Summary
Vi presenterar ett protokoll för att förbereda akuta skivor från dorsala-mellanliggande hippocampus av möss. Vi jämför denna tvärgående förberedelse med koronal skivning när det gäller kvalitet på inspelningar och bevarande av morfologiska funktioner i registrerade nervceller.
Abstract
Även om hippocampus allmänna arkitektur är likartad längs dess längsgående axel, har nyligen genomförda studier visat framträdande skillnader i molekylära, anatomiska och funktionella kriterier som tyder på en uppdelning i olika underkretsar längs dess rostro-caudal utsträckning. På grund av differentiell anslutning och funktion görs den mest grundläggande skillnaden mellan dorsal och ventral hippocampus, som företrädesvis är involverade i rumslig respektive känslomässig bearbetning. Därför har in vivo-arbetet med rumslig minnesbildning fokuserat på dorsala hippocampus.
Däremot har elektrofysiologiska in vitro-inspelningar företrädesvis utförts på mellanliggande ventrala hippocampus, till stor del motiverade av faktorer som skivans livskraft och kretsintegritet. För att möjliggöra direkt korrelation av in vivo-data om rumslig bearbetning med in vitro-data har vi anpassat tidigare sektionsmetoder för att erhålla mycket livskraftiga tvärgående hjärnskivor från dorsala-mellanliggande hippocampus för långsiktiga inspelningar av huvudceller och interneuroner i dentate gyrus. Eftersom rumsligt beteende rutinmässigt analyseras hos vuxna möss har vi kombinerat detta tvärgående skivningsförfarande med användning av skyddande lösningar för att förbättra livskraften hos hjärnvävnad från mogna djur. Vi använder detta tillvägagångssätt för möss i ca 3 månaders ålder. Metoden erbjuder ett bra alternativ till koronalpreparatet som ofta används för in vitro-studier på dorsala hippocampus. Vi jämför dessa två preparat när det gäller kvaliteten på inspelningar och bevarande av morfologiska funktioner hos registrerade nervceller.
Introduction
Hippocampus har studerats mycket för sin centrala roll i olika aspekter av lärande och minne, rumslig navigering samt känslor. Hippocampus grundläggande kretsar, vanligen kallad "trisynaptisk krets", är ett lamellärt nätverk i den tvärgående axeln, som till stor del bevaras längs den längsgående axeln1. Hippocampus bidrag till olika kognitiva och känslomässiga beteenden uppstår sannolikt från de olika anslutningarna som denna grundläggande krets gör längs dorsoventralaxeln med flera andra hjärnregioner2,3. Utöver afferent och efferent anslutning pekar dock ett ökande antal studier mot ytterligare skillnader längs hippocampus septo-temporala axel. Sådana skillnader gäller den interna arkitekturen och anslutningen samt skillnader i genuttrycksmönster och neuronal morfologi4,5,6,7,8.
Med tanke på förekomsten av sådana skillnader i de grundläggande kretsarna är det rimligt att välja den specifika hippocampala underkretsen som ska undersökas enligt de frågor som tas upp. Om frågan till exempel gäller neuronala mekanismer som är involverade i rumslig bearbetning, är dorsal snarare än ventral hippocampus av intresse, även om de två inte agerar självständigt in vivo på grund av intra-hippocampal longitudinellanslutning 9,10,11. Längs dessa linjer måste inte bara skillnaderna längs den längsgående axeln beaktas utan det krävs också försiktighet för att bevara lokala och långdistanskretsar så bra som möjligt. För bevarandet av fiberbanorna och anslutningen är vinkeln där hjärnan kommer att delas upp viktig.
Den första metoden som rapporterades i litteraturen för att inkludera den trysinaptiska kretsen isolerade först hippocampus från hjärnan och gjorde sedan tvärgående skivor (vinkelrätt mot de längsgående axlarna) med hjälp av en vävnadshackare12 och en vibratome13. Senare fysiologer föredrog att få skivor från ett helt hjärnblock för att bevara även de intilliggande hjärnstrukturerna kopplade till hippocampus. För dessa blockpreparat har olika sektionsvinklar med avseende på hippocampus utvecklats, såsom en koronal skivaberedning 14 eller en horisontell skiva förberedelse som heter HEC skiva för att bevara hippocampal-entorhinal cortex anslutningar15,16,17.
I den senare beredningen skärs parietalloben med en vinkel på 0° eller 12° med avseende på det horisontella planet längs rostro-kaudalaxeln för att bilda blockets botten. Skivor samlas sedan in från hjärnans ventrala yta, vilket främst möjliggör skörden av den mellanliggande ventrala hippocampalregionen. Denna metod har blivit det mest populära valet för fysiologiska studier och kan utföras tillförlitligt enligt flera publicerade protokoll18,19,20.
Men om forskningsintresset rör specifika aspekter av rumsligt lärande, kan dorsala hippocampus vara den lämpligare regionen för undersökning och det skulle vara användbart att hitta ett skivningsförfarande av liknande kvalitet för denna hippocampal region. Få protokoll, som fokuserar på den mycket rostrala polen, har utvecklats som kan uppfylla denna efterfrågan 21,22.
I detta protokoll beskriver vi istället en metod för att erhålla livskraftiga tvärgående skivor från dorsala-mellanliggande hippocampus som använder den sektionsvinkel som tidigare beskrivits förhorisontella preparat 18,19 (Figur 1A& B). Vi visar kvaliteten på detta protokoll genom att jämföra elektrofysiologiska inspelningar och morfologiska rekonstruktioner i detta preparat med de som erhålls i koronal skivor. Detta protokoll är särskilt lämpligt för kombination med anatomiska och beteendemässiga experiment hos vuxna möss (tre månader gamla i vårt fall).
Protocol
Alla försök med försöksdjur var i enlighet med den tyska djurskyddslagen och godkändes av kiels universitets etiska kommitté. Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre)möss 23 (Jackson laboratorier, Databasnummer 008069) bibehölls som heterozygous kolonier eller korsades med Ai9 Cre reporter möss24 (Jackson laboratorier, Databasnummer 007909). Hon- och hanmöss mellan P40-P90 användes. Möss hölls i en 12-h ljus-mörk cykel under standard grupphusförhållanden och var försedda med mat och vatten ad libitum.
1. Utarbetande av lösningar
OBS: Förbered nya lösningar för varje experimentell dag med ultrapurevatten (UPW) (resistivitet vid 25 °C 18,2 MΩcm). Lösningarna får förvaras vid 4 °C i högst en dag. Magnesium- och kalciumlösningar kan lagras separat som 1 M lagerlösningar. Alla arbetslösningar måste vara mättade med karbagen (95% O2:5% CO2) för optimal syresättning och pH-underhåll före och under användning.
- Förbered skärlösningen (500 ml per mus) (i mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukos, 5 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvat, 0,5 CaCl2·2H2O och 10 MgSO4·7H2O. Titrate till pH 7,4 under en kemisk huva med 4-5 ml 16% saltsyra innan du tillsätter de divalenta cationerna. Detta kommer att undvika nederbörd av MgSO4.
OBS: KCl och NaH2PO4 kan förvaras som 10x lösningar vid 4°C. Vi gör två enskilda partier av skärlösning. En dagen före inspelningen (lagrad i en frys över natten för att producera krossad is) och en på inspelningsdagen. - Förbered lagringslösningen (250 ml per mus) (i mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukos, 5 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvat, 2 CaCl2·2H2O och 2 MgSO4·7H2O. Titrate till pH 7.3-7.4 med 1 N NaOH.
OBS: NaCl, KCl och NaH2PO4 kan fyllas som 10x lösning vid 4 °C. - Förbered ACSF för inspelning (i mM): 122 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4,24 NaHCO3,12,5 glukos, 2 CaCl2·2H2O och 2 MgSO4·7H2O, 2 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvat. Titrera pH till 7,3-7,4 med 1 N NaOH.
OBS: NaCl, KCl och NaH2PO4 kan kombineras i en 10x lagerlösning vid 4°C.
2. Förberedelse av bänken för skivning
- Förbered på is en bägare (150 ml) och två petriskålar i glas (10 cm diameter) och fyll dem med den färska skärlösningen. Håll lösningen syresatt med en carbogen bubblande enhet (ett perforerat rör eller en luftsten ansluten till karbaogensystemet).
OBS: Lösningen i bägaren kommer att användas för perfusionen medan petriskålarna kommer att användas under skärproceduren. - Utrusta operationsbänken med ett blad i rostfritt stål, rundade spets pincett, finspets pincett, stor sax, liten sax, en stor metallspatel, en tunn metallspatel, en borste, vibratomeplattan och cyanoakrylatlimet eller det mindre giftiga n-butyl-ester cyanoakrylatlimet. Doppa ett blad i rostfritt stål och ett filterpapper i en av petriskålarna i glas på is. Petri kommer att användas för att skära hjärnan. Dra tre parallella linjer på botten av en petriskål av plast och placera denna skål nära de kirurgiska instrumenten.
- Förbered uppsättningen för transkortialperfusion enligt publicerade protokoll25.
- Förbered vibratomen, montera ett nytt blad på bladhållaren och ställ in parametrarna för skärning (vinkel på bladet från horisontellt plan 17°, bladoscillationsamlitud 1,5 mm, blad framåtrörelsehastighet vid cirka 2 mm min-1, svängningsfrekvens 90 Hz, sektionstjocklek 350 μm). Fyll vibratomebrickan med iskall skärlösning och håll den under konstant syresättning.
OBS: Vi lägger till den krossade isen gjord av den första satsen skärlösning till den kylda färska skärlösningen för att hålla temperaturen nere. Var uppmärksam på att hålla isen från bladet medan du skär. - Förbered en inkubationskammare fylld med skärlösningen under konstant syresättning. Placera kammaren i ett förvärmt vattenbad (35 °C).
OBS: Ett exempel för inkubationskammaren finns i Edwards och Konnerth (1992)26. - Förbered en skiva förvaringskammare fylld med lagringslösningen och håll den vid rumstemperatur och under konstant syresättning. Om vävnaden uttrycker ett fluorescerande protein eller en ljusaktiverad opsin, rekommenderas att hålla kammaren i mörkret, till exempel inuti en låda.
OBS: En förvaringskammare med flera oberoende brunnar är användbar för att skilja nivån på skivorna längs Hippocampus dorsoventralaxel. En specialtillverkad kammare kan byggas (figur 1D). Ta en bit av vialdistansgallret från en 81x kryogen injektionsflaska och limma fast botten på ett nylonnät. Sätt in den övre tredjedelen av en 5mL pipettplastspets i mitten av detta galler, så att den sticker ut ca 3 cm längst ner. Denna plastspets fungerar som gallrets stativ och håller senare luftslangen för syresättning. För in gallret med stativet i en cylindrisk plastlåda (t.ex. förpackning av sprutfilter) så att det inte kan luta eller vifta. Denna reservoar rymmer 250 ml lagringslösning.
3. Beredning av hippocampal skivor
- Söv musen i en låda med isofluran (ca 0,5 ml) under huven. Låt musen vila tills andningen är långsam och regelbunden (ca 2-3 minuter). Test för frånvaro av smärtsvar med tå nypor.
- Utför transkardiell perfusion med 25 ml kolsyrad skärlösning från bägaren på is enligt publicerade protokoll25,27. Detta steg rekommenderas att kyla ner hjärnan snabbt för att snabbt bromsa neuronal metabolism.
- Halshugg djuret med den stora saxen och placera huvudet i den kylda Petri-skålen på is som innehåller skärlösningen.
- Öppna huden med den fina saxen för att exponera skallen. Gör små laterala snitt i basen av skallen på båda sidor av foramen magnum. Skär sedan längs sagittal suturen som börjar vid foramen magnum tills den når naso-frontal suturen ovanför luktlampan. Dra upp saxen under sagittalsnittet för att undvika skador på den underliggande hjärnvävnaden.
OBS: Att hålla huvudet nedsänkt i skärlösningen hjälper till att rensa det från blod och håller temperaturen nere. - Använd den rundade spets pincetten för att dra upp parietalbenen för att exponera hjärnan. Var uppmärksam på att få tag på och ta bort hjärnhinnorna också. Om de lämnas, kan de skada hjärnan under extraktion.
- Använd den lilla spateln för att försiktigt skopa ut hjärnan i den andra Petri-skålen.
- Skär hjärnan i halvor längs den längsgående sprickan med det förkylda bladet.
- Använd den stora spateln för att lyfta en halvklot ur skärlösningen och på petriskålen av plast. Med halvklotet liggande på sin mediala yta, justera parietal cortex med en av de parallella linjerna för att ha en referens för det andra snittet som visas i figur 1B.
- Utför det andra snittet vid den ventrala delen av halvklotet som placerar bladet parallellt med linjerna för att erhålla ytan, som senare används för att limma hjärnan på provhållaren (se nästa steg), som visas i figur 1B. Sätt tillbaka halvklotet i den syresatt skärlösningen av glas petriskålen och utför samma procedur på andra halvklotet.
- Limma halvkloten med den nyskurna ventrala sidan på vibratomeprovhållaren med hjälp av limet. Lägg några droppar skärlösning på halvkloten för att stelna limet och flytta provhållaren i vibratomebrickan. På så sätt fortsätter skivningen från dorsalen till ventrala hippocampus.
- Ta bort de första en eller två icke-tvärgående segmenten (figur 1C, ii-iii) tills intresseområdet blir synligt och börja sedan samla in skivorna.
OBS: Icke-tvärgående men användbara, friska skivor kan erhållas från dorsala hippocampus i början av skivningsproceduren (Figur 1C,ii-iii). Samlingen av varje skiva kräver ca 3-4 min. Genom att starta skärning från dorsal istället för ventral hippocampus sparar vi ca 10 minuter, vilket förbättrar livskraften hos dorsala skivor. - Överför varje skiva till inkubationskammaren (innehållande skärlösning vid 35 °C) med en plastpipett (skär bort spetsens smala ände) och låt den vila i 12 minuter. Den korta återhämtningsperioden i varm skärlösning minskar kraftigt initial neuronal svullnad, som rapporterats i Ting et al. (2014)28. Överför sedan skivan till förvaringskammaren (som innehåller lagringslösning på RT) med en borste och låt den vila tills experimentet börjar.
4. Registrering av hela celler och biocytinfyllning
OBS: Beskrivningen av hela cell patch-clamp inspelning reduceras här endast till viktiga steg som hjälper till att få bra biocytin fyllning och är allmänt tillämplig på nervceller i ACSF. För detaljer om förfarandena för elektrofysiologiska inspelningar kan flera andra protokoll konsulteras29,30.
- Välj en lämplig intracellulär lösning enligt de parametrar som ska registreras. Som ett exempel, för nuvarande klämmätningar, kan en kaliumglukonatbaserad lösning användas (i mM): 135 K-Glukonat, 3 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 10 fosfocreatine-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na2-GTP. Justera pH till 7,3 med 1 M KOH. Osmolaliteten bör vara cirka 285-290 mOsmol/kg när 3-5 mg/ml biocytin tillsätts.
OBS: För att övervaka neuronens form under inspelningen kan 0,3-0,5 μL/ml 1 mM Alexa Fluor Hydrazide tillsättas till den intracellulära lösningen. I det här fallet, kom ihåg för biocytin uppenbarelse, att matcha Alexa färgfärg med fluorescerande sonden i kombination med streptavidin. - Förbered patchklämmalektroder med ≤1 μm spetsdiameter och 3-5 MΩ motstånd från tjockväggiga borosilikat kapillärer.
- Starta perfusionssystemet för patchklämman med en hastighet av 2,5-3 ml/min vid RT eller 35-37 °C och fäst en skiva i kammaren med ett U-format ankare.
- Identifiera hjärnans region av intresse och välj en hälsosam neuron med soma minst 30-50 μm under skivans yta.
OBS: Soma av en frisk neuron har en slät yta, och membrangränserna är något kontrasterade. Soma av ohälsosam neuron verkar krympt och mycket kontrasterad eller svullen och halvtransparent. - Ladda en glaspipett med den intracellulära lösningen tills spetsen på AgCl-elektroden är täckt. Flytta pipetten in i inspelningskammarens lösning och tryck lätt för att hålla glaselektrodens spets borta.
OBS: Om lösningen innehåller ett Alexa-färgämne kan trycket styras visuellt justera mängden fluorescerande lösning som frigörs från spetsen. Minimalt tryck skulle undvika färgning av vävnaden runt cellen. - Närma dig cellen från en sned vinkel och etablera kontakt inom den första tredjedelen av somaytan när du bildar giga-tätningen. Släpp trycket, flytta långsamt hållpotentialen till 65 mV och applicera en mild sug genom munnen för att underlätta giga-tätningsbildningen.
- För att upprätta helcellskonfigurationen, applicera stark och kort sugning för att bryta membranet. Kassera inspelningen om neuron har en membranpotential som är mer depolariserad än 50 mV, om hållströmmen ökar över 100 pA eller om åtkomstmotståndet ökar över 30 MΩ.
- Efter registreringen (för tillräcklig fyllning av somata och dendriter rekommenderas minst 15 min; för fyllning av komplexa axoner upp till en timme som kanskekrävs 31) ta försiktigt bort elektroden. Ställ därför in hållpotentialen på 0 mV och försök att omforma en giga-tätning genom att långsamt dra tillbaka pipetten i motsatt riktning från inflygningen, till exempel för att få en utvändig patchkonfiguration.
OBS: Närvaron av Alexa-färgämnet i de intracellulära lösningarna hjälper till att visuellt styra avlägsnandet av pipetten från neuronalytan. Om cellens kärna inte är i kontakt med pipettspetsen, drar en snabb metod för att reformera tätningen pipetten ur vävnaden diagonalt och uppåt i hög hastighet. Om kärnan eller en del av membranet finns i spetsen finns det risk för att plasmamembranet bryts. I detta fall kan en liten positiv tryckapplikation och laterala rörelser hjälpa. - Notera cellens position och segmentens orientering. Efter fixering kan den exakta orienteringen av segmentet och integriteten hos den fyllda cellen kontrolleras under ett fluorescerande mikroskop.
5. Immunostaining, bildförvärv och morfologisk rekonstruktion
- Efter registrering, överför skivorna till en 24-brunnsplatta för att fixa den i paraformaldehyd (PFA) 4% i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Inkubera i 60 minuter vid RT eller över natten vid 4 °C, beroende på känsligheten hos de primära antikroppar som används. Skivor kan lagras i 0,1 M PBS och 0,02% NaN3.
VARNING: PFA är giftigt. Använd under huven. - Utför immunostaining och biocytin uppenbarelse inom en vecka efter registrering enligt etablerade protokoll32,33.
OBS: Vi använder en procedur som undviker omsektionering av skivan för att bevara integriteten hos dendritiska och axonal processer. Detta förfarande kräver dock längre inkubationstider eftersom antikroppar måste tränga in i vävnaden. Vi föreslår att man testar tiden för optimal penetration av antikroppar i vävnaden innan experimentet utförs. - Hämta bilder med ett konfokalt mikroskop med Z-stack och kakelskanningsfunktion.
- Utför morfologisk rekonstruktion med Fiji imageJ34.
Obs: Flera bildfilformat kan importeras till programmet med hjälp av bioformat plugin. Vi rekommenderar användning av Simple Neurite Tracer (STN) plugin35 för återuppbyggnad av dendriterna och axon. En enkel och tydlig handledning finns tillgänglig på https://imagej.net/SNT och http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. Filen som innehåller kalkeringsdata(.traces), om den sparas okomprimerad, kan konverteras till en textfil och öppnas med Matlab eller annan programvara för textdatabehandling.
Representative Results
I detta protokoll beskriver vi hur man förbereder akuta hippocampal skivor från dorsala-mellanliggande delen av hippocampus (Figur 1A). Protokollet är särskilt lämpligt för experiment som undersöker mekanismer som är involverade i rumsligt lärande och kan kombineras med beteendearbete eller viral märkning eller manipulationsstrategier i dorsala hippocampus35. Tillämpa det sektioneringsförfarande som beskrivs här på de djur som injicerats med Cre-beroende GFP som uttrycker adeno-associerat virus (AAV-FLEX-GFP) i dorsala hippocampus av Pvalb-IRES-Cre möss vid olika Bregma koordinater AP-1,94 mm, ML ± 0,5-2 mm, djup-1,25-2,25 mm för att rikta in oss på olika regioner i hippocampal bildandet36 kunde vi få minst tre tvärgående skivor som innehåller de infekterade regionerna (Figur 1A ljusgrön färgning på 3D-modellen av hippocampus). Dessutom kan flera icke-tvärgående men hälsosamma skivor erhållas från de mer rostrala delarna av dorsala hippocampus (Figur 1C).
För att visa kvaliteten och livskraften hos våra skivor har vi registrerat grundläggande elektrofysiologiska och morfologiska parametrar för granulatceller och tdTomato-märkta Parvalbumin-positiva (PV +) interneuroner i dentate gyrus av Pvalb-IRES-Cre; Ai9 transgena möss (7-12 veckors ålder) och jämförde dessa med inspelningar från koronalskivor i samma region som erhållits med ett standardprotokoll.
Vid visuell inspektion under det infraröda differentialinterferenskontrasten (IR-DIC) mikroskopet märkte vi redan tydliga skillnader mellan vår tvärgående och koronalskivan. Medan nervceller i huvudcellskiktet i koronalskivor ofta föreföll grov och visade starkt kontrasterade konturer, visade neuroner i tvärgående skiva mestadels släta ytor och endast lätt kontrasterade gränser, vilket tyder på bättre cellulär vitalitet (Figur 2A). Orsaken till dessa skillnader i cell livskraft mellan koronal och tvärgående skivor kan ligga i orienteringen av sektioneringsplanet med avseende på fiber skrifterna. Eftersom dessa inte är parallella i koronarsektionerna kommer axoner och dendriter att avskuras. I linje med detta antagande fann vi att ytplanerna för granulatcellskikt och hilus inom skivorna visade större diskontinuitet i koronalen än den tvärgående skivan (stegstorlek i ytplan: 41,40 ± 3,28 μm jämfört med 25,60 ± 2,94 μm, Medelvärde ± SEM, Unpaired t-test P = 0,023), vilket tyder på en större grad av vävnadsavkoppling i koronarskivan (Figur 2B). Detta innebär att lämpliga celler för patchklämmainspelningar endast kommer att hittas på djupare plan i granulatcellskiktet för koronarskivor, vilket i sin tur kan minska genomströmningen av patchklämmainspelningar. Faktum är att den genomsnittliga tiden att försegla bildandet i vår tvärgående skiva var snabbare än för koronala skivor (granulatceller: 12,64± 1,50 s, n=11 i koronal jämfört med 8,40 ± 0,75 s, n=14 i tvärgående skivor, Medelvärdet ± SEM, P= 0,0335 Mann-Whitney-test; PV+ interneuroner: 31,11 ± 2,60 s, n=9 i koronal jämfört med 22,00 ± 2,18, n=7 i tvärgående skivor, Medelvärdet ± SEM, P= 0,0283 Mann-Whitney-test) (Figur 2C). Som en proxy för cellintegritet och hälsa registrerade vi sedan vilomembranpotentialerna (RMP) av granulatceller och PV + interneuroner, som var betydligt mer depolariserade i både granulatceller och PV + interneuroner i koronar vs. Tvärgående skivor (granulatceller:-62,55 ± 3,54 mV, n=11 i koronal jämfört med 71,06 ± 2,31 mV, n=14 i tvärgående skivor, Medelvärdet ± SEM, P=0,0455 Mann-Whitney-test; PV+ interneurons:-52.75 ± 1.66 mV, n=7 i koronal vs.-59.36 ± 2.25 mV, n=6 i tvärgående skivor Medelvärde ± SEM,, P= 0.0271 Mann-Whitney test) (Figur 2D). Dessa data tyder på ett högre antal friska nervceller i tvärgående kontra koronal skiva förberedelse. Införandet av en cut-off för godtagbar RMP (-55 mV för granulatceller;-45 mV för PV + interneurons) resulterade i en högre andel uteslutna celler i koronal än i tvärgående skivor (39,67 ± 8,37 %, n=3 experimentella sessioner jämfört med 23,00 ± 3,85 %, n=4 experimentella sessioner) (figur 2E). Dessutom indikerade återuppbyggnaden av neuronal morfologi från registrerade granulatceller att som förväntat var chanserna mycket bättre att hämta en fullständig axonal arborization för granulatceller i den tvärgående delen (Figur 3A, B). Dessutom tillät den morfologiska återuppbyggnaden av PV + interneuroner i tvärgående skivor skildringen av omfattande axonal och dendritiska arborizations inklusive visualisering av små detaljer som dendritiskaryggrader 35(Figur 3C).
Figur 1: Illustration av sektioneringsförfarandet för att erhålla skivor från dorsala-mellanliggande hippocampus. (A) Tredimensionell representation av hippocampalbildningen som visar dess rumsliga orientering i hjärnan (modifierad från Brain Explorer, Allen Institute)37. Dorsala, mellanliggande och ventrala divisioner av hippocampus (dHPC, iHPC, vHPC) anges, enligt Dong et al. (2009)7. Den del av dorsala-mellanliggande hippocampus som kommer att skäras indikeras i ljusgrönt. Inset till höger visar referensaxlars orientering. (B) Tecknad film av en hjärnhalva som visar justeringen av parietal cortex med de parallella linjerna på Petri-skålen. Den röda prickade linjen anger var trimningssnittet (punkt 3.9 i protokollet) ska utföras för att skapa ytan för limning av halvklotet på provhållaren. De svarta prickade linjerna anger var segment samlas in. (C) Ljus fältbildserie av hippocampala skivor som erhållits enligt denna procedur. Från pialytan, dorsala till ventrala: i) 0,70 mm, ii) 1,05 mm, iii) 1,40 mm, iv) 1,75 mm, v) 2,10 mm, vi) 2,45 mm (vii) 2,80 mm, viii) 3,15 mm. Skalstång= 1 mm. (D) Foto av förvaringskammaren och det material som behövs för dess montering. 1. Vial distansnät från en 81x kryogen injektionsflaska förvaringslåda, 2. Cylindrisk plastlåda. 3. Nylon nät, 4. Pipettspets. Infälld. Sidovy av gallret och rörhållaren för att sätta in i den cylindriska lådan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Den tvärgående skivan visar förbättrad skärkraft jämfört med koronalskivan. (A) DIC-IR mikrografer som visar friska (svarta pilar) och ohälsosamma (vita pilar) exempel på neuronal somata i tvärgående och koronala skivor. Hil=hilus, gcl=granulat cellskikt, ml= molekylärt skikt. Skalstång = 50 μm. (B) Båda sektioneringsförfarandena ger ett steg mellan ytan på granulatcellskiktet och hilusen (indikeras av pilhuvuden). Stegets höjd indikerar omfattningen av vävnadsfrånkoppling och är betydligt lägre i tvärsnitt än i koronal (n=5 tvärgående och n=5 koronala skivor, Mean±SEM, P=0,0238 Mann-Whitney test). C)Tid för giga-ohm tätningsbildning i granulatceller (n=14 celler i tvärgående, n=11 celler koronal; Medelvärde±SEM, P= 0,0355, Mann-Whitney-test) och PV+ IN (n=7 celler i tvärgående, n=9 celler i koronalskivor, Medelvärde±SEM, P= 0,0283 Mann-Whitney-test) skivor. (D) Vilande membranpotential (RMP) hos celler som korrigerats (respektive n= 14 respektive n=11 granulatceller. Medelvärde±SEM, P=0.0455 Mann-Whitney test. n=7 PV+ INs och n=10 PV+ INs, P= 0.0271 Mann-Whitney test). (E) Procentandel kasserade celler inom en experimentell session (n=3 sessioner med koronal skiva, n=4 med tvärgående segment, Medelvärde±SEM). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Morfologisk konservering av granulatceller och interneuroner i tvärgående skiva. Konfokala bilder som visar biocytinfyllda granulatceller i en tvärgående skiva (A) och i en koronal skiva (B) av Pvalb-IRES-Cre; Ai9 transgena möss. Respektive axoner har rekonstruerats i grått och ljusgrå. Notera skillnaden i axonlängd och komplexitet mellan preparaten. Skala bar=100 μm. (C1) Confocal bild som visar en biocityn-fylld tdTomato-positiv interneuron. Hil=hilus, gcl=granulat celllager, ml= molekylärt skikt. Skala stång=50 μm. (C2) Förstoring av det boxade området i C1, som visar dendritiska ryggrader. Skala bar=2 μm (D) Morfologiska återuppbyggnad av axoner och dendriter av biocytin fyllda interneuron i C1 (axon i grått, soma och dendriter i svart). (E) Närbild på somata av de celler som avbildas i C1 som visar colocalization av biocytin och Parvalbumin-immunoreactivity (PVir). Skala bar=20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Dorsala hippocampus har studerats utförligt för sin roll i rumsligt lärande och navigering främst genom beteendeexperiment, anatomisk spårning och regionspecifika manipuleringar. För att kombinera slice-electro-fysiologiska förfrågningar med dessa tekniker har vi monterat ett protokoll som använder en liknande vinkel av sektionering som den modifierade horisontella skivningen för den mellanliggande ventrala regionen i hippocampus, men använder en inverterad skivordning för att få tidiga skivor från den dorsala-mellanliggande regionen. Detta tillvägagångssätt minskar den tid som krävs för att skära och samla dorsala regionen hippocampus, vilket förbättrar skivor livskraften.
Med denna metod kan vi rutinmässigt hämta cirka tre skivor per halvklot i dorsala hippocampalregionen mellan 1,4 mm-2,4 mm från pialytan, som visas i figur 1C. Även om det inte är möjligt med denna procedur att erhålla tvärgående skivor från hippocampus mycket septala pol, är det möjligt att samla in cirka två ytterligare livskraftiga icke-tvärgående skivor per halvklot från septalstången (Figur 1C ii,iii). Om hippocampus septala pol är det primära forskningsfokuset, kan andra protokoll, som tillåter insamling av tvärgående skivor, särskilt från hippocampus mycket septala pol, vara bättrelämpade 21,32. Beteendeexperiment på rumslig navigering och lärande utförs företrädesvis hos mogna möss med fullt utvecklad neuronal anslutning. Följaktligen har vi optimerat vårt skivningsförfarande för applicering på hjärnan hos vuxna djur (visas här i tre månader gamla möss), som är mer känsliga för stress än den motståndskraftiga juvenilpreparatet. För detta ändamål har vi kombinerat flera strategier som minskar den hypoxiska stress som hjärnan utsätts för under tiden mellan extraktion och placering av skivorna i den syresatta ACSF. Den skyddande skärlösningen är en NMDG-baserad ACSF25,27,28 med låg Na + och Ca2 + men hög Mg2 + för att minska excitotoxiska skador och cellsvullnad på grund av aktivering av NMDA-receptorer. Dessutom ger HEPES stabil buffring och föreningar som ascorbate och pyruvat minskar oxidativ stress. Den transkardiella perfusionen med den kylda och syresatt skyddande skärlösningen drar nytta av det extremt täta kapillärnätverket som tillförsel hjärnan för att snabbt och homogent minska metabolisk efterfrågan och glutamatinducerad excitotoxicitet i hjärnvävnaden. Därefter utförs nästan alla steg efter halshuggning inom de kylda och syresatt lösningarna för att hålla ämnesomsättningen och syrebristen till ett minimum under hela proceduren. Andra strategier för att minska hjärnskador under skivning finns och kan vara lika giltiga38. För att visa kvaliteten på vår förberedelse jämför vi den med en koronal skiva förberedelse, som vanligtvis används för att spela in från dorsala hippocampus. Även om koronalskivor kan användas för att få bra patchklämmainspelning i dentate gyrus, är antalet ohälsosamma och frånkopplade nervceller högre än i tvärgående skiva. Dessutom bevaras integriteten hos de axonal och dendritiska arborizations bättre i den tvärgående skivan. I själva verket fungerar integriteten hos granulatcellaxoner (figur 3A), som löper orthogonal till hippocampus längsgående axel som en indikator på ett tvärgående skivplan1.
För fyllning av lappade nervceller föreslår vi en elektrodresistens mellan 3 och 5 MΩ. En diameter på spetsen på ca 1 μm gör det möjligt att utföra ett bra tätningsmotstånd under inspelningen och god återförslutning vid elektrodupprullning. Den viktigaste detaljen är att undvika sugning av delar av soma eller kärna i pipetten. Av denna anledning föreslår vi att du inkluderar ett Alexa-färgämne i den intracellulära lösningen när det är möjligt. Färgämnet gör det möjligt att övervaka cellformen under inspelning och återförslutning. Dessutom tillåter det att bedöma integriteten hos den lappade cellen efter fixering, vilket kan spara immunohistokemitid, i fall av misslyckade fyllningar. På grund av Alexa färgämnen är släckta med lång fixeringstid, föreslår vi kort fixering om möjligt.
För efterföljande immunostaining använder vi ett protokoll som inte kräver omsektionering av segmentet. Vi föreslår att du gör färgningen inom en vecka efter fixering. Ju längre skivorna finns kvar i kylskåpet, desto större är risken för vävnadsnedbrytning. Om en lång lagring inte kan undvikas föreslår vi att NaN3-koncentrationen i PBS ökar till 0,05% och uppdaterar den varje vecka. Immunostaining av hela skivan innebär att inkubationstiderna med primära och sekundära antikroppar ökar. Vanligtvis, för avslöjande biocytin, är en över natten inkubation vid 4 °C tillräckligt, men om kombineras med färgning för andra proteiner, hela färgning förfarandet kan pågå mycket längre. Permeabiliseringsblockering och antikroppsinkubation måste optimeras individuellt. Vanligtvis, för den primära antikroppen, är två dagar tillräckliga medan en dag kan räcka för den sekundära. Vi rekommenderar att du ökar tvättstegens varaktighet tillsammans med längre antikroppsinkubationer för att undvika ökningen av bakgrunden.
I detta protokoll har vi presenterat en skivningsmetod för att få tvärgående eller nästan tvärgående hippocampal skivor bevara neuronal livskraft av vuxna vävnad och ett praktiskt tillvägagångssätt för att återställa morfologi och neurokemiska identiteten hos de lappade nervcellerna. Denna metod kan enkelt utföras för att matcha elektrofysiologiska resultat med anatomiska och beteendemässiga studier med fokus på den mellanliggande dorsala delen av hippocampus.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Kerstin Kronenbitter och Didier Gremelle för teknisk hjälp. Vi tackar Umberto Morelli för hjälp med grafisk mjukvara och Mathias Hoppe för videografi och videoredigering. Arbetet i vårt labb stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Project-ID 434434223) och GRK2154, Medical Research Council grant G1100546/2 och Kiel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
| 24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
| 81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
| Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
| Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
| Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
| Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
| Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
| Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
| Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
| Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
| Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
| EGTA | Roth | 3054.1 | |
| Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
| Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
| Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
| Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
| Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
| Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
| Large spatula | Roth | E286.1 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
| Microfil | World precision instruments | MF34G | |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
| Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
| Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
| Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
| Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
| Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
| Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
| Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
| Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
| Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
| Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
| Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
| Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
| Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
| Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
| Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
| Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
| Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
| Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |
References
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- David, A., Pierre, L. Hippocampal Neuroanatomy. The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).
- Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).
- Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).
- Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
- Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).
- Cembrowski, M. S., Spruston, N. Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons. Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).
- Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).
- Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory. European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).
- Fredes, F., et al. Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation. Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
- Andersen, P.
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium. Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).
- Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Davie, J. T., et al.
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
- Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus. Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).
- Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).
- Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61377 (2020).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706 (2014).
- Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. Journal of Visualized Experiments. (118), e54880 (2016).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Murray, A. J., et al. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).
- Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release. Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).
- Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry. Neuromethods. 67, 103-125 (2012).
