygtige tværgående hjerneskiver fra den dorsale mellemliggende hippocampus til langsigtede optagelser af hovedceller og internuroner i dentate gyrus. Da rumlig adfærd rutinemæssigt analyseres hos voksne mus, har vi kombineret denne tværgående udskæringsprocedure med brugen af beskyttende løsninger til at forbedre levedygtigheden af hjernevæv fra modne dyr. Vi bruger denne tilgang til mus på ca. 3 måneder. Metoden tilbyder et godt alternativ til koronapræparatet, som ofte bruges til in vitro-undersøgelser af dorsal hippocampus. Vi sammenligner disse to præparater med hensyn til kvaliteten af optagelser og bevarelse af morfologiske træk ved registrerede neuroner.
Introduction
Hippocampus er blevet undersøgt grundigt for sin centrale rolle i forskellige aspekter af læring og hukommelse, rumlig navigation såvel som følelser. Hippocampus grundlæggende kredsløb, almindeligvis kaldet det "trisynaptiske kredsløb", er et lamellare netværk i den tværgående akse, som stort set bevares langs længdeaksen1. Hippocampus bidrag til forskellige kognitive og følelsesmæssige adfærd opstår sandsynligvis fra de forskellige forbindelser, som dette grundlæggende kredsløb gør langs dorsoventral aksen med flere andre hjerneregioner2,3. Ud over afferent og sprudlende konnektivitet peger et stigende antal undersøgelser imidlertid i retning af yderligere forskelle langs hippocampus' septo-tidsmæssige akse. Sådanne forskelle vedrører den interne arkitektur og konnektivitet samt forskelle i genekspressionsmønstre og neuronal morfologi4,5,6,7,8.
I betragtning af eksistensen af sådanne forskelle i det grundlæggende kredsløb er det rimeligt at vælge det specifikke hippocampale underkredsløb, der skal undersøges i henhold til de spørgsmål, der behandles. Hvis spørgsmålet for eksempel vedrører neuronale mekanismer, der er involveret i rumlig behandling, er den dorsale snarere end ventral hippocampus af interesse, selvom de to ikke virker uafhængigt in vivo på grund af intra-hippocampal langsgående forbindelse9,10,11. I den forbindelse skal ikke blot forskellene langs længdeaksen tages i betragtning, men der skal også udvises omhu for at bevare lokale kredsløb og langdistancekredsløb så godt som muligt. For at bevare fiberstierne og konnektiviteten er den vinkel, hvor hjernen vil blive sektionsopdelt, afgørende.
Den første metode rapporteret i litteraturen til at omfatte trysinaptic kredsløb først isoleret hippocampus fra hjernen og derefter lavet tværgående skiver (vinkelret på langsgående akser) ved hjælp af en væv chopper12 og en vibratome13. Senere foretrak fysiologer at få skiver fra en hel hjerneblok for også at bevare de tilstødende hjernestrukturer, der er forbundet med hippocampus. Til disse blokpræparater er der udviklet forskellige sektionsvinkler med hensyn til hippocampus, såsom en korona skiveforberedelse14 eller et vandret skivepræparat ved navn HEC-skive til bevarelse af hippocampal-entorhinal cortex-forbindelser15,16,17.
I sidstnævnte præparat skæres parietalflappen med en vinkel på 0° eller 12° i forhold til det vandrette plan langs rosenkranse-kaudale akse for at danne bunden af blokken. Skiver indsamles derefter fra hjernens ventrale overflade, hvilket hovedsagelig tillader høsten af den mellemliggende ventrale hippocampal region. Denne metode er blevet det mest populære valg til fysiologiske undersøgelser og kan udføres pålideligt efter flere offentliggjorte protokoller18,19,20.
Men hvis forskningsinteressen vedrører specifikke aspekter af rumlig læring, kan den dorsale hippocampus være den mere egnede undersøgelsesregion, og det ville være nyttigt at finde en udskæringsprocedure af lignende kvalitet for denne hippocampale region. Få protokoller, der fokuserer på den meget rostral pol, er blevet udviklet, der kan tilfredsstille denne efterspørgsel 21,22.
I denne protokol beskriver vi i stedet en tilgang til at opnå levedygtige tværgående skiver fra den dorsale mellemliggende hippocampus, der bruger den sektionsvinkel, der tidligere er beskrevet for vandrette præparater18,19 (Figur 1A& B). Vi demonstrerer kvaliteten af denne protokol ved at sammenligne elektrofysiologiske optagelser og morfologiske rekonstruktioner i dette præparat med dem, der opnås i koronaskiver. Denne protokol er især velegnet til kombination med anatomiske og adfærdsmæssige eksperimenter hos voksne mus (tre måneder gamle i vores tilfælde).
Protocol
Alle forsøg med forsøgsdyr var i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærdslov og godkendt af den etiske komité på universitetet i Kiel. Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre) mus23 (Jackson laboratorier, Repository nummer 008069) blev opretholdt som heterozygogous kolonier eller krydset med Ai9 Cre reporter mus24 (Jackson laboratorier, Repository nummer 007909). Kvindelige og mandlige mus mellem P40-P90 blev brugt. Mus blev opretholdt i en 12-timers lys-mørk cyklus under standardgruppeopstaldningsforhold og blev forsynet med mad og vand ad libitum.
1. Udarbejdelse af løsninger
BEMÆRK: Forbered friske opløsninger til hver eksperimentel dag ved hjælp af ultrapure vand (UPW) (resistivitet ved 25 °C 18,2 MΩcm). Opløsningerne må opbevares ved 4 °C i højst en dag. Magnesium- og calciumopløsninger kan opbevares separat som 1 M lagerløsninger. Alle arbejdsløsninger skal være mættet med carbogen (95% O2:5% CO2) for optimal iltning og pH-vedligeholdelse før og under brug.
- Forbered skæreopløsningen (500 mL pr. mus) (i mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na-ascorbat, 4 Na-pyruvat, 0,5 CaCl2·2H2O og 10 MgSO4·7H2O. Titrate til pH 7,4 under en kemisk emhætte med 4-5 ml 16% saltsyre, før divalent cationerne tilsættes. Dette vil forhindre udfældning af MgSO4.
BEMÆRK: KCl og NaH2PO4 kan opbevares som 10x opløsninger ved 4°C. Vi laver to individuelle partier skæreopløsning. En dagen før optagelsen (opbevares i en fryser i løbet af natten for at producere knust is) og en på dagen for optagelsen. - Forbered opbevaringsopløsningen (250 mL pr. mus) (i mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na-ascorbat, 4 Na-pyruvat, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O. Titrate til pH 7,3-7,4 med 1 N NaOH.
BEMÆRK: NaCl, KCl og NaH2PO4 kan opbevares som 10x opløsning ved 4 °C. - Forbered ACSF til optagelse (i mM): 122 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukose, 2 CaCl2·2H2O og 2 MgSO4·7H2O, 2 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvate. Titrere pH til 7,3-7,4 med 1 N NaOH.
BEMÆRK: NaCl, KCl og NaH2PO4 kan kombineres i en 10x lageropløsning ved 4°C.
2. Forberedelse af bænken til udskæring
- Forbered på is et bægerglas (150 ml) og to glas petriskåle (10 cm diameter) og fyld dem med den friske skæreopløsning. Opbevar opløsningen iltet med en carbogen boblende anordning (et perforeret rør eller en luftsten forbundet til carbogen-systemet).
BEMÆRK: Opløsningen i bægeret vil blive brugt til perfusionen, mens petriskålene vil blive brugt under skæringsproceduren. - Udstyr operationsbænken med et blad i rustfrit stål, afrundede spidscetter, fin spidscetter, stor saks, lille saks, en stor metalspatel, en tynd metalspatel, en børste, vibratomepladen og cyanoacrylatlim eller den mindre giftige n-butyl-ester cyanoacrylate klæbemiddel. Nedsænk et blad i rustfrit stål og et stykke filterpapir i en af glasstenskålene på is. Denne Petri vil blive brugt til at skære hjernen. Tegn tre parallelle linjer på bunden af en plast petriskål og placere denne parabol tæt på de kirurgiske instrumenter.
- Forbered opsætningen til den transkortiske perfusion i henhold til offentliggjorte protokoller25.
- Forbered vibratomet, montere et nyt blad på bladholderen og indstille parametrene for skæring (vinklen på bladet fra vandret plan 17 °, blade svingning amplitude 1,5 mm, klinge fremad bevægelse hastighed på omkring 2 mm min-1, Oscillation frekvens 90 Hz, sektion tykkelse 350 μm). Fyld vibratomebakken med iskold skæreopløsning, og hold den under konstant iltning.
BEMÆRK: Vi tilsætter den knuste is, der er fremstillet af det første parti skæreopløsning, til den afkølede friske skæreopløsning for at holde temperaturen nede. Vær opmærksom på at holde isen fra bladet, mens udskæring. - Forbered et inkubationskammer fyldt med skæreopløsningen under konstant iltning. Kammeret anbringes i et forvarmet vandbad (35 °C).
BEMÆRK: Et eksempel for inkubationskammeret findes i Edwards og Konnerth (1992)26. - Forbered et skiveopbevaringskammer fyldt med opbevaringsopløsningen og hold det ved stuetemperatur og under konstant iltning. Hvis vævet udtrykker et fluorescerende protein eller en lysaktiveret opsin, anbefales det at holde kammeret i mørke, for eksempel inde i en kasse.
BEMÆRK: Et opbevaringskammer med flere uafhængige brønde er nyttigt at skelne mellem niveauet af skiverne langs Hippocampus' dorsoventralakse. Der kan bygges et specialfremstillet kammer(Figur 1D). Tag et stykke hætteglas afstandsgitter fra en 81x kryogen hætteglas opbevaringsboks og lim bunden på en nylon net. Sæt den øverste tredjedel af en 5mL pipette plastspids i midten af dette gitter, så den stikker ud ca. 3 cm i bunden. Denne plastspids fungerer som gitterets stativ og holder senere luftslangen til iltning. Sæt gitteret med stativet i en cylindrisk plastkasse (f.eks. emballering af sprøjtefiltre), så det ikke kan vippe eller wobble. Dette reservoir vil indeholde 250 ml opbevaringsopløsning.
3. Forberedelse af hippocampale skiver
- Bedøve musen i en kasse kammer ved hjælp af isoflurane (ca. 0,5 mL) under emhætten. Lad musen hvile, indtil vejrtrækningen er langsom og regelmæssig (ca. 2-3 minutter). Test for fraværet af smerteresponser med tåkleder.
- Trans-cardial perfusion udføres ved hjælp af 25 ml kulsyreholdig skæreopløsning fra bægeret på isen efter offentliggjorte protokoller25,27. Dette trin anbefales at køle ned i hjernen hurtigt for hurtigt at bremse neuronal metabolisme.
- Halshugge dyret ved hjælp af den store saks og placere hovedet i den afkølede Petri parabol på is, der indeholder skæreopløsningen.
- Åbn huden med den fine saks for at afsløre kraniet. Lav små laterale snit i bunden af kraniet på begge sider af foramen magnum. Skær derefter langs sagittal suturen, der starter ved foramen magnum, indtil den når naso-frontal suturen over den olfaktoriske pære. Træk op saks under sagittal snit for at undgå skader på det underliggende hjernevæv.
BEMÆRK: At holde hovedet nedsænket i skæreopløsningen hjælper med at fjerne det fra blodet og holder temperaturen nede. - Brug den afrundede spids pincet til at trække op parietal knogler til at udsætte hjernen. Vær opmærksom på at få fat i og fjerne meninges også. Hvis venstre, kan de skade hjernen under udvinding.
- Brug den lille spatel til forsigtigt at skovle hjernen ud i den anden petriskål.
- Skær hjernen i halve langs den langsgående revne ved hjælp af det forkølede blad.
- Brug den store spatel til at løfte en halvkugle ud af skæreopløsningen og på plast petriskålen. Når halvkuglen ligger på dens mediale overflade, skal du justere parietal cortex med en af de parallelle linjer for at få en reference til det andet snit som vist i figur 1B.
- Udfør det andet snit på den ventrale del af halvkuglen, der placerer bladet parallelt med linjerne for at opnå overfladen, som senere bruges til limning af hjernen på prøveholderen (se næste trin), som vist i figur 1B. Returner halvkuglen i den iltede skæreopløsning i glas petriskålen og udfør den samme procedure på den anden halvkugle.
- Lim halvkuglerne med den friskskårne ventrale side på vibratomeprøveholderen ved hjælp af klæbemidlet. Sæt et par dråber skæreopløsning på halvkuglerne for at størkne limen og flytte prøveholderen ind i vibratomebakken. På denne måde vil udskæringen fortsætte fra dorsalen til den ventrale hippocampus.
- Fjern de første et eller to ikke-tværgående skiver (figur 1C, ii-iii), indtil interesseområdet bliver synligt, og begynd derefter at indsamle skiverne.
BEMÆRK: Ikke-tværgående, men brugbare, sunde skiver kan fås fra den dorsale hippocampus i begyndelsen af udskæringsproceduren(figur 1C,ii-iii). Samlingen af hver skive kræver ca. 3-4 min. Ved at starte skæringen fra dorsalen i stedet for ventral hippocampus sparer vi ca. 10 minutter, hvilket forbedrer levedygtigheden af dorsale skiver. - Med en plastpipette (skær spidsens smalle ende væk) overføres hver skive til inkubationskammeret (med skæreopløsning ved 35 °C) og lad den hvile i 12 minutter. Den korte restitutionsperiode i varm skæreopløsning reducerer i høj grad indledende neuronal hævelse, som rapporteret i Ting et al. (2014)28. Derefter overføres skiven til opbevaringskammeret (indeholdende opbevaringsopløsning ved RT) ved hjælp af en børste, og den skal hvile indtil eksperimentets start.
4. Registrering af hele celler og biocytinfyldning
BEMÆRK: Beskrivelsen af helcelleplaster-klemmeoptagelse reduceres her kun til vigtige trin, der hjælper med at opnå god biocytinfyldning og er generelt anvendelig for neuroner i ACSF. For nærmere oplysninger om procedurerne for elektrofysiologiske optagelser kan flere andre protokoller konsulteres29,30.
- Vælg en passende intracellulær opløsning i henhold til de parametre, der skal registreres. For aktuelle klemmemålinger kan der f.eks. anvendes en kaliumgluconatbaseret opløsning (i mM): 135 K-Gluconat, 3 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 10 phosphocreatine-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na2-GTP. Juster pH-vinduet til 7,3 med 1 M KOH. Osmolaliteten skal være omkring 285-290 mOsmol/kg, når der tilsættes 3-5 mg/mL biocytin.
BEMÆRK: For at overvåge neuronens form under optagelsen kan der tilsættes 0,3-0,5 μL/mL på 1 mM Alexa Fluor Hydrazide til den intracellulære opløsning. I dette tilfælde skal du huske for biocytin åbenbaring, at matche Alexa farvestof farve med fluorescerende sonde koblet til streptavidin. - Forbered patch-clamp elektroder af ≤1 μm spids diameter og 3-5 MΩ modstand fra tykvæggede borosilicate kapillærer.
- Perfusionssystemet i patch-clamp-opsætningen startes med en hastighed på 2,5-3 mL/min ved RT eller 35-37 °C og fastgør en skive i kammeret med et U-formet anker.
- Identificer hjernen region af interesse og vælge en sund neuron med soma mindst 30-50 μm under overfladen af skiven.
BEMÆRK: Soma af en sund neuron har en glat overflade, og membranen grænser er lidt kontrast. Den soma af usunde neuron synes skrumpet og stærkt kontrasteret eller hævede og semi-transparent. - Lad en glaspipette med den intracellulære opløsning, indtil spidsen af AgCl-elektroden er dækket. Flyt pipetten ind i opløsningen af optagekammeret ved at anvende et let positivt tryk for at holde spidsen af glaselektroden klar.
BEMÆRK: Hvis opløsningen indeholder et Alexa-farvestof, kan trykket styres visuelt ved at justere mængden af fluorescerende opløsning, der frigives fra spidsen. Minimalt tryk ville undgå farvning af vævet omkring cellen. - Indflyvning af cellen fra en skrå vinkel og etablere kontakt inden for den første tredjedel af soma overfladen, når de danner giga-forsegling. Slip trykket, flyt langsomt holdepotentialet til 65 mV og påfør en blid sugning gennem munden for at lette giga-tætningsdannelsen.
- For at etablere hele cellekonfigurationen skal du anvende stærk og kort sugning for at bryde membranen. Kassér optagelsen, hvis neuronen har et membranpotentiale, der er mere depolariseret end-50 mV, hvis holdestrømmen stiger ud over 100 pA, eller hvis adgangsmodstanden øges ud over 30 MΩ.
- Efter registreringen (for tilstrækkelig påfyldning af somata og dendritter anbefales mindst 15 min; til påfyldning af komplekse axoner op til en time kan det være nødvendigt31) skal du forsigtigt fjerne elektroden. Til dette formål indstille bedrift potentiale til 0 mV og forsøge at re-form en giga-forsegling ved langsomt at trække pipetten i den modsatte retning fra den tilgang, således at opnå en outside-out patch konfiguration.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af Alexa-farvestoffet i de intracellulære opløsninger hjælper med visuelt styret fjernelse af pipetten fra den neuronale overflade. Hvis cellens kerne ikke er i kontakt med pipettespidsen, trækker en hurtig metode til at reformere forseglingen pipetten ud af vævet diagonalt og opad ved høj hastighed. Hvis kernen eller en del af membranen ligger i spidsen, er der fare for at bryde plasmamembranen. I dette tilfælde kan en lille positiv trykpåføring og lateral bevægelse hjælpe. - Bemærk cellens placering og udsnittets retning. Efter fiksering kan skivens nøjagtige retning og integriteten af den fyldte celle kontrolleres under et fluorescerende mikroskop.
5. Immunostaining, billederhvervelse og morfologisk rekonstruktion
- Efter registrering overføres skiverne til en 24-brønds plade for at fastgøre den i paraformaldehyd (PFA) 4% i 0,1 M fosfatbufferet saltvand (PBS). Inkuber i 60 minutter ved RT eller natten over ved 4 °C i henhold til følsomheden af de anvendte primære antistoffer. Skiver kan opbevares i 0,1 M PBS og 0,02% NaN3.
ADVARSEL: PFA er giftig. Brug under kølerhjelmen. - Udfør immunostaining og biocytin åbenbaring inden for en uge efter optagelsen i henhold til etablerede protokoller32,33.
BEMÆRK: Vi bruger en procedure, der undgår omfordeling af skiven for at bevare integriteten af dendritiske og axonale processer. Denne procedure kræver dog længere inkubationstider, da antistoffer skal trænge ind i vævet. Vi foreslår, at du tester tiden for optimal indtrængning af antistoffer i vævet, før forsøget udføres. - Anskaf billeder ved hjælp af et konfokalt mikroskop med Z-stak og flisescanningsfunktion.
- Udfør morfologisk rekonstruktion ved hjælp af Fiji imageJ34.
BEMÆRK: Flere billedfilformater kan importeres til programmet ved hjælp af bioformat-plug-in'en. Vi anbefaler brugen af Simple Neurite Tracer (STN) plugin35 til rekonstruktion af dendritterne og axonen. En enkel og klar tutorial er tilgængelig på https://imagej.net/SNT og http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. Den fil, der indeholder sporingsdataene (.traces), kan, hvis den gemmes ukomprimeret, konverteres til en tekstfil og åbnes med Matlab eller anden software til tekstdatabehandling.
Representative Results
I denne protokol beskriver vi, hvordan man forbereder akutte hippocampale skiver fra den dorsale mellemliggende del af hippocampus (Figur 1A). Protokollen er især velegnet til eksperimenter, der undersøger mekanismer, der er involveret i rumlig læring og kan kombineres med adfærdsarbejde eller viral mærkning eller manipulationsstrategier i den dorsale hippocampus35. Anvendelse af den her beskrevne sektionsprocedure på de dyr, der injiceres med Cre-afhængig GFP, og som udtrykker adeno-associeret virus (AAV-FLEX-GFP) i dorsal hippocampus af Pvalb-IRES-Cre-mus ved forskellige Bregma-koordinater AP-1,94 mm ML ± 0,5-2 mm, dybde-1,25-2,25 mm til at målrette forskellige regioner i hippocampaldannelse 36 vi var i stand til at opnå mindst tre tværgående skiver, der indeholder de inficerede regioner(Figur 1A lysegrøn farve på 3D-modellen af hippocampus). Derudover kan flere ikke-tværgående, men sunde skiver fås fra de mere rostrale dele af den dorsale hippocampus (Figur 1C).
For at demonstrere kvaliteten og levedygtigheden af vores skiver har vi registreret grundlæggende elektro-fysiologiske og morfologiske parametre for granulatceller og tdTomato-mærkede Parvalbumin-positive (PV+) interneuroner i dentate gyrus af Pvalb-IRES-Cre; Ai9 transgene mus (7-12 uger) og sammenlignede disse med optagelser fra koronaskiver i samme region opnået med en standardprotokol.
Ved visuel inspektion under IR-DIC-mikroskopet (infra-red differential-interference) bemærkede vi allerede klare forskelle mellem vores tværgående og koronade skive. Mens neuroner af de vigtigste cellelag i koronar skiver ofte syntes grove og vises stærkt kontrasterede konturer, neuroner i den tværgående skive meste viste glatte overflader og kun let kontrasterede grænser, tegn på bedre cellulære vitalitet (Figur 2A). Årsagen til disse forskelle i celle levedygtighed mellem koronar og tværgående skiver kan ligge i orienteringen af sektionsplanet med hensyn til fiber skrifter. Da disse ikke er parallelt i koronarsektionerne, vil axoner og dendritter blive afskåret. I overensstemmelse med denne antagelse fandt vi, at overfladeplanerene for granulatcellelag og hilus i skiverne viste større diskontinuitet i koronaen end den tværgående skive (trinstørrelse i overfladeplaner: 41,40 ± 3,28 μm vs. 25,60 ± 2,94 μm, Gennemsnitlig ± SEM, Uparret t-test P = 0,023), hvilket tyder på en større grad af vævsafbrydelse i koronaskiven (Figur 2B). Det betyder, at egnede celler til patch-clamp optagelser kun vil blive fundet på dybere planer af granulat cellelag for koronar skiver, hvilket igen kan reducere gennemstrømningen af patch-klemme optagelser. Faktisk var den gennemsnitlige tid til sældannelse i vores tværgående skive hurtigere end for koronaskiver (granulatceller: 12,64± 1,50 s, n=11 i koronar vs. 8,40 ± 0,75 s, n=14 i tværgående skiver, Mean ± SEM, P= 0,0335 Mann-Whitney test; PV+ interneuroner: 31,11 ± 2,60 s, n=9 i koronar vs. 22,00 ± 2,18, n=7 i tværgående skiver, Middel ± SEM, P= 0,0283 Mann-Whitney-test) (Figur 2C). Som en proxy for celleintegritet og sundhed registrerede vi derefter hvilemembranpotentialerne (RMP) af granulatceller og PV+ interneuroner, som var betydeligt mere depolariserede i både granulatceller og PV + interneuroner i koronar vs. tværgående skiver (granulatceller:-62,55 ± 3,54 mV, n=11 i koronar vs.-71,06 ± 2,31 mV, n=14 i tværgående skiver, Mean ± SEM, P=0,0455 Mann-Whitney test; PV+ interneuroner:-52,75 ± 1,66 mV, n=7 i koronar vs.-59,36 ± 2,25 mV, n=6 i tværgående skiver Middel ± SEM, P= 0,0271 Mann-Whitney-test) (Figur 2D). Disse data tyder på et højere antal sunde neuroner i tværgående vs korona skive forberedelse. Indførelsen af en cut-off for den acceptable RMP (-55 mV for granulatceller;-45 mV for PV+ interneurons) resulterede i en højere procentdel af ekskluderede celler i koronar end i tværgående skiver (39,67 ± 8,37 % n=3 eksperimentelle sessioner vs. 23,00 ± 3,85 %, n=4 eksperimentelle sessioner)(figur 2E). Desuden viste rekonstruktion af neuronal morfologi fra registrerede granulatceller, at som forventet var chancerne meget bedre til at hente en komplet axonal arborization til granulatceller i den tværgående skive (Figur 3A, B). Desuden tillod den morfologiske rekonstruktion af PV+ interneuroner i tværgående skiver skildringen af omfattende axonale og dendritiske arborizations, herunder visualisering af små detaljer som dendritiske rygsøjler35(Figur 3C).
Figur 1: Illustration af sektionsproceduren for at få skiver fra dorsal-mellemliggende hippocampus. (A) Tredimensionel repræsentation af hippocampaldannelsen, der viser dens rumlige orientering i hjernen (ændret fra Brain Explorer, Allen Institute)37. Dorsale, mellemliggende og ventrale opdelinger af hippocampus (dHPC, iHPC, vHPC) er angivet, ifølge Dong et al. (2009)7. Den del af dorsal-mellemliggende hippocampus, der vil blive skåret er angivet i lysegrøn. Indsaten til højre viser referenceaksernes retning. (B) Tegneserie af en hjernehalvdel, der skildrer tilpasningen af parietal cortex med de parallelle linjer på petriskålen. Den røde punkterede linje angiver, hvor der skal udføres trimningsskæringen (punkt 3.9 i protokollen) for at skabe overfladen til limning af halvkuglen på prøveholderen. De sorte sleberede linjer angiver, hvor udsnit indsamles. (C) Lyse feltbilledeserier af hippocampale skiver, der er opnået efter denne procedure. Fra pialoverfladen, dorsal til ventral: i) 0,70 mm, ii) 1,05 mm, iii) 1,40 mm, iv) 1,75 mm, v) 2,10 mm, vi) 2,45 mm (vii) 2,80 mm, viii) 3,15 mm. Skalastang= 1 mm. (D) Foto af opbevaringskammeret og det materiale, der er nødvendigt for dets samling. 1. Hætteglas afstandsnet fra en 81x kryogen hætteglas opbevaringsboks, 2. Cylindric plastkasse. 3. Nylon netto, 4. Pipette spids. Indsat. Sidebillede af gitteret og rørholderen, der skal indsættes i den cylindriske boks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Den tværgående skive viser forbedret skive levedygtighed i forhold til korona skive. (A) DIC-IR mikrografer, der viser sunde (sorte pile) og usunde (hvide pile) eksempler på neuronal somata i tværgående og koronar skiver. Hil=hilus, gcl=granulatcellelag, ml= molekylært lag. Skalalinje = 50 μm. (B) Begge sektionsprocedurer giver et trin mellem overfladen af granulatcellelaget og hilus (angivet med pilespidser). Trinnets højde er tegn på omfanget af vævsafbrydelse og er betydeligt lavere i tværgående sektioner end i koronar (n=5 tværgående og n=5 koronarskiver, Mean±SEM, P=0,0238 Mann-Whitney-test). (C) Tidspunkt for giga-ohm sældannelse i granulatceller (n=14 celler i tværgående, n=11 celler koronar; Middelværdi±SEM, P= 0,0355, Mann-Whitney-test) og PV+ IN'er (n=7 celler i tværgående, n=9 celler i koronarskiver, Mean±SEM, P= 0,0283 Mann-Whitney-test) skiver. (D) Hvilemembranpotentiale (RMP) for celler, der er lappet (henholdsvis n= 14 og n=11 granulatceller. Middelværdi±SEM, P=0,0455 Mann-Whitney-test. n=7 PV+ IN'er og n=10 PV+ IN'er, P= 0,0271 Mann-Whitney-test). (E) Procentdel af kasserede celler inden for en forsøgssession (n=3 sessioner med korona slice, n=4 med tværgående skive, Middelværdi±SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Morfologisk konservering af granulatceller og internuroner i den tværgående skive. Konfokale billeder, der viser biocytinfyldte granulatceller i en tværgående skive (A) og i en koronarskiver (B) af Pvalb-IRES-Cre; Ai9 transgene mus. De respektive axoner er rekonstrueret i grå og lysegrå. Bemærk forskellen i axonlængde og kompleksitet mellem præparaterne. Scale bar=100 μm. (C1) Konfokalt billede, der viser et biocitynfyldt tdTomato-positivt internturon. Hil=hilus, gcl=granulatcellelag, ml= molekylært lag. Skalastang=50 μm. (C2) Forstørrelse af det afkælkede område i C1, der viser dendritiske rygsøjler. Skala bar=2 μm (D) Morfologisk rekonstruktion af axoner og dendritter af biocytin fyldt interneuron i C1 (axon i grå, soma og dendritter i sort). (E) Nærbillede af somata af cellerne afbildet i C1 viser kolokalisering af biocytin og Parvalbumin-immunoreactivity (PVir). Scale bar=20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den dorsale hippocampus er blevet grundigt undersøgt for sin rolle i rumlig læring og navigation hovedsageligt gennem adfærdseksperimenter, anatomisk sporing og regionsspecifikke manipulationer. For at kombinere skive-elektro-fysiologiske forespørgsler med disse teknikker, har vi samlet en protokol, der bruger en lignende vinklen på udskæring som den modificerede vandrette udskæring for den mellemliggende ventrale region i hippocampus, men bruger en omvendt udskæring for at opnå tidlige skiver fra det dorsale-mellemliggende område. Denne tilgang reducerer den tid, der kræves for at skære og indsamle den dorsale region hippocampus, hvilket øger skiver levedygtighed.
Ved hjælp af denne metode er vi i stand til rutinemæssigt at hente omkring tre skiver pr. halvkugle af den dorsale hippocampale region mellem 1,4 mm-2,4 mm fra pialoverfladen, som vist i figur 1C. Selv om det ikke er muligt med denne procedure at få tværgående skiver fra hippocampus' meget septale pol, er det muligt at indsamle omkring to yderligere levedygtige ikke-tværgående skiver pr. halvkugle fra septalstangen (Figur 1C ii,iii). Hvis hippocampus septalpolen er det primære forskningsfokus, kan andre protokoller, der tillader indsamling af tværgående skiver, især fra hippocampus's meget septale pol, være bedre egnettil 21,32. Adfærdseksperimenter på rumlig navigation og læring udføres fortrinsvis i modne mus med fuldt udviklet neuronal forbindelse. Derfor har vi optimeret vores udskæringsprocedure til anvendelse på hjerner hos voksne dyr (vist her i tre måneder gamle mus), som er mere følsomme over for stress end det modstandsdygtige unge præparat. Til dette formål har vi kombineret flere strategier, der reducerer den hypoksiske stress hjernen udsættes for i tiden mellem ekstraktion og placeringen af skiverne i den iltede ACSF. Den beskyttende skæreopløsning er en NMDG-baseret ACSF25,27,28 med lav Na+ og Ca2+, men høj Mg2+ for at reducere excitotoksisk skade og celle hævelse på grund af aktivering af NMDA-receptorer. Derudover giver HEPES stabil buffering, og forbindelser som ascorbat og pyruvat reducerer oxidativ stress. Den transkortiske perfusion med den kølede og iltede beskyttende skæreløsning drager fordel af det ekstremt tætte kapillærnetværk, der leverer hjernen til hurtigt og homogent at reducere metabolisk efterspørgsel og glutamatinduceret excitotoksicitet i hjernevævet. Efterfølgende udføres næsten alle trin efter halshugning inden for de afkølede og iltede opløsninger for at holde stofskiftet og iltmangel på et minimum under hele proceduren. Andre strategier for at reducere hjerneskade under udskæring eksisterer og kan være lige sågyldige 38. For at demonstrere kvaliteten af vores forberedelse sammenligner vi det med et koronar skivepræparat, som almindeligvis bruges til at registrere fra den dorsale hippocampus. Selvom koronaskiver kan bruges til at opnå god plasterklemmeoptagelse i dentate gyrus, er antallet af usunde og frakoblede neuroner højere end i den tværgående skive. Derudover bevares integriteten af de axonale og dendritiske arborizations bedre i den tværgående skive. Faktisk tjener integriteten af granulatcelleaksler (Figur 3A), der kører ortogonale til hippocampus' langsgående akse, som en indikator for et tværgående udskæringsplan1.
Til påfyldning af lappede neuroner foreslår vi en elektroderesistens mellem 3 og 5 MΩ. En diameter på spidsen på ca. 1 μm gør det muligt at opnå en god tætningsmodstand under registreringen og god genforsegling ved tilbagetrækning af elektroder. Den mest afgørende detalje er at undgå sugning af dele af soma eller kerne i pipetten. Af denne grund foreslår vi, at du inkluderer et Alexa-farvestof i den intracellulære opløsning, når det er muligt. Farvestoffet gør det muligt at overvåge celleformen under registrering og genforsegling. Desuden giver det mulighed for at vurdere integriteten af den lappede celle efter fiksering, hvilket kan spare immunohistochemistry tid, i tilfælde af mislykkede fyld. På grund af Alexa farvestoffer er slukket med lang fiksering tid, foreslår vi kort fiksering, hvis det er muligt.
Til efterfølgende immunostaining bruger vi en protokol, der ikke kræver omfordeling af skiven. Vi foreslår at gøre farvning inden for en uge efter fiksering. Jo længere skiverne forbliver i køleskabet, jo større er chancen for vævsforringelse. Hvis en lang opbevaring ikke kan undgås, foreslår vi at øge NaN3-koncentrationen i PBS til 0,05% og opdatere den ugentligt. Immunfarvning af hele skiven betyder, at inkubationstiden med primære og sekundære antistoffer øges. Normalt er en natinkubation ved 4 °C nok til at afsløre biocytin, men hvis den kombineres med farvningen for andre proteiner, kan hele farvningsproceduren vare meget længere. Gennemtrængningsblokering og anti-body inkubation skal optimeres individuelt. Normalt, for det primære antistof, to dage er tilstrækkelige, mens en dag kan være nok til den sekundære. Vi anbefaler, at du øger varigheden af vasketrinnene sammen med længere antistofinkubationer for at undgå øget baggrund.
I denne protokol har vi præsenteret en udskæringsmetode for at opnå tværgående eller næsten tværgående hippocampale skiver, der bevarer voksent vævs neuronale levedygtighed og en praktisk tilgang til at genvinde morfologien og den neurokemiske identitet af de lappede neuroner. Denne metode kan let udføres for at matche elektro-fysiologiske resultater med anatomiske og adfærdsmæssige undersøgelser med fokus på den mellemliggende-dorsale del af hippocampus.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Kerstin Kronenbitter og Didier Gremelle for teknisk assistance. Vi takker Umberto Morelli for hjælp med grafisk software og Mathias Hoppe for videography og videoredigering. Arbejdet i vores laboratorium blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Projekt-ID 434434223) og GRK2154, Medical Research Council tilskud G1100546/2 og Kiel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
| 24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
| 81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
| Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
| Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
| Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
| Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
| Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
| Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
| Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
| Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
| Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
| EGTA | Roth | 3054.1 | |
| Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
| Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
| Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
| Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
| Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
| Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
| Large spatula | Roth | E286.1 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
| Microfil | World precision instruments | MF34G | |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
| Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
| Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
| Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
| Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
| Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
| Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
| Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
| Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
| Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
| Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
| Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
| Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
| Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
| Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
| Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
| Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
| Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
| Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |
References
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- David, A., Pierre, L. Hippocampal Neuroanatomy. The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).
- Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).
- Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).
- Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
- Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).
- Cembrowski, M. S., Spruston, N. Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons. Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).
- Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).
- Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory. European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).
- Fredes, F., et al. Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation. Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
- Andersen, P.
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium. Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).
- Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Davie, J. T., et al.
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
- Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus. Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).
- Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).
- Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61377 (2020).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706 (2014).
- Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. Journal of Visualized Experiments. (118), e54880 (2016).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Murray, A. J., et al. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).
- Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release. Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).
- Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry. Neuromethods. 67, 103-125 (2012).
