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Neuroscience

वयस्क चूहों के डेंटेट जाइरस में पूरे सेल रिकॉर्डिंग और न्यूरोनल पुनर्निर्माण के लिए पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से तीव्र स्लाइस की तैयारी

Published: April 3, 2021 doi: 10.3791/61980
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Physiology, Christian-Albrechts-University Kiel

Summary

हम चूहों के पृष्ठ-मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस से तीव्र-स्लाइस तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता और रिकॉर्डिंग की रूपात्मक सुविधाओं के संरक्षण के मामले में कोरोनल टुकड़ा करने की क्रिया के साथ इस ट्रांसवर्सल तैयारी की तुलना करते हैं।

Abstract

यद्यपि हिप्पोकैम्पस की सामान्य वास्तुकला इसकी देशांतर धुरी के समान है, हाल के अध्ययनों से आणविक, शारीरिक और कार्यात्मक मानदंडों में प्रमुख अंतर का पता चला है जो अपने रोस्ट्रो-कौडल सीमा के साथ विभिन्न उप-सर्किट में एक विभाजन का सुझाव देते हैं। अंतर कनेक्टिविटी और कार्य के कारण सबसे मौलिक अंतर पृष्ठीय और वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के बीच किया जाता है, जो क्रमशः स्थानिक और भावनात्मक प्रसंस्करण में शामिल होते हैं। तदनुसार, स्थानिक स्मृति गठन के बारे में वीवो काम में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस पर ध्यान केंद्रित किया गया है।

इसके विपरीत, इलेक्ट्रो-फिजिकल इन विट्रो रिकॉर्डिंग को मध्यवर्ती-वेंट्रल हिप्पोकैम्पस पर अधिमानतः किया गया है, जो काफी हद तक स्लाइस व्यवहार्यता और सर्किट अखंडता जैसे कारकों से प्रेरित है। इन विट्रो डेटा के साथ स्थानिक प्रसंस्करण पर वीवो डेटा में सीधे सहसंबंध के लिए अनुमति देने के लिए हमने पिछले सेक्शनिंग तरीकों को अनुकूलित किया है ताकि पृष्ठीय-मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस से डेंटेट गायरस में प्रिंसिपल कोशिकाओं और इंटरन्यूरॉन्स की दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए अत्यधिक व्यवहार्य ट्रांसवर्स ब्रेन स्लाइस प्राप्त किया जा सके। जैसा कि स्थानिक व्यवहार नियमित रूप से वयस्क चूहों में विश्लेषण किया जाता है, हमने परिपक्व जानवरों से मस्तिष्क के ऊतकों की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए सुरक्षात्मक समाधानों के उपयोग के साथ इस ट्रांसवर्सल स्लाइसिंग प्रक्रिया को संयुक्त किया है। हम लगभग 3 महीने की उम्र के चूहों के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं। विधि कोरोनल तैयारी के लिए एक अच्छा विकल्प प्रदान करती है जिसका उपयोग अक्सर पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस पर इन विट्रो अध्ययनों के लिए किया जाता है। हम रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता और रिकॉर्डिंग न्यूरॉन्स की रूपात्मक सुविधाओं के संरक्षण के मामले में इन दो तैयारियों की तुलना करते हैं।

Introduction

हिप्पोकैम्पस सीखने और स्मृति, स्थानिक नेविगेशन के साथ ही भावना के विभिन्न पहलुओं में अपनी निर्णायक भूमिका के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है । हिप्पोकैम्पस की मूल सर्किटरी, जिसे आमतौर पर "ट्राइसिनैप्टिक सर्किट" कहा जाता है, ट्रांसवर्स एक्सिस में एक लैमेलर नेटवर्क है, जो काफी हद तक देशांतर धुरी 1 के साथसंरक्षितहै। विभिन्न संज्ञानात्मक और भावनात्मक व्यवहारों के लिए हिप्पोकैम्पस का योगदान उन विविध कनेक्शनों से उत्पन्न होता है जो यह बुनियादी सर्किटरी कई अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ डोरसोवेंट्रल अक्ष के साथ बनाता है2, 3,3। अफ़रीद और आफरेंट कनेक्टिविटी से परे, हालांकि, अध्ययनों की बढ़ती संख्या हिप्पोकैम्पस के सेप्टो-टेम्पोरल धुरी के साथ और मतभेदों की ओर इशारा करती है। इस तरह के मतभेद आंतरिक वास्तुकला और कनेक्टिविटी के साथ - साथ जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और न्यूरोनल आकृति विज्ञान में अंतर4,5 ,6,7,8से संबंधित हैं ।

बुनियादी सर्किटरी में इस तरह के मतभेदों के अस्तित्व को ध्यान में रखते हुए, संबोधित किए गए प्रश्नों के अनुसार जांच करने के लिए विशिष्ट हिप्पोकैम्पल उप-सर्किट का चयन करना उचित है। उदाहरण के लिए प्रश्न स्थानिक प्रसंस्करण में शामिल न्यूरोनल तंत्र से संबंधित है, तो वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के बजाय पृष्ठीय रुचि का है, हालांकि दोनों अंतर-हिप्पोकैम्पल देशांतर कनेक्टिविटी9,10,11के कारण वीवो में स्वतंत्र रूप से कार्य नहीं करते हैं। इन पंक्तियों के साथ न केवल देशांतर धुरी के साथ मतभेदों पर विचार किया जाना है, लेकिन यह भी देखभाल के लिए स्थानीय और लंबी दूरी की सर्किटरी के रूप में अच्छी तरह से संभव की रक्षा की आवश्यकता है । फाइबर रास्तों के संरक्षण और कनेक्टिविटी के लिए जिस कोण पर मस्तिष्क खंडित किया जाएगा आवश्यक है।

साहित्य में रिपोर्ट की गई पहली विधि में ट्राइसिनेप्टिक सर्किट को शामिल करने के लिए पहले मस्तिष्क से हिप्पोकैम्पस को अलग किया और फिर ऊतक हेलिकॉप्टर12 और एक वाइब्रेकोम13का उपयोग करके ट्रांसवर्स स्लाइस (देशांतर अक्षों के लंबवत) बनाए। बाद में फिजियोलॉजिस्ट ने हिप्पोकैम्पस से जुड़े आसन्न मस्तिष्क संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए एक पूरे मस्तिष्क ब्लॉक से स्लाइस प्राप्त करना पसंद किया। इन ब्लॉक तैयारियों के लिए, हिप्पोकैम्पस के संबंध में विभिन्न खंड कोण विकसित किए गए हैं, जैसे कोरोनल स्लाइस तैयारी 14 या हिप्पोकैम्पल-एंटोराइनलकॉर्टेक्स कनेक्शन15, 16,17के संरक्षण के लिए एचईसी स्लाइस नाम का एक क्षैतिज टुकड़ा तैयारी।

बाद की तैयारी में पार्श्व पालि को ब्लॉक का आधार बनाने के लिए रोस्ट्रो-कौडल धुरी के साथ क्षैतिज विमान के संबंध में 0 डिग्री या 12 डिग्री के कोण के साथ काटा जाता है। स्लाइस तो मस्तिष्क की वेंट्रल सतह से शुरू एकत्र कर रहे हैं, इस प्रकार मुख्य रूप से मध्यवर्ती-वेंट्रल हिप्पोकैम्पल क्षेत्र की फसल की अनुमति । यह विधि शारीरिक अध्ययन के लिए सबसे लोकप्रिय विकल्प बन गई है और 18,19,20के कई प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करतेहुएमज़बूती से प्रदर्शन किया जा सकता है ।

हालांकि, यदि अनुसंधान हित स्थानिक सीखने के विशिष्ट पहलुओं से संबंधित है, तो पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस जांच का अधिक उपयुक्त क्षेत्र हो सकता है और इस हिप्पोकैम्पल क्षेत्र के लिए समान गुणवत्ता की एक टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया ढूंढना उपयोगी होगा। कुछ प्रोटोकॉल, जो बहुत ही रोस्ट्रल पोल पर ध्यान केंद्रित करते हैं, विकसित किए गए हैं जो इस मांग को पूरा कर सकते हैं 21,22।

इस प्रोटोकॉल में, इसके बजाय, हम पृष्ठीय-मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस से व्यवहार्य ट्रांसवर्स स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो क्षैतिज तैयारी18,19 (चित्र 1 एऔरबी)के लिए पहले वर्णित खंडीय कोण का उपयोग करता है। हम कोरोनल स्लाइस में प्राप्त लोगों के लिए इस तैयारी में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और रूपात्मक पुनर्निर्माण की तुलना करके इस प्रोटोकॉल की गुणवत्ता का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से वयस्क चूहों (हमारे मामले में तीन महीने पुराने) में शारीरिक और व्यवहार प्रयोगों के साथ संयोजन के लिए अनुकूल है।

Protocol

प्रायोगिक पशुओं से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार थीं और उन्हें कील विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । परवलबुमिन-क्रे (Pvalb-IRES-Cre) चूहों23 (जैक्सन प्रयोगशालाओं, भंडार संख्या 008069) विषम कालोनियों के रूप में बनाए रखा गया था या Ai9 क्रे रिपोर्टर चूहों24 (जैक्सन प्रयोगशालाओं, भंडार संख्या 007909) के साथ पार कर गया था। P40-P90 के बीच महिला और पुरुष चूहों का इस्तेमाल किया गया। चूहों को मानक समूह आवास स्थितियों के तहत 12-एच प्रकाश-अंधेरे चक्र में बनाए रखा गया था और उन्हें भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटमप्रदान किया गया था।

1. समाधान की तैयारी

नोट: अल्ट्रापुरे पानी (यूपीडब्ल्यू) (25 डिग्री सेल्सियस 18.2 MΩcm पर प्रतिरोधकता) का उपयोग करके हर प्रयोगात्मक दिन के लिए नए समाधान तैयार करें। समाधान अधिकतम एक दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। मैग्नीशियम और कैल्शियम समाधान 1 एम स्टॉक समाधान के रूप में अलग से संग्रहीत किया जा सकता है। सभी कार्य समाधानों को उपयोग से पहले और दौरान इष्टतम ऑक्सीजन और पीएच रखरखाव के लिए कार्बोजेन (95% O2:5% CO2)के साथ संतृप्त किया जाना चाहिए।

  1. कटिंग समाधान (500 एमएल प्रति माउस) (एमएमएम में): 92 एनएमडीजी, 2.5 केसीएल, 1.25एनएएच 2पीओ4,30 नाहको3,20 एचईपी, 25 ग्लूकोज, 5 ना-ascorbate, 4 Na-pyruvate, 0.5 CaCl2·2H 2O, और 10 MgSO4·7H2O. Titrate एक रासायनिक हुड के तहत पीएच 7.4 के लिए 16% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 4-5 एमएल के साथ divalentcations जोड़ने से पहले। इससे एमजीएसओ4की वर्षा से बचा जा सकेगा ।
    नोट: केसीएल औरएनएएच 2पीओ4 को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x समाधान के रूप में संग्रहीत किया जा सकता है। हम काटने के समाधान के दो व्यक्तिगत बैच बनाते हैं। एक रिकॉर्डिंग से पहले दिन (रात में एक फ्रीजर में संग्रहीत करने के लिए कुचल बर्फ का उत्पादन) और रिकॉर्डिंग के दिन पर एक ।
  2. भंडारण समाधान (250 एमएल प्रति माउस) (एमएमए में): 92 एनएसीएल, 2.5 केसीएल, तैयार करें, 1.25 एनएएच2पीओ4,30 नाएचको3,20 एचईपीई, 25 ग्लूकोज, 5 ना-एस्कॉरबेट, 4 ना-पाइरुवेट, 2 सीएसीएल2·2एच 2ओ, और 2 एमजीएसओ4·7एच 2ओ. टिट्रेट से पीएच 7.3-7.4
    नोट: एनएसीएल, केसीएल औरएनएएच 2पीओ4 को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x समाधान के रूप में स्टॉक किया जा सकता है।
  3. रिकॉर्डिंग के लिए ACSF तैयार करें (एमएमए में): 122 एनएसीएल, 2.5 केसीएल, 1.25 एनएएच2पीओ4,24 नाएचसीओ3,12.5 ग्लूकोज, 2 सीएसीएल2·2एच 2ओ, और 2 एमजीएसओ4·7एच2ओ, 2 ना-एस्कोरबेट, 4 ना-पायव। 1 एन NaOH के साथ 7.3-7.4 करने के लिए टिट्रेट पीएच।
    नोट: एनएसीएल, केसीएल औरएनएएच 2पीओ 4 को10x स्टॉक समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ा जा सकता है।

2. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए बेंच की तैयारी

  1. बर्फ पर एक बीकर (150 एमएल) और दो ग्लास पेट्री व्यंजन (10 सेमी व्यास) तैयार करें और उन्हें ताजा काटने के समाधान से भरें। एक कार्बोजन बुदबुदाती डिवाइस (एक छिद्रित ट्यूब या कार्बोजन सिस्टम से जुड़े एक एयर-स्टोन) के साथ समाधान ऑक्सीजनयुक्त रखें।
    नोट: बीकर में समाधान परफ्यूजन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि पेट्री व्यंजन काटने की प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा ।
  2. सर्जरी बेंच को स्टेनलेस-स्टील ब्लेड, गोल टिप चिमटी, फाइन टिप चिमटी, बड़ी कैंची, छोटी कैंची, एक बड़ी धातु स्पैटुला, एक पतली धातु स्पैटुला, एक ब्रश, वाइब्रेटम प्लेट और सायनोएक्रिलेट गोंद या कम विषाक्त एन-ब्यूटर सायनोक्रिलेट चिपकने के साथ लैस करें। बर्फ पर ग्लास पेट्री व्यंजनों में से एक में एक स्टेनलेस स्टील ब्लेड और फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा इमर्ज करें। इस पेट्री का इस्तेमाल दिमाग को काटने के लिए किया जाएगा। एक प्लास्टिक पेट्री डिश के नीचे तीन समानांतर लाइनों ड्रा और शल्य चिकित्सा उपकरणों के करीब इस पकवान की स्थिति ।
  3. प्रकाशित प्रोटोकॉल25के अनुसार ट्रांस-कार्डियल परफ्यूजन के लिए सेट अप तैयार करें ।
  4. कंपन तैयार करें, ब्लेड धारक पर एक नया ब्लेड बढ़ते हुए और काटने के लिए पैरामीटर सेट करें (क्षैतिज विमान से ब्लेड का कोण 17 डिग्री, ब्लेड दोलन आयाम 1.5 मिमी, ब्लेड आगे आंदोलन वेग लगभग 2 मिमी-1,दोलन आवृत्ति 90 हर्ट्ज, अनुभाग मोटाई 350 माइक्रोन)। वाइब्रेटम ट्रे को आइस-कोल्ड कटिंग सॉल्यूशन से भरें और इसे लगातार ऑक्सीजन के तहत रखें।
    नोट: हम तापमान को नीचे रखने के लिए ठंडा ताजा काटने के समाधान के लिए काटने के समाधान के पहले बैच से बने कुचल बर्फ जोड़ें । टुकड़ा करने की क्रिया करते समय ब्लेड से बर्फ रखने के लिए ध्यान देना।
  5. लगातार ऑक्सीजन के तहत काटने के समाधान से भरा एक इनक्यूबेशन कक्ष तैयार करें। चैंबर को पहले से गर्म पानी के स्नान (35 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
    नोट: इनक्यूबेशन चैंबर के लिए एक उदाहरण एडवर्ड्स और Konnerth (१९९२)26में पाया जा सकता है ।
  6. भंडारण समाधान से भरा एक टुकड़ा भंडारण कक्ष तैयार करें और इसे कमरे के तापमान पर और निरंतर ऑक्सीजन के तहत रखें। यदि ऊतक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या हल्के सक्रिय ऑप्सिन को व्यक्त करता है, तो कक्ष को अंधेरे में रखने की सिफारिश की जाती है, उदाहरण के लिए, एक बॉक्स के अंदर।
    नोट: कई स्वतंत्र कुओं के साथ एक भंडारण कक्ष हिप्पोकैम्पस के डोरसोवेंट्रल धुरी के साथ स्लाइस के स्तर को अलग करने के लिए उपयोगी है। एक कस्टम निर्मित कक्ष(चित्रा 1D) बनायाजा सकता है । एक 81x क्रायोजेनिक शीशी भंडारण बॉक्स से शीशी स्पेसर ग्रिड का एक टुकड़ा लें और नीचे एक नायलॉन नेट पर गोंद करें। इस ग्रिड के केंद्र में एक 5mL पिपेट प्लास्टिक टिप के ऊपरी एक तिहाई डालें, ताकि यह नीचे के बारे में 3 सेमी चिपक जाए। यह प्लास्टिक टिप ग्रिड के स्टैंड के रूप में कार्य करता है और बाद में ऑक्सीजन के लिए हवा ट्यूबिंग रखती है। एक बेलेंड्रिक प्लास्टिक बॉक्स (जैसे, सिरिंज फिल्टर की पैकेजिंग) में अपने स्टैंड के साथ ग्रिड डालें ताकि यह झुका या लड़खड़ा न सके। इस जलाशय में 250 एमएल भंडारण समाधान होगा।

3. हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी

  1. हुड के नीचे आइसोफ्लुरेन (लगभग 0.5 एमएल) का उपयोग करके एक बॉक्स कक्ष में माउस को एनेस्थेटाइज करें। माउस को तब तक आराम करना छोड़ दें जब तक कि सांस धीमी और नियमित (लगभग 2-3 मिनट) न हो जाए। टो चुटकी के साथ दर्द प्रतिक्रियाओं की अनुपस्थिति के लिए परीक्षण करें।
  2. प्रकाशित प्रोटोकॉल 25,27के बाद बर्फ पर बीकर से कार्बोनेटेड कटिंग समाधान के25एमएल का उपयोग करके ट्रांस-कार्डियल परफ्यूजन करें। इस कदम को मस्तिष्क को तेजी से ठंडा करने के लिए न्यूरोनल मेटाबोलिज्म को धीमा करने की सिफारिश की जाती है।
  3. बड़ी कैंची का उपयोग कर जानवर को काटना और काटने के समाधान युक्त बर्फ पर ठंडा पेट्री पकवान में सिर जगह है ।
  4. खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए ठीक कैंची के साथ त्वचा खोलें। फोरमेन मैग्नम के दोनों किनारों पर खोपड़ी के आधार में छोटे पार्श्व चीरों को बनाएं। फिर घ्राण बल्ब के ऊपर नासो-ललाट सीवन तक पहुंचने तक फोरमेन मैग्नम से शुरू होने वाले सगितल सीवन के साथ काटें। अंतर्निहित मस्तिष्क ऊतक के नुकसान से बचने के लिए धनु कटौती के दौरान कैंची खींचो।
    नोट: काटने के समाधान में सिर को जलमग्न रखने से इसे रक्त से साफ करने में मदद मिलती है और तापमान नीचे रहता है।
  5. मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए पार्श्व हड्डियों को खींचने के लिए गोल टिप चिमटी का उपयोग करें। मेनिंग्स को भी पकड़ने और हटाने के लिए ध्यान दें। अगर छोड़ दिया जाता है तो निकालने के दौरान ये दिमाग को नुकसान पहुंचा सकते हैं।
  6. दूसरे पेट्री डिश में धीरे से मस्तिष्क बाहर स्कूप करने के लिए छोटे स्पैटुला का उपयोग करें।
  7. पूर्व ठंडा ब्लेड का उपयोग कर देशांतर दरार के साथ हिस्सों में मस्तिष्क काटें।
  8. काटने के समाधान से बाहर और प्लास्टिक पेट्री पकवान पर एक गोलार्द्ध उठाने के लिए बड़े स्पैटुला का उपयोग करें। गोलार्द्ध अपनी मध्यीय सतह पर झूठ बोल के साथ, पैरटाल प्रांतस्था को समानांतर लाइनों में से एक के साथ संरेखित करें ताकि चित्रा 1बीमें दिखाए गए दूसरे कट के लिए संदर्भ हो।
  9. सतह प्राप्त करने के लिए लाइनों के समानांतर ब्लेड को स्थिति में गोलार्द्ध के वेंट्रल भाग में दूसरा कट करें, जिसका उपयोग बाद में मस्तिष्क को नमूना धारक (अगले चरण को देखें) पर चिपकाने के लिए किया जाता है, जैसा कि चित्रा 1Bमें दिखाया गया है। गोलार्ध को ग्लास पेट्री डिश के ऑक्सीजनयुक्त काटने के समाधान में लौटाएं और दूसरे गोलार्द्ध पर एक ही प्रक्रिया करें।
  10. चिपकने वाले का उपयोग कर कंपन-नमूना धारक पर हौसले से कट वेंट्रल पक्ष के साथ गोलार्द्धों गोंद। गोंद जमना और कंपन ट्रे में नमूना धारक स्थानांतरित करने के लिए गोलार्द्धों पर काटने के समाधान की कुछ बूंदें रखो। इस तरह स्लाइसिंग पृष्ठीय से वेंट्रल हिप्पोकैम्पस तक आगे बढ़ेगी।
  11. प्रारंभिक एक या दो गैर-ट्रांसवर्सल स्लाइस(चित्रा 1C,ii-iii)को तब तक हटा दें जब तक कि ब्याज का क्षेत्र दिखाई न दे और फिर स्लाइस एकत्र करना शुरू कर दे।
    नोट: गैर-ट्रांसवर्सल लेकिन इस्क योग्य, स्वस्थ स्लाइस स्लाइसिंग प्रक्रिया(चित्रा 1C,ii-iii)की शुरुआत में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से प्राप्त किए जा सकते हैं। प्रत्येक स्लाइस के संग्रह के बारे में 3-4 मिनट की आवश्यकता है। वेंट्रल हिप्पोकैम्पस के बजाय पृष्ठीय से काटने को शुरू करके हम लगभग 10 मिनट बचाते हैं, जो पृष्ठीय स्लाइस की व्यवहार्यता में सुधार करता है।
  12. एक प्लास्टिक पिपेट (टिप के संकीर्ण छोर को काट दें) के साथ प्रत्येक स्लाइस को इनक्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित करें (जिसमें 35 डिग्री सेल्सियस पर काटना समाधान होता है) और इसे 12 मिनट के लिए आराम करने दें। गर्म काटने के समाधान में संक्षिप्त वसूली अवधि प्रारंभिक न्यूरोनल सूजन को बहुत कम कर देती है, जैसा कि टिंग एट अल (2014)28में बताया गया है। फिर ब्रश का उपयोग करके स्लाइस को स्टोरेज चैंबर (आरटी में भंडारण समाधान युक्त) में स्थानांतरित करें और इसे प्रयोग की शुरुआत तक आराम दें।

4. पूरे सेल रिकॉर्डिंग और बायोसाइटिन भरने

नोट: पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का विवरण यहां केवल महत्वपूर्ण चरणों में कम हो जाता है जो अच्छे बायोसाइटिन भरने को प्राप्त करने में मदद करते हैं और आम तौर पर ACSF में न्यूरॉन्स पर लागू होते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की प्रक्रियाओं के बारे में जानकारी के लिए, कई अन्य प्रोटोकॉल29,30से परामर्श किया जा सकता है।

  1. दर्ज किए जाने वाले मापदंडों के अनुसार एक उपयुक्त इंट्रासेलुलर समाधान चुनें। एक उदाहरण के रूप में, वर्तमान क्लैंप मापन के लिए, पोटेशियम ग्लूकोनेट-आधारित समाधान (एमएमएम में) का उपयोग किया जा सकता है: 135 K-ग्लूकोनेट, 3 केसीएल, 10 एचईपी, 0.2 ईजीटीए, 10 फॉस्फोक्रीटिन-ना2,4 एमजीएटीपी, 0.3एनए 2-जीटीपी। पीएच को 1 एम कोह के साथ 7.3 पर समायोजित करें। 3-5 मिलीग्राम/एमएल बायोसाइटिन जोड़ने के बाद ओस्मोलिटी 285-290 mOsmol/kg के आसपास होनी चाहिए ।
    नोट: रिकॉर्डिंग के दौरान न्यूरॉन के आकार की निगरानी करने के लिए, 1 एमएम एलेक्सा फ्लोर हाइड्राइड के 0.3-0.5 μL/mL को इंट्रासेलुलर समाधान में जोड़ा जा सकता है। इस मामले में, बायोसाइटिन रहस्योद्घाटन के लिए याद रखें, फ्लोरोसेंट जांच के साथ एलेक्सा डाई रंग से मेल खाने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन के साथ मिलकर।
  2. मोटी दीवारों वाले बोरोसिलिकेट केशिकाओं से ≤1 माइक्रोन टिप व्यास और 3-5 एमΩ प्रतिरोध के पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोड तैयार करें।
  3. आरटी या 35-37 डिग्री सेल्सियस पर 2.5-3 एमएल/मिनट की गति के साथ पैच-क्लैंप सेटअप की परफ्यूजन सिस्टम शुरू करें और यू-आकार के एंकर के साथ चैंबर में एक स्लाइस सुरक्षित करें ।
  4. ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान करें और स्लाइस की सतह के नीचे कम से कम 30-50 माइक्रोन सोमा के साथ एक स्वस्थ न्यूरॉन चुनें।
    नोट: एक स्वस्थ न्यूरॉन के सोमा एक चिकनी सतह है, और झिल्ली सीमाओं थोड़ा विपरीत हैं । अस्वस्थ न्यूरॉन का सोमा सिकुड़ा हुआ और अत्यधिक विपरीत या सूजन और अर्ध-पारदर्शी दिखाई देता है।
  5. जब तक एजीसीएल इलेक्ट्रोड की नोक कवर न हो जाए तब तक इंट्रासेलर समाधान के साथ एक ग्लास पिपेट लोड करें। पिपेट को रिकॉर्डिंग कक्ष के समाधान में ले जाएं, ग्लास इलेक्ट्रोड की नोक को साफ रखने के लिए हल्का सकारात्मक दबाव लागू करें।
    नोट: यदि समाधान में एलेक्सा डाई होता है, तो दबाव को टिप से जारी फ्लोरोसेंट समाधान की मात्रा को समायोजित करते हुए नेत्रहीन रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। न्यूनतम दबाव कोशिका के चारों ओर ऊतक के धुंधला होने से बचना होगा।
  6. एक तिरछे कोण से सेल दृष्टिकोण और सोमा सतह के पहले एक तिहाई के भीतर संपर्क स्थापित जब गीगा सील बनाने । दबाव जारी करें, धीरे-धीरे होल्डिंग क्षमता को -65 mV तक ले जाएं और गीगा-सील गठन को सुविधाजनक बनाने के लिए मुंह से एक सौम्य सक्शन लागू करें।
  7. पूरे सेल विन्यास स्थापित करने के लिए, झिल्ली को तोड़ने के लिए मजबूत और संक्षिप्त सक्शन लागू करें। यदि न्यूरॉन में झिल्ली की क्षमता -50 एमवी से अधिक है, यदि होल्डिंग वर्तमान 100 पीए से परे बढ़ रहा है या यदि पहुंच प्रतिरोध 30 एमΩ से परे बढ़ जाता है तो रिकॉर्डिंग को छोड़ दें।
  8. रिकॉर्डिंग के बाद (कम से कम 15 मिनट तक सोमता और डेंड्राइट्स के पर्याप्त भरने के लिए सिफारिश की जाती है; एक घंटे तक जटिल अक्षतंप को भरने के लिएशायद 31की आवश्यकता होती है) सावधानी से इलेक्ट्रोड को हटा दें। इस अंत में होल्डिंग क्षमता को 0 एमवी तक सेट करें और दृष्टिकोण से विपरीत दिशा में पिपेट को धीरे-धीरे वापस लेकर एक गीगा-सील को फिर से बनाने की कोशिश करें, जैसे कि बाहर से बाहर पैच विन्यास प्राप्त करना।
    नोट: इंट्रासेलुलर समाधानों में एलेक्सा डाई की उपस्थिति न्यूरोनल सतह से पिपेट को नेत्रहीन निर्देशित हटाने में मदद करती है। यदि कोशिका का नाभिक पिपेट टिप के संपर्क में नहीं है, तो सील में सुधार करने का एक त्वरित तरीका पिपेट को तिरछे और उच्च गति पर ऊपर की ओर ऊतक से बाहर खींच रहा है। यदि नाभिक या झिल्ली का हिस्सा टिप के भीतर रहता है, तो प्लाज्मा झिल्ली को तोड़ने का खतरा है। इस मामले में, थोड़ा सकारात्मक दबाव आवेदन और पार्श्व आंदोलन मदद कर सकता है।
  9. सेल की स्थिति और स्लाइस के ओरिएंटेशन पर ध्यान दें। निर्धारण के बाद स्लाइस के सटीक अभिविन्यास और भरे हुए सेल की अखंडता को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत जांचा जा सकता है।

5. इम्यूनोदाता, छवि अधिग्रहण और रूपात्मक पुनर्निर्माण

  1. रिकॉर्डिंग के बाद, स्लाइस को 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें ताकि इसे पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 4% में 0.1 एम फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में ठीक किया जा सके। उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी की संवेदनशीलता के अनुसार, आरटी में 60 मिनट या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट। स्लाइस को 0.1 एम पीबीएस और 0.02% एनएएन3में संग्रहीत किया जा सकता है।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है। हुड के नीचे उपयोग करें।
  2. स्थापित प्रोटोकॉल32,33के अनुसार रिकॉर्डिंग के एक सप्ताह के भीतर इम्यूनोस्टेपिंग और बायोसाइटिन रहस्योद्घाटन करें ।
    नोट: हम एक प्रक्रिया का उपयोग करते हैं जो डेंड्रिटिक और अक्षीय प्रक्रियाओं की अखंडता को बनाए रखने के लिए स्लाइस की फिर से अनुभागिंग से बचता है। हालांकि, इस प्रक्रिया को अब इनक्यूबेशन बार की आवश्यकता होती है क्योंकि एंटीबॉडी को ऊतक में प्रवेश करने की आवश्यकता होती है। हम प्रयोग करने से पहले ऊतक में एंटीबॉडी के इष्टतम प्रवेश के लिए समय का परीक्षण करने का सुझाव देते हैं।
  3. जेड-स्टैक और टाइल-स्कैनिंग फ़ंक्शन के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।
  4. फिजी इमेजजे34का उपयोग करके रूपात्मक पुनर्निर्माण करें।
    नोट: कई इमेज फाइल प्रारूपों को जैव-प्रारूप प्लगइन का उपयोग करके कार्यक्रम में आयात किया जा सकता है। हम डेंड्राइट्स और एक्सॉन के पुनर्निर्माण के लिए सिंपल न्यूट्राइन ट्रेसर (एसटीएन) प्लगइन35 के उपयोग की सलाह देते हैं। https://imagej.net/SNT और http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/ पर एक सरल और स्पष्ट ट्यूटोरियल उपलब्ध है। ट्रेसिंग डेटा (.निशान) वाली फ़ाइल, यदि सहेजा गया अन-संकुचित है, तो उसे टेक्स्ट फ़ाइल में परिवर्तित किया जा सकता है और टेक्स्ट डेटा प्रोसेसिंग के लिए मैटलैब या अन्य सॉफ्टवेयर के साथ खोला जा सकता है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में हम वर्णन करते हैं कि हिप्पोकैम्पस(चित्रा 1 ए)के पृष्ठीय-मध्यवर्ती भाग से तीव्र हिप्पोकैम्पल स्लाइस कैसे तैयार करें। प्रोटोकॉल विशेष रूप से उन प्रयोगों के लिए उपयुक्त है जो स्थानिक शिक्षा में शामिल तंत्रों की जांच करते हैं और इसे पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस35में व्यवहार कार्य या वायरल लेबलिंग या हेरफेर रणनीतियों के साथ जोड़ा जा सकता है। विभिन्न ब्रेग्मा में पीवाल्ब-आईरेस-क्रे चूहों के पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी-फ्लेक्स-जीएफपी) को व्यक्त करने वाले क्रे-निर्भर जीएफपी के साथ इंजेक्शन वाले जानवरों के लिए यहां वर्णित खंड प्रक्रिया को लागू करना एपी-1.94 मिमी का समन्वय करता है, एमएल ± 0.5-2 मिमी, गहराई-1.25-2.25 मिमी हिप्पोकैम्पस गठन के विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए36 हम संक्रमित क्षेत्रों वाले कम से कम तीन ट्रांसवर्सल स्लाइस प्राप्त करने में सक्षम थे (हिप्पोकैम्पस के 3 डी मॉडल परचित्रा 1A हल्का हरा रंग)। इसके अलावा, कई गैर-ट्रांसवर्सल लेकिन स्वस्थ स्लाइस पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस(चित्रा 1C)के अधिक रॉक्रल भागों से प्राप्त किए जा सकते हैं।

हमारे स्लाइस की गुणवत्ता और व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए हमने पीवाल्ब-आईरेस-क्रे के डेंटेट जाइरस में कणिका कोशिकाओं और टीडीटोमाटो-लेबल वाले परवलबुमिन-पॉजिटिव (पीवी +) इंटरन्यूरॉन्स के बुनियादी इलेक्ट्रो-शारीरिक और रूपात्मक मापदंडों को दर्ज किया है; Ai9 ट्रांसजेनिक चूहों (उम्र के 7-12 सप्ताह) और एक मानक प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त एक ही क्षेत्र के कोरोनल स्लाइस से रिकॉर्डिंग के लिए इन की तुलना में ।

इंफ्रा-रेड डिफरेंशियल-इंटरसेस्ट कंट्रास्ट (आईआर-डीआईसी) माइक्रोस्कोप के तहत विजुअल इंस्पेक्शन पर हमने पहले से ही अपने ट्रांसवर्सल और कोरोनल स्लाइस के बीच स्पष्ट अंतर देखा । जबकि कोरोनल स्लाइस में प्रमुख कोशिका परत के न्यूरॉन्स अक्सर मोटे दिखाई देते थे और दृढ़ता से विपरीत रूपरेखा प्रदर्शित करते थे, ट्रांसवर्सल स्लाइस में न्यूरॉन्स ने ज्यादातर चिकनी सतहों को दिखाया और केवल हल्के विपरीत सीमाओं, बेहतर सेलुलर जीवन शक्ति का संकेत(चित्रा 2A)। कोरोनल और ट्रांसवर्सल स्लाइस के बीच सेल व्यवहार्यता में इन मतभेदों का कारण फाइबर ट्रैक्ट के संबंध में खंडित विमान के अभिविन्यास में झूठ हो सकता है। चूंकि ये कोरोनल सेक्शन में समानांतर नहीं हैं, इसलिए एक्सोन और डेंड्राइट्स कटे होंगे । इस धारणा के अनुरूप, हमने पाया कि स्लाइस के भीतर कणिका कोशिका परत और हिलस के सतह विमानों ने ट्रांसवर्सल स्लाइस (सतह विमानों में चरण आकार: 41.40 ± 3.28 माइक्रोन बनाम 25.60 ± 2.94 मीटर, कोरोनल में अधिक से अधिक विच्छेदन दिखाया मतलब ± SEM, Unpaired टी परीक्षण पी = 0.023), कोरोनलटुकड़ा (चित्रा 2B)में ऊतक वियोग की एक बड़ी डिग्री का सुझाव। इसका मतलब यह है कि पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त कोशिकाएं केवल कोरोनल स्लाइस के लिए कणिका सेल परत के गहरे विमानों में पाई जाएंगी, जो बदले में पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के थ्रूपुट को कम कर सकती हैं। दरअसल, हमारे ट्रांसवर्सल स्लाइस में गठन को सील करने का औसत समय कोरोनल स्लाइस (कणिका कोशिकाओं: 12.64± 1.50 एस, की तुलना में अधिक तेज़ था n= 11 कोरोनल बनाम 8.40 ± 0.75 एस, एन = 14 ट्रांसवर्सल स्लाइस में, मतलब ± एसईएम, पी = 0.0335 मान-व्हिटनी परीक्षण; पीवी + इंटरयूरॉन्स: 31.11 ± 2.60 एस, एन = 9 कोरोनल बनाम 22.00 ± 2.18, एन = 7 ट्रांसवर्सल स्लाइस में, मतलब ± एसईएम, पी = 0.0283 मान-व्हिटनी टेस्ट)(चित्रा 2C)। कोशिका अखंडता और स्वास्थ्य के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में हमने तब कणिका कोशिकाओं और पीवी + इंटरन्यूरॉन्स की आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) दर्ज की, जो कोरोनल बनाम में कणिका कोशिकाओं और पीवी + इंटरन्यूरॉन दोनों में काफी अधिक depolarized थे। ट्रांसवर्सल स्लाइस (कणिका कोशिकाएं:-62.55 ± 3.54 एमवी, एन = 11 कोरोनल बनाम-71.06 ± 2.31 एमवी, एन = 14 ट्रांसवर्सल स्लाइस में, मतलब ± एसईएम, पी = 0.0455 मान-व्हिटनी टेस्ट; पीवी + इंटरन्यूरॉन्स: -52.75 ± 1.66 एमवी, एन = 7 कोरोनल बनाम-59.36 ± 2.25 एमवी, एन = 6 ट्रांसवर्सल स्लाइस में मतलब ± SEM,, P= 0.0271 मान-व्हिटनी टेस्ट)(चित्रा 2D)। इन आंकड़ों कोरोनल टुकड़ा तैयारी बनाम ट्रांसवर्सल में स्वस्थ न्यूरॉन्स की एक उच्च संख्या का सुझाव देते हैं । दरअसल, स्वीकार्य आरएमपी (-55 एमवी फॉर ग्रैन्यूल कोशिकाओं के लिए कट-ऑफ की शुरूआत;-पीवी + इंटरन्यूरॉन्स के लिए 45 एमवी) के परिणामस्वरूप ट्रांसवर्सल स्लाइस (39.67 ± 8.37% की तुलना में कोरोनल में बहिष्कृत कोशिकाओं का प्रतिशत अधिक हुआ। n= 3 प्रायोगिक सत्र बनाम 23.00 ± 3.85%, n= 4 प्रायोगिक सत्र)(चित्रा 2E)। इसके अलावा, रिकॉर्ड की गई कणिका कोशिकाओं से न्यूरोनल आकृति विज्ञान के पुनर्निर्माण ने संकेत दिया कि ट्रांसवर्सल स्लाइस(चित्रा 3 ए,बी)में कणिका कोशिकाओं के लिए एक पूर्ण अक्षीय आर्बराइजेशन को पुनः प्राप्त करने की उम्मीद की संभावना बहुत बेहतर थी। इसके अलावा, ट्रांसवर्सल स्लाइस में पीवी + इंटरन्यूरॉन्स के रूपात्मक पुनर्निर्माण ने व्यापक अक्षीय और डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन के चित्रण की अनुमति दी, जिसमें छोटे विवरणों जैसे कि डेंड्रिटिक कताई35(चित्रा 3 सी)का दृश्य शामिल है।

Figure 1
चित्रा 1:पृष्ठीय-मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस से स्लाइस प्राप्त करने के लिए खंडीय प्रक्रिया का चित्रण। (ए)हिप्पोकैम्पस गठन का त्रि-आयामी प्रतिनिधित्व मस्तिष्क में अपने स्थानिक अभिविन्यास (मस्तिष्क एक्सप्लोरर, एलन इंस्टीट्यूट से संशोधित)37दिखा रहा है। डोंगल, इंटरमीडिएट और हिप्पोकैम्पस के वेंट्रल डिवीजनों (डीएचपीसी, आईएचपीसी, वीएचपीसी) को इंगित किया गया है, दांग एट अल (2009)7के अनुसार। पृष्ठीय-मध्यवर्ती हिप्पोकैम्पस का हिस्सा जो कटा हुआ होगा, हल्के हरे रंग में इंगित किया गया है। दाईं ओर इनसेट संदर्भ कुल्हाड़ियों के अभिविन्यास को दर्शाता है। (ख)पेट्री डिश पर समानांतर रेखाओं के साथ पार्श्व प्रांतस्था के संरेखण को दर्शाते हुए मस्तिष्क गोलार्द्ध का कार्टून । लाल बिंदीदार रेखा इंगित करती है कि नमूना धारक पर गोलार्द्ध को चिपकाने के लिए सतह बनाने के लिए ट्रिमिंग कट (प्रोटोकॉल में बिंदु 3.9) कहां करना है। काली बिंदीदार रेखाएं इंगित करती हैं कि स्लाइस कहां एकत्र किए जाते हैं। (ग)इस प्रक्रिया के बाद प्राप्त हिप्पोकैम्पस स्लाइस की उज्ज्वल क्षेत्र छवि श्रृंखला । पायल सतह से, पृष्ठीय से वेंट्रल: (i) 0.70 मिमी, (ii) 1.05 मिमी, (iii) 1.40 मिमी, (iv) 1.75 मिमी, (v) 2.10 मिमी, (vi) 2.45 मिमी (vii) 2.80 मिमी, (आठवीं) 3.15 मिमी। स्केल बार = 1 मिमी.(D)भंडारण कक्ष की तस्वीर और इसकी असेंबली के लिए आवश्यक सामग्री। 1. एक 81x क्रायोजेनिक शीशी भंडारण बॉक्स, 2 से शीशी स्पेसर ग्रिड। बेलिंड्रिक प्लास्टिक बॉक्स। 3. नायलॉन नेट, 4. पिपेट टिप। इनसेट। बेलनाट्रिक बॉक्स में डालने के लिए ग्रिड और ट्यूब धारक का पार्श्व दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:ट्रांसवर्सल स्लाइस कोरोनल स्लाइस की तुलना में बढ़ी हुई स्लाइस व्यवहार्यता दिखाता है। (A)डीआईसी-आईआर माइक्रोग्राफ स्वस्थ (काले तीर) और अस्वस्थ (सफेद तीर) ट्रांसवर्सल और कोरोनल स्लाइस में न्यूरोनल सोमता के उदाहरण दिखाते हैं । हिल = हिलस, जीसीएल = ग्रेन्यूल सेल लेयर, एमएल = आणविक परत। स्केल बार = 50 माइक्रोन।(ख)दोनों खंड प्रक्रियाएं कणिका कोशिका परत और हिलस (तीर सिर द्वारा इंगित) की सतह के बीच एक कदम का उत्पादन करती हैं। कदम की ऊंचाई ऊतक वियोग की सीमा का संकेत है और कोरोनल (एन = 5 ट्रांसवर्सल और एन = 5 कोरोनल स्लाइस, मीन±एसईएम, पी = 0.0238 मान-व्हिटनी परीक्षण) की तुलना में ट्रांसवर्सल वर्गों में काफी कम है। (ग)कणिका कोशिकाओं में गीगा-ओम सील गठन का समय (ट्रांसवर्सल में एन = 14 कोशिकाएं, एन = 11 कोशिकाएं कोरोनल; मतलब±SEM, पी = 0.0355, मान-व्हिटनी परीक्षण) और पीवी + आईएनएस (ट्रांसवर्सल में एन = 7 कोशिकाएं, कोरोनल स्लाइस में एन = 9 कोशिकाएं, मीन±एसईएम, पी = 0.0283 मान-व्हिटनी टेस्ट) स्लाइस। (घ)कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता (आरएमपी) को पैच किया गया (क्रमशः, एन = 14 और एन = 11 कणिका कोशिकाएं। मतलब±SEM, पी = 0.0455 मान-व्हिटनी परीक्षण। n=7 पीवी + आईएनएस और एन = 10 पीवी + आईएनएस, पी = 0.0271 मान-व्हिटनी परीक्षण)। (ई)एक प्रयोगात्मक सत्र के भीतर त्याग कोशिकाओं का प्रतिशत, (कोरोनल स्लाइस के साथ n = 3 सत्र, ट्रांसवर्सल स्लाइस के साथ एन = 4, मीन±एसईएम) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:ट्रांसवर्सल स्लाइस में कणिका कोशिकाओं और इंटरन्यूरॉन्स का रूपात्मक संरक्षण। कॉन्फोकल छवियां बायोसाइटिन से भरे कणिकाओं की कोशिकाओं को ट्रांसवर्सल स्लाइस(ए)में और पीवल्ब-आईरेस-क्रे के कोरोनल स्लाइस(बी)में दिखाती हैं; Ai9 ट्रांसजेनिक चूहों। संबंधित एक्सॉन को ग्रे और लाइट-ग्रे में खंगाला गया है। तैयारी के बीच अक्षतंश लंबाई और जटिलता में अंतर पर ध्यान दें। स्केल बार = 100 माइक्रोन(C1)कॉन्फोकल छवि एक बायोसिटीन से भरे tdTomato-सकारात्मक interneuron दिखा। हिल = हिलस, जीसीएल = कणिका कोशिका परत, एमएल = आणविक परत। स्केल बार = 50 माइक्रोन(C2) C1में बॉक्स्ड क्षेत्र का आवर्धन, डेंड्रिटिक कताई दिखा। स्केल बार = 2 माइक्रोन(डी)बायोसाइटिन के एक्सोन और डेंड्राइट्स के रूपात्मक पुनर्निर्माण C1 में इंटरन्यूरॉन से भरे (काले रंग में धूसर, सोमा और डेंड्राइट्स में अक्षतंतरा)। (ई)C1 में चित्रित कोशिकाओं की सोमता को बंद करें जिसमें बायोसाइटिन और परवलबुमिन-इम्यूनोरेएक्टिविटी (PVir) के कोलोकैलाइजेशन को दिखाया गया है । स्केल बार = 20 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

मुख्य रूप से व्यवहार प्रयोगों, शारीरिक अनुरेखण और क्षेत्र-विशिष्ट जोड़तोड़ के माध्यम से स्थानिक सीखने और नेविगेशन में अपनी भूमिका के लिए पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। इन तकनीकों के साथ स्लाइस-इलेक्ट्रो-शारीरिक पूछताछ को संयोजित करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल इकट्ठा किया है जो हिप्पोकैम्पस के मध्यवर्ती-वेंट्रल क्षेत्र के लिए संशोधित क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया के समान कोण का उपयोग करता है, लेकिन पृष्ठीय-मध्यवर्ती क्षेत्र से शुरुआती स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक उल्टे टुकड़ा करने का आदेश का उपयोग करता है। यह दृष्टिकोण हिप्पोकैम्पस के पृष्ठीय क्षेत्र को टुकड़ा और इकट्ठा करने के लिए आवश्यक समय को कम कर देता है, इस प्रकार स्लाइस व्यवहार्यता को बढ़ाता है।

इस विधि का उपयोग करके, हम नियमित रूप से पिल सतह से 1.4 मिमी-2.4 मिमी के बीच पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के गोलार्द्ध के प्रति तीन स्लाइस को पुनः प्राप्त करने में सक्षम हैं, जैसा कि चित्र 1सीमें दिखाया गया है। यद्यपि हिप्पोकैम्पस के बहुत सेप्टल पोल से ट्रांसवर्सल स्लाइस प्राप्त करना इस प्रक्रिया के साथ संभव नहीं है, लेकिन सेप्टल पोल(चित्रा 1C ii,iii)से प्रति गोलार्द्ध लगभग दो अतिरिक्त व्यवहार्य गैर-ट्रांसवर्सल स्लाइस एकत्र करना संभव है। यदि हिप्पोकैम्पस का सेप्टल पोल प्राथमिक अनुसंधान फोकस है, तो अन्य प्रोटोकॉल, जो ट्रांसवर्सल स्लाइस के संग्रह की अनुमति देते हैं, विशेष रूप से हिप्पोकैम्पस के बहुत सेप्टल पोल से,21, 32बेहतर अनुकूल हो सकते हैं। स्थानिक नेविगेशन और सीखने पर व्यवहार प्रयोग अधिमानतः पूरी तरह से विकसित न्यूरोनल कनेक्टिविटी के साथ परिपक्व चूहों में किए जाते हैं। नतीजतन, हम वयस्क जानवरों के दिमाग के लिए आवेदन के लिए हमारी टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया अनुकूलित किया है (तीन महीने पुराने चूहों के लिए यहां दिखाया गया है), जो लचीला किशोर तैयारी से अधिक तनाव के प्रति संवेदनशील हैं । इस उद्देश्य के लिए हमने कई रणनीतियों को संयुक्त किया है जो हाइपोक्सिक तनाव को कम करते हैं मस्तिष्क को निष्कर्षण और ऑक्सीजनयुक्त ACSF में स्लाइस के प्लेसमेंट के बीच के समय में उजागर किया जाता है। सुरक्षात्मक कटिंग समाधान एनएमडीए रिसेप्टर्स की सक्रियता के कारण एक्सटॉक्सिक क्षति और सेल सूजन को कम करने के लिए कमना + और सीए 2 + लेकिन उच्च एमजी 2 + के साथ एनएमडीजी आधारित ACSF25,27,28 है। इसके अलावा, HEPES स्थिर बफरिंग प्रदान करता है और एस्कॉर्बेट और पाइरुवेट जैसे यौगिक ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करते हैं। ठंडा और ऑक्सीजनयुक्त सुरक्षात्मक काटने के समाधान के साथ ट्रांस-कार्डियल परफ्यूजन मस्तिष्क को तेजी से और सजातीय रूप से मेटाबोलिक मांग और मस्तिष्क के ऊतकों में ग्लूटामेट-प्रेरित एक्सेक्टोक्सीसिटी को कम करने के लिए अत्यंत घने केशिका नेटवर्क का लाभ उठाता है। इसके बाद, पूरी प्रक्रिया के दौरान मेटाबोलिज्म और ऑक्सीजन के अभाव को न्यूनतम रखने के लिए ठंडा और ऑक्सीजनयुक्त समाधानों के भीतर डेपुटेशन के बाद लगभग सभी कदम किए जाते हैं। टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान मस्तिष्क की क्षति को कम करने के लिए अन्य रणनीतियां मौजूद हैं और समान रूप से मान्य हो सकती हैं38. हमारी तैयारी की गुणवत्ता को प्रदर्शित करने के लिए, हम इसकी तुलना कोरोनल स्लाइस तैयारी से करते हैं, जिसका उपयोग आमतौर पर पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है। हालांकि कोरोनल स्लाइस का उपयोग डेंटेट जाइरस में अच्छी पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ट्रांसवर्सल स्लाइस की तुलना में अस्वस्थ और डिस्कनेक्ट किए गए न्यूरॉन्स की संख्या अधिक है। इसके अलावा, एक्सोनल और डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन की अखंडता ट्रांसवर्सल स्लाइस में बेहतर संरक्षित है। वास्तव में कणिका कोशिका अक्षों(चित्रा 3 ए)की अखंडता, जो हिप्पोकैम्पस की देशांतर धुरी के लिए ऑर्थोगोनल चलातीहै,एक ट्रांसवर्सल स्लाइसिंग प्लेन 1 का सूचक के रूप में कार्य करती है ।

समझौता न्यूरॉन्स के भरने के लिए, हम 3 और 5 MΩ के बीच एक इलेक्ट्रोड प्रतिरोध का सुझाव देते हैं । लगभग 1 माइक्रोन की नोक का व्यास, रिकॉर्डिंग के दौरान एक अच्छा सील प्रतिरोध की उपलब्धि और इलेक्ट्रोड रिऐक्शन पर अच्छी फिर से सीलिंग की अनुमति देता है। सबसे महत्वपूर्ण विस्तार से सोमा या नाभिक के कुछ हिस्सों के चूषण से पिपेट में बचना है। इस कारण से, हम संभव होने पर इंट्रासेलुलर समाधान में एलेक्सा डाई सहित सुझाव देते हैं। डाई रिकॉर्डिंग और फिर से सीलिंग के दौरान सेल आकार की निगरानी की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह निर्धारण के बाद समझौता सेल की अखंडता का आकलन करने की अनुमति देता है, जो असफल भरने के मामलों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री समय को बचा सकता है। एलेक्सा रंगों की वजह से लंबे समय तक निर्धारण समय के साथ बुझा रहे हैं, हम यदि संभव हो तो कम निर्धारण का सुझाव देते हैं।

बाद में इम्यूनोस्टेटिंग के लिए, हम एक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं जिसमें स्लाइस के पुनः-सेक्शनिंग की आवश्यकता नहीं होती है। हम निर्धारण के बाद एक सप्ताह के भीतर धुंधला बनाने का सुझाव देते हैं । अब स्लाइस फ्रिज में रहते हैं, ऊतक क्षरण की संभावना अधिक है । यदि एक लंबे भंडारण से बचा नहीं जा सकता है, तो हम पीबीएस में NaN3 एकाग्रता को 0.05% तक बढ़ाने और इसे साप्ताहिक रूप से ताज़ा करने का सुझाव देते हैं। पूरे स्लाइस के इम्यूनोस्टेपिंग का मतलब है कि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन बार बढ़ जाता है। आमतौर पर, बायोसाइटिन का खुलासा करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रातभर इनक्यूबेशन पर्याप्त है, लेकिन यदि अन्य प्रोटीन के लिए धुंधला के साथ संयुक्त किया जाता है, तो पूरी धुंधला प्रक्रिया बहुत लंबे समय तक चल सकती है। परमीलाइजेशन-ब्लॉकिंग और एंटी-बॉडी इनक्यूबेशन को व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित करने की आवश्यकता है। आमतौर पर, प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, दो दिन पर्याप्त होते हैं जबकि एक दिन माध्यमिक के लिए पर्याप्त हो सकता है। हम पृष्ठभूमि की वृद्धि से बचने के लिए लंबे समय तक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के साथ धोने के चरणों की अवधि बढ़ाने की सलाह देते हैं।

इस प्रोटोकॉल में हमने वयस्क ऊतक की न्यूरोनल व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए ट्रांसवर्सल या लगभग ट्रांसवर्सल हिप्पोकैम्पल स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक टुकड़ा करने की विधि प्रस्तुत की है और आकृति विज्ञान और समझौता न्यूरॉन्स की न्यूरोकेमिकल पहचान को ठीक करने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है। इस विधि को आसानी से हिप्पोकैम्पस के मध्यवर्ती-पृष्ठीय भाग पर ध्यान केंद्रित शारीरिक और व्यवहार अध्ययनों के साथ इलेक्ट्रो-शारीरिक परिणामों से मेल खाने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए केर्स्टिन क्रोनेबिलिटर और डिडिएर ग्रेमेले को धन्यवाद देते हैं । हम ग्राफिक सॉफ्टवेयर और मैथस होप्पे के साथ वीडियोग्राफी और वीडियो-संपादन के लिए सहायता के लिए अम्बर्टो मोरेली को धन्यवाद देते हैं। हमारी प्रयोगशाला में काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, एसएफबी 1461 (परियोजना आईडी 434434223) और GRK2154, चिकित्सा अनुसंधान परिषद अनुदान G1100546/2 और कील विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1mL syringes Omnifix-F Braun melsungen AG 9161406V
24 multiwells SARSTEDT 8,33,922
81x criogenic vial storage box Fisherscientific 15-350-107B storage chamber
Alexa Hydrazide dye Invitrogen A10436
Big scissor Fine science tool 14010-15 graefe forceps
Biocytin IRIS biotech. LS3510.0250
Borosilicate Glass capillaries Science products GB150TF-10 storage chamber
Brush 5 Leonhardy 241 Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm
Calcium chloride dihydrate Roth 5239.2 aCSF  solution
Carbon steel microtome blade feather C35
Chloridric acid Roth K025.1
Confocal microscope Zeiss LSM880 with Airyscan
Cyanoacrylate glue UHU 509141
Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond 3M
EGTA Roth 3054.1
Fiji ImageJ fiji.sc
Filter paper 113A ROTILABO Roth AP180.1
Fine tip tweezer Dumont 0245fo
Glass becker (150 ml) ROTILABO Roth X690.1 incubation chamber and dissection
Glass Petri dishes (10 cm dia.) ROTILABO Roth 0690.1
Glucose Roth X997.2 aCSF  solution
Heated water bath Grant Instruments Ltd SUB14
HEPES Roth 9105.4 aCSF  solution
Isofluoran baxter 5239.2 Anesthetic
Large spatula Roth E286.1
Magnesium Sulfate heptahydrate Roth 8793.2 aCSF  solution
Mg-ATP Sigma Aldrich A9187
Microfil World precision instruments MF34G
Na2-GTP Sigma Aldrich 51120
N-methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 aCSF  solution
Normal goat serum Sigma Aldrich 566380
Nylon mesh kit Warner Instruments 64-0198 incubation chamber and storage chamber
Paraformaldeyde Sigma Aldrich P6148
Phosphate buffered saline 10X Panbiotech P04-53500
Phosphocreatine disodium Sigma Aldrich P7936
Pipette puller Sutter instrument P-2000
Pipette tips SARSTEDT 7,07,62,211 incubation chamber
Plastic box for syringe filters SUPELCO 54135-U storage chamber
Potassium Chloride Roth 6781.3 aCSF  solution
Potassium Gluconate Roth P1847
Probenbecker becker (100 ml) ROTILABO Roth HT85.1 incubation chamber
Rounded tip tweezers Fine science tool 11051-10
Sainless steel blade Gillette Vibratome
Small scissor Fine science tool 14010-10 mayo scissor straight
Sodium Ascorbate Roth 3149.2 aCSF  solution
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002
Sodium Bicarbonate Roth 6885.1 aCSF  solution
Sodium Chloride Roth 3957.1 aCSF  solution
Sodium Hydroxide Roth K021.1
Sodium Phosphate monobasicdihydrat Roth K300.1 aCSF  solution
Sodium Pyruvate Roth 8793.2 aCSF  solution
Streptavidin conjiugated Alexa 488 Invitogen s11223
Thin spatula Roth E286.1 Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm
Transfer pipette Sarstedt 861171
Triton x100 Roth 3051.1
Vibratome Thermoscientific Microm HM650V
Filter device for ultrapure water Merck-Millipore Milli-Q IQ 7000

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References

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Baccini, G., Brandt, S., Wulff, P. Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice. J. Vis. Exp. (170), e61980, doi:10.3791/61980 (2021).

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