Summary
We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.
Abstract
Hoewel de algemene architectuur van de hippocampus vergelijkbaar is langs zijn lengteas, hebben recente studies prominente verschillen in moleculaire, anatomische en functionele criteria aan het licht gebracht die wijzen op een verdeling in verschillende subcircuits langs de rostro-caudale omvang. Vanwege differentiële connectiviteit en functie wordt het meest fundamentele onderscheid gemaakt tussen de dorsale en de ventrale hippocampus, die bij voorkeur betrokken zijn bij respectievelijk ruimtelijke en emotionele verwerking. Dienovereenkomstig heeft in vivo werk met betrekking tot ruimtelijke geheugenvorming zich gericht op de dorsale hippocampus.
Elektrofysiologische in vitro opnames zijn daarentegen bij voorkeur uitgevoerd op intermediair-ventrale hippocampus, grotendeels gemotiveerd door factoren zoals de levensvatbaarheid van plakjes en circuitintegriteit. Om een directe correlatie van in vivo-gegevens over ruimtelijke verwerking met in vitro gegevens mogelijk te maken, hebben we eerdere doorsnedemethoden aangepast om zeer levensvatbare transversale hersensegmenten uit de dorsaal-intermediaire hippocampus te verkrijgen voor langetermijnopnamen van hoofdcellen en interneurons in de dentaat gyrus. Omdat ruimtelijk gedrag routinematig wordt geanalyseerd bij volwassen muizen, hebben we deze transversale snijprocedure gecombineerd met het gebruik van beschermende oplossingen om de levensvatbaarheid van hersenweefsel van volwassen dieren te verbeteren. We gebruiken deze aanpak voor muizen van ongeveer 3 maanden oud. De methode biedt een goed alternatief voor het coronale preparaat dat vaak wordt gebruikt voor in vitro studies op dorsale hippocampus. We vergelijken deze twee preparaten in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.
Introduction
De hippocampus is uitgebreid bestudeerd voor zijn cruciale rol in verschillende aspecten van leren en geheugen, ruimtelijke navigatie en emotie. De basiscircuits van de hippocampus, gewoonlijk het "trisynaptische circuit" genoemd, is een lamellennetwerk in de dwarsas, dat grotendeels langs de lengteas1is bewaard gebleven. De bijdragen van de hippocampus aan verschillende cognitieve en emotionele gedragingen komen waarschijnlijk voort uit de diverse verbindingen die dit basiscircuit maakt langs de dorsoventrale as met verschillende andere hersengebieden2,3. Afgezien van afferente en efferente connectiviteit, wijzen een toenemend aantal studies echter op verdere verschillen langs de septo-temporele as van de hippocampus. Dergelijke verschillen hebben betrekking op de interne architectuur en connectiviteit , alsmede op verschillen in genexpressiepatronen en neuronale morfologie4,5,6,7,8.
Gezien het bestaan van dergelijke verschillen in de basiscircuits, is het redelijk om het specifieke hippocampale subcircuit te selecteren dat moet worden onderzocht op basis van de vragen die worden behandeld. Als de vraag bijvoorbeeld betrekking heeft op neuronale mechanismen die betrokken zijn bij ruimtelijke verwerking, is de dorsale in plaats van de ventrale hippocampus van belang, hoewel de twee niet onafhankelijk in vivo handelen als gevolg van intra-hippocampale longitudinale connectiviteit9,10,11. Langs deze lijnen moeten niet alleen de verschillen langs de lengteas worden overwogen, maar er moet ook zorgvuldigheid worden beoefend om lokale en langeafstandscircuits zo goed mogelijk te behouden. Voor het behoud van de vezelpaden en connectiviteit is de hoek waaronder de hersenen zullen worden doorsneden essentieel.
De eerste methode die in de literatuur werd gerapporteerd om het trysinaptische circuit op te nemen, isoleerde eerst de hippocampus uit de hersenen en maakte vervolgens dwarse plakjes (loodrecht op de lengteassen) met behulp van een weefselhakselaar12 en een vibratome13. Latere fysiologen gaven er de voorkeur aan om plakjes uit een heel hersenblok te verkrijgen om ook de aangrenzende hersenstructuren te behouden die verbonden zijn met de hippocampus. Voor deze blokpreparaten zijn verschillende doorsnedehoeken ten opzichte van de hippocampus ontwikkeld, zoals een coronale plakbereiding14 of een horizontaal plakpreparaat genaamd HEC-segment voor het behoud van hippocampal-entorhinale cortexverbindingen15,16,17.
In het laatste preparaat wordt de pariëtale kwab gesneden met een hoek van 0° of 12° ten opzichte van het horizontale vlak langs de rostro-caudale as om de basis van het blok te vormen. Plakjes worden vervolgens verzameld vanaf het ventrale oppervlak van de hersenen, waardoor voornamelijk de oogst van het tussen-ventrale hippocampale gebied mogelijk wordt. Deze methode is de meest populaire keuze geworden voor fysiologische studies en kan betrouwbaar worden uitgevoerd volgens verschillende gepubliceerde protocollen18,19,20.
Als het onderzoeksbelang echter betrekking heeft op specifieke aspecten van ruimtelijk leren, kan de dorsale hippocampus de meer geschikte onderzoeksregio zijn en zou het nuttig zijn om een snijprocedure van vergelijkbare kwaliteit te vinden voor deze hippocampale regio. Er zijn maar weinig protocollen ontwikkeld, die zich richten op de zeer rooskleurige pool, die aan deze vraag kunnen voldoen 21,22.
In dit protocol beschrijven we in plaats daarvan een benadering om levensvatbare dwarssegmenten te verkrijgen uit de dorsaal-intermediaire hippocampus die de eerder beschreven doorsnedehoek gebruikt voor horizontale preparaten18,19 ( figuur1A& B). We demonstreren de kwaliteit van dit protocol door elektrofysiologische opnames en morfologische reconstructies in dit preparaat te vergelijken met die verkregen in coronale plakjes. Dit protocol is met name geschikt voor combinatie met anatomische en gedragsexperimenten bij volwassen muizen (in ons geval drie maanden oud).
Protocol
Alle procedures met betrekking tot proefdieren waren in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswet en goedgekeurd door de ethische commissie van de universiteit van Kiel. Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre) muizen23 (Jackson laboratoria, Repository nummer 008069) werden onderhouden als heterozygote kolonies of gekruist met Ai9 Cre reporter muizen24 (Jackson laboratoria, Repository nummer 007909). Vrouwelijke en mannelijke muizen tussen P40-P90 werden gebruikt. Muizen werden onderhouden in een 12-uurs licht-donker cyclus onder standaard groepshuisvestingsomstandigheden en werden voorzien van voedsel en water ad libitum.
1. Voorbereiding van oplossingen
OPMERKING: Bereid voor elke experimentele dag verse oplossingen met ultrapaan water (UPW) (weerstand bij 25 °C 18,2 MΩcm). De oplossingen mogen maximaal één dag bij 4 °C worden bewaard. Magnesium- en calciumoplossingen kunnen afzonderlijk worden opgeslagen als 1 M voorraadoplossingen. Alle werkende oplossingen moeten verzadigd zijn met carbogen (95% O2:5% CO2) voor optimale oxygenatie en pH-onderhoud voor en tijdens gebruik.
- Bereid de snijoplossing (500 ml per muis) (in mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4,30 NaHCO3,20 HEPES, 25 glucose, 5 Na-ascorbaat, 4 Na-pyruvaat, 0,5 CaCl2·2H2O en 10 MgSO4·7H2O. Titraat tot pH 7,4 onder een chemische kap met 4-5 ml zoutzuur alvorens de divalente kationen toe te voegen. Dit voorkomt de neerslag van MgSO4.
OPMERKING: KCl en NaH2PO4 kunnen worden opgeslagen als 10x-oplossingen bij 4 °C. Wij maken twee individuele partijen snijoplossing. Een de dag voor de opname (opgeslagen in een vriezer 's nachts om gemalen ijs te produceren) en een op de dag van opname. - Bereid de opslagoplossing voor (250 ml per muis) (in mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na-ascorbaat, 4 Na-pyruvaat, 2 CaCl2·2H2O, en 2 MgSO4·7H2O. Titraat tot pH 7,3-7,4 met 1 N NaOH.
OPMERKING: NaCl, KCl en NaH2PO4 kunnen worden opgeslagen als 10x oplossing bij 4 °C. - Bereid ACSF voor op opname (in mM): 122 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3,12,5 glucose, 2 CaCl2·2H2O en 2 MgSO4·7H2O, 2 Na-ascorbaat, 4 Na-pyruvaat. Titreer de pH tot 7,3-7,4 met 1 N NaOH.
OPMERKING: NaCl, KCl en NaH2PO4 kunnen worden gecombineerd in een 10x voorraadoplossing bij 4°C.
2. Voorbereiding van de bank voor het snijden
- Bereid op ijs een bekerglas (150 ml) en twee glazen Petri-gerechten (10 cm diameter) en vul ze met de verse snijoplossing. Houd de oplossing zuurstofrijk met een carbogen borrelend apparaat (een geperforeerde buis of een luchtsteen aangesloten op het carbogensysteem).
OPMERKING: De oplossing in het bekerglas wordt gebruikt voor de perfusie, terwijl de Petri-gerechten tijdens de snijprocedure worden gebruikt. - Rust de operatiebank uit met een roestvrijstalen mes, een afgerond tippincet, een fijn tippincet, een grote schaar, een kleine schaar, een grote metalen spatel, een dunne metalen spatel, een borstel, de vibratomeplaat en cyanoacrylaatlijm of de minder giftige n-butylester cyanoacrylaatlijm. Immerge een roestvrijstalen mes en een stuk filterpapier in een van de glazen Petri-schalen op ijs. Deze Petri zal gebruikt worden om de hersenen te snijden. Teken drie parallelle lijnen op de bodem van een plastic Petrischaal en plaats deze schaal dicht bij de chirurgische instrumenten.
- Bereid de opstelling voor de transcardiale perfusie voor volgens de gepubliceerde protocollen25.
- Bereid de vibratome voor, monteer een nieuw mes op de bladhouder en stel de parameters in voor het snijden (hoek van het blad vanaf horizontaal vlak 17°, oscillatieamplitude van het blad 1,5 mm, voorwaartse bewegingssnelheid van het blad op ongeveer 2 mm min-1,Oscillatiefrequentie 90 Hz, doorsnededikte 350 μm). Vul de vibratomebak met ijskoude snijoplossing en houd deze onder constante oxygenatie.
OPMERKING: We voegen het gemalen ijs gemaakt van de eerste batch snijoplossing toe aan de gekoelde verse snijoplossing om de temperatuur laag te houden. Let erop dat u het ijs tijdens het snijden van het mes houdt. - Bereid een incubatiekamer voor gevuld met de snijoplossing onder constante oxygenatie. Plaats de kamer in een voorverwarmd waterbad (35 °C).
OPMERKING: Een voorbeeld voor de incubatiekamer is te vinden in Edwards en Konnerth (1992)26. - Bereid een plakopslagkamer gevuld met de opslagoplossing en bewaar deze op kamertemperatuur en onder constante oxygenatie. In het geval dat het weefsel een fluorescerend eiwit of een lichtgeactiveerde opsin uitdrukt, is het aan te raden om de kamer in het donker te houden, bijvoorbeeld in een doos.
OPMERKING: een opslagkamer met meerdere onafhankelijke putten is nuttig om het niveau van de plakjes langs de dorsoventrale as van de Hippocampus te onderscheiden. Een op maat gemaakte kamer kan worden gebouwd(figuur 1D). Neem een stuk flacon spacer raster uit een 81x cryogene flacon opbergdoos en lijm de bodem op een nylon net. Steek de bovenste een derde van een plastic punt van 5 ml in het midden van dit raster, zodat deze aan de onderkant ongeveer 3 cm uitsteekt. Deze plastic tip dient als standaard van het rooster en houdt later de luchtslang vast voor oxygenatie. Steek het rooster met zijn standaard in een cilindrische plastic doos (bijv. verpakking van spuitfilters) zodat het niet kan kantelen of wiebelen. Dit reservoir biedt plaats aan 250 ml opslagoplossing.
3. Bereiding van hippocampale plakjes
- Verdoof de muis in een dooskamer met isofluraan (ongeveer 0,5 ml) onder de kap. Laat de muis rusten totdat de ademhaling traag en regelmatig is (ongeveer 2-3 minuten). Test op de afwezigheid van pijnreacties met teenknijpen.
- Voer transcardiale perfusie uit met behulp van 25 ml koolzuurhoudende snijoplossing uit het bekerglas op ijs volgens de gepubliceerde protocollen25,27. Deze stap wordt aanbevolen om de hersenen snel af te koelen om het neuronale metabolisme snel te vertragen.
- Onthoofd het dier met de grote schaar en plaats het hoofd in de gekoelde Petrischaal op ijs met de snijoplossing.
- Open de huid met de fijne schaar om de schedel bloot te leggen. Maak kleine laterale incisies in de basis van de schedel aan beide zijden van het foramen magnum. Snijd vervolgens langs de sagittale hechting die begint bij het foramen magnum tot het bereiken van de naso-frontale hechting boven de reukbol. Trek de schaar omhoog tijdens de sagittale snede om schade aan het onderliggende hersenweefsel te voorkomen.
OPMERKING: Door het hoofd ondergedompeld te houden in de snijoplossing, wordt het uit het bloed verwijderd en blijft de temperatuur laag. - Gebruik de afgeronde tip pincet om de pariëtale botten op te trekken om de hersenen bloot te leggen. Let op om de hersenvlies te pakken te krijgen en ook te verwijderen. Als ze worden achtergelaten, kunnen ze de hersenen beschadigen tijdens de extractie.
- Gebruik de kleine spatel om de hersenen voorzichtig in de tweede Petrischaal te scheppen.
- Snijd de hersenen in helften langs de longitudinale spleet met behulp van het voorgekoelde mes.
- Gebruik de grote spatel om één halfrond uit de snijoplossing en op de plastic Petrischaal te tillen. Met de hersenhelft die op zijn mediale oppervlak ligt, lijnt u de pariëtale cortex uit met een van de parallelle lijnen om een referentie te hebben voor de tweede snede zoals weergegeven in figuur 1B.
- Voer de tweede snede uit op het ventrale deel van de hemisfeer en plaats het mes parallel aan de lijnen om het oppervlak te verkrijgen, dat later wordt gebruikt voor het lijmen van de hersenen op de monsterhouder (zie volgende stap), zoals weergegeven in figuur 1B. Breng de hemisfeer terug in de zuurstofrijke snijoplossing van de glazen petrischaal en voer dezelfde procedure uit op de tweede hemisfeer.
- Lijm de hemisferen met de vers gesneden ventrale zijde op de vibratome-monsterhouder met behulp van de lijm. Leg een paar druppels snijoplossing op de hemisferen om de lijm te stollen en verplaats de monsterhouder in de vibratome-lade. Op deze manier gaat het snijden van de rug naar de ventrale hippocampus.
- Verwijder de eerste een of twee niet-transversale segmenten (figuur 1C,ii-iii) totdat het interessegebied zichtbaar wordt en begin vervolgens met het verzamelen van de segmenten.
OPMERKING: Niet-transversale maar bruikbare, gezonde plakjes kunnen worden verkregen uit de dorsale hippocampus aan het begin van de snijprocedure (figuur 1C, ii-iii). De verzameling van elk segment duurt ongeveer 3-4 minuten. Door te beginnen met het snijden van de dorsale in plaats van ventrale hippocampus besparen we ongeveer 10 minuten, wat de levensvatbaarheid van dorsale plakjes verbetert. - Breng met een plastic pipet (snijd het smalle uiteinde van de punt weg) breng elk plakje over in de incubatiekamer (met snijoplossing bij 35 °C) en laat het 12 minuten rusten. De korte herstelperiode in warme snijoplossing vermindert de initiële neuronale zwelling aanzienlijk, zoals gerapporteerd in Ting et al. (2014)28. Breng vervolgens met een borstel het plakje over in de opslagkamer (met opslagoplossing bij RT) en laat het rusten tot het begin van het experiment.
4. Opname van hele cellen en biocytinevulling
OPMERKING: De beschrijving van de opname van de pleisterklem in hele cellen wordt hier alleen gereduceerd tot belangrijke stappen die helpen om een goede biocytinvulling te verkrijgen en is algemeen toepasbaar op neuronen in ACSF. Voor meer informatie over de procedures van elektrofysiologische opnamen kunnen verschillende andere protocollen worden geraadpleegd29,30.
- Kies een geschikte intracellulaire oplossing op basis van de te registreren parameters. Voor de huidige klemmetingen kan bijvoorbeeld een oplossing op basis van kaliumgluconaat worden gebruikt (in mM): 135 K-Gluconaat, 3 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 10 fosfocreatine-Na2,4 MgATP, 0,3 Na2-GTP. Stel de pH in op 7,3 met 1 M KOH. De osmolaliteit moet ongeveer 285-290 mOsmol/kg bedragen zodra 3-5 mg/ml biocytine is toegevoegd.
OPMERKING: Om de vorm van het neuron tijdens de opname te controleren, kan 0,3-0,5 μL/ml van 1 mM Alexa Fluor Hydrazide aan de intracellulaire oplossing worden toegevoegd. Onthoud in dit geval voor biocytin openbaring, om de Alexa-kleurstofkleur te matchen met de fluorescerende sonde gekoppeld aan streptavidin. - Bereid patchklemelektroden met ≤ 1 μm tipdiameter en 3-5 MΩ weerstand van dikwandige borosilicaatcapillairen.
- Start het perfusiesysteem van de patchklemopstelling met een snelheid van 2,5-3 ml/min bij RT of 35-37 °C en bevestig een plak in de kamer met een U-vormig anker.
- Identificeer het interessegebied van de hersenen en kies een gezond neuron met de soma ten minste 30-50 μm onder het oppervlak van de plak.
OPMERKING: De soma van een gezond neuron heeft een glad oppervlak en de membraanranden zijn enigszins gecontrastraseerd. De soma van ongezond neuron lijkt gekrompen en sterk gecontrastraseerd of gezwollen en semi-transparant. - Laad een glazen pipet met de intracellulaire oplossing totdat de punt van de AgCl-elektrode is afgedekt. Verplaats de pipet in de oplossing van de opnamekamer en oefen een lichtpositieve druk uit om de punt van de glazen elektrode vrij te houden.
OPMERKING: Als de oplossing een Alexa-kleurstof bevat, kan de druk visueel worden geregeld door de hoeveelheid fluorescerende oplossing die uit de tip wordt vrijgegeven, visueel aan te passen. Minimale druk zou de kleuring van het weefsel rond de cel voorkomen. - Benader de cel vanuit een schuine hoek en maak contact binnen het eerste een derde van het somaoppervlak bij het vormen van de giga-afdichting. Laat de druk los, beweeg het houdpotentieel langzaam naar-65 mV en breng een zachte zuiging via de mond aan om de giga-afdichtingsvorming te vergemakkelijken.
- Om de configuratie van de hele cel vast te stellen, moet u een sterke en korte zuigkracht aanbrengen om het membraan te breken. Gooi de opname weg als het neuron een membraanpotentieel heeft dat meer gedepolariseerd is dan-50 mV, als de houdstroom groter is dan 100 pA of als de toegangsweerstand groter is dan 30 MΩ.
- Na de opname (voor voldoende vulling van somata en dendrieten ten minste 15 min worden aanbevolen; voor het vullen van complexe axonen tot een uur misschien vereist31) voorzichtig verwijderen van de elektrode. Stel daartoe het houdpotentieel in op 0 mV en probeer een giga-afdichting opnieuw te vormen door de pipet langzaam in te trekken in de richting die tegenovergesteld is van de nadering, bijvoorbeeld om een patchconfiguratie buiten te verkrijgen.
OPMERKING: De aanwezigheid van de Alexa-kleurstof in de intracellulaire oplossingen helpt de visueel geleide verwijdering van de pipet van het neuronale oppervlak. Als de kern van de cel niet in contact komt met de pipetpunt, is een snelle methode om de afdichting te hervormen het diagonaal en omhoog trekken van de pipet uit het weefsel met hoge snelheid. Als de kern of een deel van het membraan zich in de punt bevindt, bestaat het gevaar dat het plasmamembraan wordt gebroken. In dit geval kan een lichte positieve druktoepassing en zijdelingse beweging helpen. - Let op de positie van de cel en de richting van het segment. Na fixatie kunnen de exacte oriëntatie van het segment en de integriteit van de gevulde cel worden gecontroleerd onder een fluorescerende microscoop.
5. Immunostaining, beeldverwerving en morfologische reconstructie
- Breng na het opnemen de plakjes over in een 24-puts plaat om het te fixeren in paraformaldehyde (PFA) 4% in 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Incubeer gedurende 60 minuten bij RT of 's nachts bij 4 °C, afhankelijk van de gevoeligheid van de gebruikte primaire antilichamen. Segmenten kunnen worden opgeslagen in 0,1 M PBS en 0,02% NaN3.
LET OP: PFA is giftig. Gebruik onder de motorkap. - Voer immunostaining en biocytin openbaring uit binnen een week na opname volgens de vastgestelde protocollen32,33.
OPMERKING: We gebruiken een procedure die het opnieuw doorsnijden van het segment voorkomt om de integriteit van dendritische en axonale processen te behouden. Deze procedure vereist echter langere incubatietijden omdat antilichamen in het weefsel moeten doordringen. We raden aan om de tijd te testen voor een optimale penetratie van antilichamen in het weefsel voordat u het experiment uitvoert. - Verkrijg afbeeldingen met behulp van een confocale microscoop met Z-stack en tegelscanfunctie.
- Voer morfologische reconstructie uit met Fiji imageJ34.
OPMERKING: Verschillende afbeeldingsbestandsindelingen kunnen in het programma worden geïmporteerd met behulp van de Bio-formaat plugin. We raden het gebruik van de Simple Neurite Tracer (STN) plugin35 aan voor de reconstructie van de dendrieten en de axon. Een eenvoudige en duidelijke tutorial is beschikbaar op https://imagej.net/SNT en http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. Het bestand met de traceringsgegevens(.traces), indien niet gecomprimeerd opgeslagen, kan worden geconverteerd naar een tekstbestand en worden geopend met Matlab of andere software voor tekstverwerking.
Representative Results
In dit protocol beschrijven we hoe we acute hippocampale plakjes kunnen bereiden uit het dorsaal-intermediaire deel van de hippocampus (figuur 1A). Het protocol is met name geschikt voor experimenten die mechanismen onderzoeken die betrokken zijn bij ruimtelijk leren en kan worden gecombineerd met gedragswerk of virale etiketterings- of manipulatiestrategieën in de dorsale hippocampus35. Toepassing van de hier beschreven doorsnedeprocedure op de dieren die met Cre-afhankelijk GFP zijn geïnjecteerd en adeno-geassocieerd virus (AAV-FLEX-GFP) uitdrukken in de dorsale hippocampus van Pvalb-IRES-Cre-muizen bij verschillende Bregma-coördinaten AP-1,94 mm, ML ± 0,5-2 mm, diepte-1,25-2,25 mm om verschillende gebieden van de hippocampale vorming te targeten36 konden we ten minste drie transversale plakjes verkrijgen die de geïnfecteerde gebieden bevatten (figuur 1A lichtgroene kleuring op het 3D-model van hippocampus). Bovendien kunnen verschillende niet-transversale maar gezonde plakjes worden verkregen uit de meer rooskleurige delen van de dorsale hippocampus (figuur 1C).
Om de kwaliteit en levensvatbaarheid van onze plakjes aan te tonen, hebben we fundamentele elektrofysiologische en morfologische parameters van korrelcellen en tdTomato-gelabelde Parvalbumine-positieve (PV+) interneurons in de dentate gyrus van Pvalb-IRES-Cre geregistreerd; Ai9 transgene muizen (7-12 weken oud) en vergeleken deze met opnames van coronale plakjes van dezelfde regio verkregen met een standaard protocol.
Bij visuele inspectie onder de infrarood differentieel-interferentiecontrast (IR-DIC) microscoop merkten we al duidelijke verschillen op tussen onze transversale en de coronale slice. Terwijl neuronen van de belangrijkste cellaag in coronale plakjes vaak grof leken en sterk contrasterende contouren vertoonden, vertoonden neuronen in de transversale plak meestal gladde oppervlakken en slechts licht gecontrasteerd randen, wat wijst op een betere cellulaire vitaliteit (figuur 2A). De reden voor deze verschillen in cel levensvatbaarheid tussen coronale en transversale plakjes kan liggen in de oriëntatie van het doorsnedevlak ten opzichte van de vezelkanalen. Omdat deze niet parallel lopen in de coronale secties, worden axonen en dendrieten doorgesneden. In overeenstemming met deze veronderstelling ontdekten we dat in de plakjes de oppervlaktevlakken van korrelcellaag en hilus een grotere discontinuïteit in de coronale vertoonden dan de transversale plak (stapgrootte in oppervlaktevlakken: 41,40 ± 3,28 μm vs 25,60 ± 2,94 μm, Gemiddelde ± SEM, Ongepaarde t-test P = 0,023), wat wijst op een grotere mate van weefselafkoppeling in de coronale plak (figuur 2B). Dit betekent dat geschikte cellen voor patchklemopnamen alleen worden gevonden in diepere vlakken van de korrelcellaag voor coronale plakjes, wat op zijn beurt de doorvoer van patchklemopnamen kan verminderen. Inderdaad, de gemiddelde tijd om de vorming in onze transversale plak af te dichten was sneller dan voor coronale plakjes (korrelcellen: 12,64± 1,50 s, n=11 in coronale vs. 8,40 ± 0,75 s, n=14 in transversale plakjes, Gemiddelde ± SEM, P= 0,0335 Mann-Whitney test; PV+ interneurons: 31,11 ± 2,60 s, n=9 in coronaal vs. 22,00 ± 2,18, n=7 in transversale plakjes, Gemiddelde ± SEM, P= 0,0283 Mann-Whitney test) (Figuur 2C). Als proxy voor celintegriteit en gezondheid registreerden we vervolgens de rustmembraanpotentialen (RMP) van korrelcellen en PV+ interneurons, die aanzienlijk meer gedepolariseerd waren in zowel korrelcellen als PV+ interneurons in coronaal vs. transversale plakjes (korrelcellen:-62,55 ± 3,54 mV, n=11 in coronaal vs.-71,06 ± 2,31 mV, n=14 in transversale plakjes, Gemiddelde ± SEM, P=0,0455 Mann-Whitney-test; PV+ interneurons:-52,75 ± 1,66 mV, n=7 in coronaal vs.-59,36 ± 2,25 mV, n=6 in transversale plakjes Gemiddelde ± SEM,, P= 0,0271 Mann-Whitney test) (Figuur 2D). Deze gegevens suggereren een hoger aantal gezonde neuronen in de transversale versus de coronale plakbereiding. De invoering van een cut-off voor het aanvaardbare RMP (-55 mV voor korrelcellen;-45 mV voor PV+ interneurons) resulteerde namelijk in een hoger percentage uitgesloten cellen in coronale dan in transversale plakjes (39,67 ± 8,37 %, n=3 experimentele sessies vs. 23,00 ± 3,85 %, n=4 experimentele sessies) (figuur 2E). Bovendien gaf reconstructie van neuronale morfologie uit geregistreerde korrelcellen aan dat, zoals verwacht, de kans veel beter was om een volledige axonale arborisatie voor korrelcellen in het transversale segment op te halen (figuur 3A,B). Bovendien maakte de morfologische reconstructie van PV+ interneurons in transversale plakjes de weergave van uitgebreide axonale en dendritische arborisaties mogelijk, inclusief de visualisatie van kleine details zoals dendritische stekels35(figuur 3C).
Figuur 1: Illustratie van de doorsnedeprocedure om plakjes te verkrijgen uit dorsaal-intermediaire hippocampus. (A) Driedimensionale weergave van de hippocampale formatie die zijn ruimtelijke oriëntatie in de hersenen laat zien (gewijzigd van Brain Explorer, Allen Institute)37. Dorsale, intermediaire en ventrale divisies van de hippocampus (dHPC, iHPC, vHPC) zijn geïndiceerd, volgens Dong et al. (2009)7. Het deel van dorsaal-intermediaire hippocampus dat wordt gesneden, wordt lichtgroen aangegeven. Het begin aan de rechterkant toont de richting van de referentieassen. (B) Cartoon van een hersenhelft die de uitlijning van de pariëtale cortex met de parallelle lijnen op de Petrischaal weergeeft. De rode stippellijn geeft aan waar de trimsnede (punt 3.9 in het protocol) moet worden uitgevoerd om het oppervlak te creëren voor het lijmen van de hemisfeer op de monsterhouder. De zwarte stippellijnen geven aan waar segmenten worden verzameld. (C) Heldere veldafbeeldingsreeksen van hippocampale plakjes die na deze procedure zijn verkregen. Van het pialoppervlak, van rug tot ventral: i) 0,70 mm, ii) 1,05 mm, iii) 1,40 mm, iv) 1,75 mm, v) 2,10 mm, (vi) 2,45 mm (vii) 2,80 mm, (viii) 3,15 mm. Schaalbalk= 1 mm. (D) Foto van de opbergkamer en het materiaal dat nodig is voor de montage. 1. Flacon afstandsrooster uit een 81x cryogene flacon opbergdoos, 2. Cylindrische plastic doos. 3. Nylon net, 4. Pipet tip. Inzet. Zijdelingse weergave van het raster en de buishouder om in de cilindrische doos te plaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De transversale slice toont verbeterde slice levensvatbaarheid in vergelijking met de coronale slice. (A) DIC-IR micrografen met gezonde (zwarte pijlen) en ongezonde (witte pijlen) voorbeelden van neuronale somata in transversale en coronale plakjes. Hil=hilus, gcl=korrelcellaag, ml= moleculaire laag. Schaalbalk = 50 μm. (B) Beide doorsnedeprocedures produceren een stap tussen het oppervlak van de korrelcellaag en de hilus (aangegeven door pijlpunten). De hoogte van de stap is indicatief voor de mate van weefselafkoppeling en is significant lager in transversale secties dan in coronale (n=5 transversale en n=5 coronale plakjes, Mean±SEM, P=0.0238 Mann-Whitney test). (C) Tijd van giga-ohm afdichtingsvorming in korrelcellen (n=14 cellen in transversale, n=11 cellen coronaal; Gemiddelde±SEM, P= 0,0355, Mann-Whitney test) en PV+ IN's (n=7 cellen in transversale, n=9 cellen in coronale plakjes, Gemiddelde±SEM, P= 0,0283 Mann-Whitney test) plakjes. (D) Rustmembraanpotentiaal (RMP) van gepatchte cellen (respectievelijk n= 14 en n=11 korrelcellen. Gemiddelde±SEM, P=0.0455 Mann-Whitney test. n=7 PV+ IN's en n=10 PV+ IN's, P= 0,0271 Mann-Whitney test). (E) Percentage afgedankte cellen binnen een experimentele sessie (n=3 sessies met coronale slice, n=4 met transversale slice, Mean±SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologische conservering van korrelcellen en interneurons in de transversale plak. Confocale afbeeldingen met biocytine gevulde korrelcellen in een transversale plak (A) en in een coronale plakjes (B) van Pvalb-IRES-Cre; Ai9 transgene muizen. De respectievelijke axonen zijn gereconstrueerd in grijs en lichtgrijs. Let op het verschil in axonlengte en complexiteit tussen de preparaten. Schaalbalk=100 μm. (C1) Confocale afbeelding met een met biocity gevulde tdTomato-positieve interneuron. Hil=hilus, gcl=korrelcellagen, ml= moleculaire laag. Schaalbalk=50 μm. (C2) Vergroting van het boxed gebied in C1, met dendritische stekels. Schaalbalk=2 μm (D) Morfologische reconstructie van axonen en dendrieten van het biocytine gevulde interneuron in C1 (axon in grijs, soma en dendrieten in zwart). (E) Close-up van de somata van de cellen afgebeeld in C1 met colocalisatie van biocytine en Parvalbumine-immunoreactiviteit (PVir). Schaalbalk=20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De dorsale hippocampus is uitgebreid bestudeerd voor zijn rol in ruimtelijk leren en navigatie, voornamelijk door gedragsexperimenten, anatomische tracering en regiospecifieke manipulaties. Om slice-electro-fysiologische onderzoeken met deze technieken te combineren, hebben we een protocol samengesteld dat een vergelijkbare doorsnedehoek gebruikt als het gewijzigde horizontale snijden voor het tussenliggende ventrale gebied van de hippocampus, maar een omgekeerde snijvolgorde gebruikt om vroege plakjes uit het dorsaal-tussenliggende gebied te verkrijgen. Deze aanpak vermindert de tijd die nodig is om het dorsale gebied van hippocampus te snijden en te verzamelen, waardoor de levensvatbaarheid van segmenten wordt verbeterd.
Met behulp van deze methode kunnen we routinematig ongeveer drie plakjes per halfrond van het dorsale hippocampale gebied tussen 1,4 mm-2,4 mm van het pialoppervlak ophalen, zoals weergegeven in figuur 1C. Hoewel het met deze procedure niet mogelijk is om transversale plakjes te verkrijgen van de zeer septale pool van de hippocampus, is het mogelijk om ongeveer twee extra levensvatbare niet-transversale plakjes per halfrond van de septale pool te verzamelen (figuur 1C ii,iii). Als de septale pool van de hippocampus de primaire onderzoeksfocus is, kunnen andere protocollen, die het verzamelen van transversale plakjes mogelijk maken, vooral van de zeer septale pool van de hippocampus, beter geschikt zijn21,32. Gedragsexperimenten op ruimtelijke navigatie en leren worden bij voorkeur uitgevoerd bij volwassen muizen met volledig ontwikkelde neuronale connectiviteit. Daarom hebben we onze snijprocedure geoptimaliseerd voor de toepassing op de hersenen van volwassen dieren (hier getoond voor muizen van drie maanden oud), die gevoeliger zijn voor stress dan het veerkrachtige juveniele preparaat. Hiertoe hebben we verschillende strategieën gecombineerd die de hypoxische stress verminderen waaraan de hersenen worden blootgesteld in de tijd tussen extractie en de plaatsing van de plakjes in het zuurstofrijke ACSF. De beschermende snijoplossing is een OP NMDG gebaseerde ACSF25,27,28 met lage Na+ en Ca2+ maar hoge Mg2+ om excitotoxische schade en celzwelling als gevolg van activering van NMDA-receptoren te verminderen. Daarnaast zorgt HEPES voor stabiele buffering en verminderen verbindingen zoals ascorbaat en pyruvaat oxidatieve stress. De transcardiale perfusie met de gekoelde en zuurstofrijke beschermende snijoplossing maakt gebruik van het extreem dichte capillaire netwerk dat de hersenen levert om de metabolische vraag en glutamaat-geïnduceerde excitotoxiciteit in het hersenweefsel snel en homogeen te verminderen. Vervolgens worden bijna alle stappen na onthoofding uitgevoerd binnen de gekoelde en zuurstofrijke oplossingen om het metabolisme en zuurstoftekort gedurende de hele procedure tot een minimum te beperken. Andere strategieën voor het verminderen van hersenbeschadiging tijdens het snijden bestaan en kunnen even geldig zijn38. Om de kwaliteit van onze bereiding aan te tonen, vergelijken we het met een coronale plakbereiding, die vaak wordt gebruikt om op te nemen vanaf de dorsale hippocampus. Hoewel coronale plakjes kunnen worden gebruikt om een goede patchklemopname in de dentate gyrus te verkrijgen, is het aantal ongezonde en losgekoppelde neuronen hoger dan in de transversale plak. Bovendien wordt de integriteit van de axonale en dendritische arborisaties beter bewaard in de transversale plak. In feite dient de integriteit van korrelcelaxonen (figuur 3A), die orthogonaal naar de lengteas van de hippocampus lopen, als indicator van een transversaal snijvlak1.
Voor het vullen van gepatchte neuronen stellen we een elektrodeweerstand tussen 3 en 5 MΩ voor. Een diameter van de punt van ongeveer 1 μm, maakt het mogelijk om een goede afdichtingsweerstand te bereiken tijdens het opnemen en een goede herafdichting bij het terugtrekken van de elektrode. Het meest cruciale detail is om het afzuigen van delen van de soma of kern in de pipet te voorkomen. Om deze reden raden we aan om indien mogelijk een Alexa-kleurstof in de intracellulaire oplossing op te nemen. De kleurstof maakt het mogelijk om de celvorm te controleren tijdens het opnemen en opnieuw afdichten. Bovendien maakt het mogelijk om de integriteit van de gepatchte cel na fixatie te beoordelen, wat immunohistochemietijd kan besparen, in gevallen van mislukte vullingen. Vanwege Alexa-kleurstoffen worden geblust met lange fixatietijd, raden we indien mogelijk korte fixatie aan.
Voor volgende immunostaining gebruiken we een protocol waarvoor het segment niet opnieuw hoeft te worden doorgesneden. We raden aan om de kleuring binnen een week na fixatie te maken. Hoe langer de plakjes in de koelkast blijven, hoe groter de kans op weefseldegradatie. Als een lange opslag niet kan worden vermeden, raden we aan de NaN3-concentratie in de PBS te verhogen tot 0,05% en deze wekelijks te vernieuwen. Immunostainring van de hele plak betekent dat de incubatietijden met primaire en secundaire antilichamen toenemen. Meestal is voor het onthullen van biocytine één nachtelijke incubatie bij 4 °C voldoende, maar in combinatie met de kleuring voor andere eiwitten kan de hele kleuringsprocedure veel langer duren. Permeabilisatie-blokkerende en anti-body incubatie moeten individueel worden geoptimaliseerd. Meestal zijn twee dagen voor het primaire antilichaam voldoende, terwijl één dag voldoende kan zijn voor de secundaire. We raden aan om de duur van de wasstappen te verlengen samen met langere antilichaamincubaties om de toename van de achtergrond te voorkomen.
In dit protocol hebben we een snijmethode gepresenteerd om transversale of bijna transversale hippocampale plakjes te verkrijgen die de neuronale levensvatbaarheid van volwassen weefsel behouden en een praktische aanpak om de morfologie en de neurochemische identiteit van de gepatchte neuronen te herstellen. Deze methode kan eenvoudig worden uitgevoerd om elektrofysiologische resultaten te matchen met anatomische en gedragsstudies gericht op het tussenliggende dorsale deel van de hippocampus.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Kerstin Kronenbitter en Didier Gremelle voor de technische hulp. We danken Umberto Morelli voor hulp bij grafische software en Mathias Hoppe voor videografie en videobewerking. Het werk in ons lab werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Project-ID 434434223) en GRK2154, de Medical Research Council grant G1100546/2 en Kiel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
| 24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
| 81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
| Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
| Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
| Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
| Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
| Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
| Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
| Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
| Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
| Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
| EGTA | Roth | 3054.1 | |
| Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
| Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
| Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
| Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
| Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
| Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
| Large spatula | Roth | E286.1 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
| Microfil | World precision instruments | MF34G | |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
| Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
| Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
| Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
| Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
| Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
| Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
| Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
| Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
| Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
| Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
| Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
| Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
| Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
| Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
| Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
| Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
| Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
| Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |
References
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- David, A., Pierre, L. Hippocampal Neuroanatomy. The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).
- Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).
- Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).
- Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
- Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).
- Cembrowski, M. S., Spruston, N. Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons. Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).
- Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).
- Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory. European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).
- Fredes, F., et al. Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation. Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
- Andersen, P.
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium. Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).
- Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Davie, J. T., et al.
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
- Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus. Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).
- Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).
- Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61377 (2020).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706 (2014).
- Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. Journal of Visualized Experiments. (118), e54880 (2016).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Murray, A. J., et al. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).
- Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release. Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).
- Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry. Neuromethods. 67, 103-125 (2012).
