Summary
Nous présentons un protocole pour préparer des tranches aiguës de l’hippocampe dorsale-intermédiaire des souris. Nous comparons cette préparation transversale avec le tranchage coronal en termes de qualité des enregistrements et de préservation des caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés.
Abstract
Bien que l’architecture générale de l’hippocampe soit similaire le long de son axe longitudinal, des études récentes ont révélé des différences importantes dans les critères moléculaires, anatomiques et fonctionnels suggérant une division en différents sous-circuits le long de son étendue rostro-caudale. En raison de la connectivité et de la fonction différentielles, la distinction la plus fondamentale est faite entre l’hippocampe dorsal et l’hippocampe ventral, qui sont préférentiellement impliqués dans le traitement spatial et émotionnel, respectivement. En conséquence, les travaux in vivo concernant la formation de la mémoire spatiale se sont concentrés sur l’hippocampe dorsal.
En revanche, les enregistrements in vitro électrophysi physiologiques ont été effectués de préférence sur l’hippocampe intermédiaire-ventral, en grande partie motivés par des facteurs tels que la viabilité des tranches et l’intégrité du circuit. Pour permettre une corrélation directe des données in vivo sur le traitement spatial avec des données in vitro, nous avons adapté les méthodes de sectionnement précédentes pour obtenir des tranches cérébrales transversales hautement viables de l’hippocampe dorsale-intermédiaire pour des enregistrements à long terme des cellules principales et des interurones dans le gyrus bosselé. Comme le comportement spatial est régulièrement analysé chez les souris adultes, nous avons combiné cette procédure transversale de tranchage avec l’utilisation de solutions protectrices pour améliorer la viabilité des tissus cérébraux des animaux matures. Nous utilisons cette approche pour les souris d’environ 3 mois. La méthode offre une bonne alternative à la préparation coronale qui est fréquemment utilisée pour des études in vitro sur l’hippocampe dorsal. Nous comparons ces deux préparations en termes de qualité des enregistrements et de préservation des caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés.
Introduction
L’hippocampe a été étudié en profondeur pour son rôle central dans différents aspects de l’apprentissage et de la mémoire, de la navigation spatiale ainsi que de l’émotion. Les circuits de base de l’hippocampe, communément appelés le « circuit trisynaptique », est un réseau lamellar dans l’axe transversal, qui est largement conservé le long de l’axe longitudinal1. Les contributions de l’hippocampe à divers comportements cognitifs et émotionnels proviennent probablement des diverses connexions que ce circuit de base fait le long de l’axe dorsoventral avec plusieurs autres régionsdu cerveau 2,3. Au-delà de la connectivité afferent et efferent, cependant, un nombre croissant d’études indiquent d’autres différences le long de l’axe septo-temporel de l’hippocampe. Ces différences concernent l’architecture interne et la connectivité ainsi que les différences dans les modèles d’expression des gènes et la morphologie neuronale4,5,6,7,8.
Compte tenu de l’existence de telles différences dans les circuits de base, il est raisonnable de choisir le sous-circuit hippocampal spécifique à étudier en fonction des questions qui sont abordées. Si, par exemple, la question concerne les mécanismes neuronaux impliqués dans le traitement spatial, l’hippocampe dorsal plutôt que ventral est intéressant, bien que les deux n’agissent pas indépendamment in vivo en raison de la connectivité longitudinale intra-hippocampe9,10,11. Dans ce sens, non seulement les différences le long de l’axe longitudinal doivent être prises en compte, mais il faut également prendre soin de préserver au mieux les circuits locaux et à longue portée. Pour la préservation des chemins de fibre et la connectivité, l’angle auquel le cerveau sera sectionné est essentiel.
La première méthode rapportée dans la littérature pour inclure le circuit trysinaptique a d’abord isolé l’hippocampe du cerveau, puis a fait des tranches transversales (perpendiculaires aux axes longitudinals) utilisant un hachoirde tissu 12 et un vibratome13. Plus tard, les physiologistes ont préféré obtenir des tranches d’un bloc cérébral entier pour préserver également les structures cérébrales adjacentes reliées à l’hippocampe. Pour ces préparations de bloc, différents angles de section par rapport à l’hippocampe ont été développés, tels qu’une préparation de tranche coronale14 ou une préparation horizontale de tranche nommée tranche de HEC pour préserver des connexions hippocampal-entorhinal de cortex15,16,17.
Dans cette dernière préparation, le lobe pariétal est coupé avec un angle de 0° ou 12° par rapport au plan horizontal le long de l’axe rostro-caudal pour former la base du bloc. Les tranches sont ensuite prélevées à partir de la surface ventrale du cerveau, permettant ainsi principalement la récolte de la région hippocampale intermédiaire-ventrale. Cette méthode est devenue le choix le plus populaire pour les études physiologiques et peut être effectuée de manière fiable suivant plusieurs protocolespubliés 18,19,20.
Cependant, si l’intérêt de recherche concerne des aspects spécifiques de l’apprentissage spatial, l’hippocampe dorsale peut être la région d’investigation la plus appropriée et il serait utile de trouver une procédure de tranchage de qualité similaire pour cette région hippocampale. Peu de protocoles, qui se concentrent sur le pôle très rostral, ont été développés qui peuvent satisfaire cette demande 21,22.
Dans ce protocole, au lieu de cela, nous décrivons une approche pour obtenir des tranches transversales viables de l’hippocampe dorsale-intermédiaire qui utilise l’angle de section précédemment décrit pour les préparationshorizontales 18,19 (Figure 1A& B). Nous démontrons la qualité de ce protocole en comparant les enregistrements électrophysiologiques et les reconstructions morphologiques dans cette préparation à ceux obtenus en tranches coronaires. Ce protocole est particulièrement adapté pour la combinaison avec des expériences anatomiques et comportementales chez les souris adultes (trois mois dans notre cas).
Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux expérimentaux étaient conformes à la Loi allemande sur le bien-être animal et approuvées par le comité d’éthique de l’université de Kiel. Parvalbumin-Cre (Pvalb-IRES-Cre) souris23 (laboratoires Jackson, numéro de dépôt 008069) ont été maintenues comme colonies hétérozygotes ou croisées avec ai9 Cre souris reporter24 (laboratoires Jackson, numéro de dépôt 007909). Des souris femelles et mâles entre P40-P90 ont été utilisées. Les souris ont été maintenues dans un cycle clair-foncé de 12 h dans des conditions standard de logement de groupe et ont été fournies avec la nourriture et l’eau ad libitum.
1. Préparation de solutions
REMARQUE : Préparez des solutions fraîches pour chaque journée expérimentale à l’aide d’eau ultrapure (UPW) (résistivité à 25 °C 18,2 MΩcm). Les solutions peuvent être stockées à 4 °C pour un maximum d’une journée. Les solutions de magnésium et de calcium peuvent être stockées séparément sous forme de solutions de stock de 1 M. Toutes les solutions de travail doivent être saturées de carbogen (95% O2:5% CO2)pour une oxygénation optimale et un entretien du pH avant et pendant l’utilisation.
- Préparer la solution de coupe (500 mL par souris) (en mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvate, 0,5 CaCl2·2H2O, et 10 MgSO4·7H2O. Titrate au pH 7,4 sous une hotte chimique avec 4-5 mL d’acide chlorhydrique de 16% avant d’ajouter les cations divalent. Cela permettra d’éviter les précipitations de MgSO4.
REMARQUE : KCl et NaH2PO4 peuvent être stockés sous forme de solutions 10x à 4°C. Nous faisons deux lots individuels de solution de coupe. Un la veille de l’enregistrement (stocké dans un congélateur pendant la nuit pour produire de la glace concassée) et un le jour de l’enregistrement. - Préparer la solution de stockage (250 mL par souris) (en mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glucose, 5 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O, et 2 MgSO4·7H2O. Titrate au pH 7.3-7.4 avec 1 N NaOH.
REMARQUE : NaCl, KCl et NaH2PO4 peuvent être stockés comme solution 10x à 4 °C. - Préparer ACSF pour l’enregistrement (en mM): 122 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12.5 glucose, 2 CaCl2·2H2O, et 2 MgSO4·7H2O, 2 Na-ascorbate, 4 Na-pyruvate. Titrate pH à 7.3-7.4 avec 1 N NaOH.
REMARQUE : NaCl, KCl et NaH2PO4 peuvent être combinés dans une solution de stock 10x à 4°C.
2. Préparation du banc pour le tranchage
- Préparer sur glace un bécher (150 mL) et deux boîtes de Pétri en verre (10 cm de diamètre) et les remplir de la solution de coupe fraîche. Gardez la solution oxygénée avec un dispositif de bouillonnement carbogen (un tube perforé ou une pierre d’air reliée au système carbogen).
REMARQUE : La solution dans le bécher sera utilisée pour la perfusion tandis que les boîtes de Petri seront utilisées pendant la procédure de coupe. - Équipez le banc de chirurgie d’une lame en acier inoxydable, d’une pince à pointe arrondie, d’une pince à pointe fine, de gros ciseaux, de petits ciseaux, d’une grosse spatule métallique, d’une fine spatule métallique, d’une brosse, de la plaque vibratoire et de la colle cyanoacrylate ou de l’adhésif cyanoacrylate n-butyl-ester moins toxique. Immerger une lame en acier inoxydable et un morceau de papier filtre dans l’une des boîtes en verre Petri sur la glace. Ce Petri sera utilisé pour couper le cerveau. Dessinez trois lignes parallèles sur le fond d’une boîte de Pétri en plastique et placez ce plat près des instruments chirurgicaux.
- Préparez la mise en place de la perfusion trans-cardiale selon les protocoles publiés25.
- Préparer le vibratome, monter une nouvelle lame sur le support de la lame et définir les paramètres de coupe (angle de la lame du plan horizontal 17°, amplitude d’oscillation de lame 1,5 mm, vitesse de mouvement avant de la lame à environ 2 mm min-1, fréquence oscillation 90 Hz, épaisseur de section 350 μm). Remplissez le plateau vibratome d’une solution de coupe glacée et gardez-le sous oxygénation constante.
REMARQUE : Nous ajoutons la glace concassée faite à partir du premier lot de solution de coupe à la solution de coupe fraîche refroidie pour maintenir la température vers le bas. Faites attention à garder la glace de la lame pendant le tranchage. - Préparer une chambre d’incubation remplie de la solution de coupe sous oxygénation constante. Placer la chambre dans un bain d’eau préchauffé (35 °C).
REMARQUE : Un exemple pour la chambre d’incubation se trouve dans Edwards et Konnerth (1992)26. - Préparez une chambre de rangement en tranches remplie de la solution de rangement et gardez-la à température ambiante et sous oxygénation constante. Dans le cas où le tissu exprime une protéine fluorescente ou une opsine activée par la lumière, il est recommandé de garder la chambre dans l’obscurité, par exemple, à l’intérieur d’une boîte.
REMARQUE : une chambre de stockage avec plusieurs puits indépendants est utile pour distinguer le niveau des tranches le long de l’axe dorsoventral de l’Hippocampe. Une chambre sur mesure peut être construite (Figure 1D). Prenez un morceau de grille d’espaceur de flacon d’une boîte cryogénique de stockage de flacon de 81x et collez le fond sur un filet en nylon. Insérez le tiers supérieur d’une pointe en plastique pipette de 5 mL au centre de cette grille, de sorte qu’elle colle environ 3 cm au fond. Cette pointe en plastique sert de support de la grille et tient plus tard le tube d’air pour l’oxygénation. Insérez la grille avec son support dans une boîte en plastique cylindrique (p. ex., emballage des filtres à seringues) de sorte qu’elle ne puisse pas s’incliner ou vaciller. Ce réservoir d’une capacité de stockage de 250 mL.
3. Préparation de tranches hippocampiques
- Anesthésier la souris dans une chambre à boîte à l’aide d’isoflurane (environ 0,5 mL) sous le capot. Laisser reposer la souris jusqu’à ce que la respiration soit lente et régulière (environ 2-3 minutes). Testez l’absence de réponses à la douleur avec pincements d’ateil.
- Effectuer la perfusion trans-cardiale à l’aide de 25 mL de solution de coupe gazéifié à partir du bécher sur glace suivant les protocolespubliés 25,27. Cette étape est recommandée pour refroidir le cerveau rapidement pour ralentir rapidement le métabolisme neuronal.
- Décapiter l’animal à l’aide des gros ciseaux et placer la tête dans la boîte de Pétri refroidie sur de la glace contenant la solution de coupe.
- Ouvrez la peau avec les ciseaux fins pour exposer le crâne. Faire de petites incisions latérales dans la base du crâne des deux côtés du magnum foramen. Ensuite, couper le long de la suture sagittale à partir du magnum foramen jusqu’à atteindre la suture naso-frontale au-dessus de l’ampoule olfactive. Tirez vers le haut du ciseaux pendant la coupe sagittale pour éviter des dommages du tissu cérébral sous-jacent.
REMARQUE : Garder la tête immergée dans la solution de coupe aide à la dégager du sang et maintient la température à un bas. - Utilisez la pince à pointe arrondie pour tirer vers le haut des os pariétals pour exposer le cerveau. Faites attention à mettre la main sur et enlever les méninges aussi. S’ils sont laissés, ils peuvent endommager le cerveau pendant l’extraction.
- Utilisez la petite spatule pour ramasser doucement le cerveau dans la deuxième boîte de Pétri.
- Couper le cerveau en deux le long de la fissure longitudinale à l’aide de la lame pré-refroidie.
- Utilisez la grande spatule pour soulever un hémisphère de la solution de coupe et sur la boîte en plastique Petri. Avec l’hémisphère couché sur sa surface médiale, aligner le cortex pariétal avec l’une des lignes parallèles pour avoir une référence pour la deuxième coupe comme le montre la figure 1B.
- Effectuez la deuxième coupe à la partie ventrale de l’hémisphère en positionnant la lame en parallèle aux lignes pour obtenir la surface, qui est plus tard utilisée pour coller le cerveau sur le porte-spécimen (voir l’étape suivante), comme le montre la figure 1B. Retournez l’hémisphère dans la solution de coupe oxygénée de la boîte de pétri de verre et effectuez la même procédure sur le deuxième hémisphère.
- Collez les hémisphères avec le côté ventral fraîchement coupé sur le support vibratome-spécimen à l’aide de l’adhésif. Mettez quelques gouttes de solution de coupe sur les hémisphères pour solidifier la colle et déplacer le porte-spécimen dans le plateau vibratome. De cette façon, le tranchage se déroulera du dorsale à l’hippocampe ventral.
- Retirez la ou deux tranches initiales non transversales (figure 1C,ii-iii ) jusqu’àce que la région d’intérêt devienne visible, puis commencez à recueillir les tranches.
REMARQUE : Des tranches saines non transversales mais utilisables peuvent être obtenues à partir de l’hippocampe dorsale au début de la procédure de tranchage (figure 1C, ii-iii). La collecte de chaque tranche nécessite environ 3-4 min. En commençant la coupe à partir de l’hippocampe dorsal au lieu de l’hippocampe ventral, nous sauvons environ 10 minutes, ce qui améliore la viabilité des tranches dorsales. - À l’aide d’une pipette en plastique (couper l’extrémité étroite de la pointe), transférer chaque tranche dans la chambre d’incubation (contenant une solution de coupe à 35 °C) et la laisser reposer pendant 12 minutes. La brève période de récupération dans la solution de coupe chaude réduit considérablement le gonflement neuronal initial, tel que rapporté dans Ting et autres (2014)28. Ensuite, à l’aide d’une brosse transférer la tranche dans la chambre de stockage (contenant la solution de stockage à RT) et laisser reposer jusqu’au début de l’expérience.
4. Enregistrement à cellules entières et remplissage de biocytine
REMARQUE: La description de l’enregistrement patch-clamp à cellules entières est réduite ici seulement à des étapes clés qui aident à obtenir un bon remplissage de biocytine et est généralement applicable aux neurones dans ACSF. Pour plus de détails sur les procédures des enregistrements électrophysiologiques, plusieurs autres protocoles peuvent êtreconsultés 29,30.
- Choisissez une solution intracellulaire appropriée en fonction des paramètres à enregistrer. À titre d’exemple, pour les mesures actuelles de la pince, une solution à base de gluconate de potassium peut être utilisée (en mM) : 135 K-Gluconate, 3 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 10 phosphocreatine-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na2-GTP. Réglez le pH à 7,3 avec 1 M KOH. L’osmolalité devrait être d’environ 285-290 mOsmol/kg une fois que 3-5 mg/mL de biocytine est ajouté.
REMARQUE : Pour surveiller la forme du neurone pendant l’enregistrement, 0,3-0,5 μL/mL de 1 mM Alexa Fluor Hydrazide peut être ajouté à la solution intracellulaire. Dans ce cas, rappelez-vous pour la révélation de biocytine, pour assortir la couleur de colorant d’Alexa avec la sonde fluorescente couplée à la streptavidine. - Préparer des électrodes à clapets de ≤1 diamètre de pointe de μm et une résistance de 3 à 5 MΩ provenant de capillaires borosilicate à paroi épaisse.
- Démarrez le système de perfusion de la configuration patch-clamp avec une vitesse de 2,5-3 mL/min à RT ou 35-37 °C et fixez une tranche dans la chambre avec une ancre en forme de U.
- Identifiez la région cérébrale d’intérêt et choisissez un neurone sain avec le soma au moins 30-50 μm sous la surface de la tranche.
REMARQUE : Le soma d’un neurone sain a une surface lisse, et les bordures de membrane sont légèrement contrastées. Le soma du neurone malsain semble rétréci et fortement contrasté ou gonflé et semi-transparent. - Chargez une pipette en verre avec la solution intracellulaire jusqu’à ce que la pointe de l’électrode AgCl soit couverte. Déplacez la pipette dans la solution de la chambre d’enregistrement, en appliquant une légère pression positive pour garder clair le bout de l’électrode de verre.
REMARQUE : Si la solution contient un colorant Alexa, la pression peut être contrôlée visuellement en ajustant la quantité de solution fluorescente libérée par la pointe. Une pression minimale permettrait d’éviter la coloration du tissu autour de la cellule. - Approchez la cellule sous un angle oblique et établissez le contact dans le premier tiers de la surface de soma lors de la formation du giga-joint. Relâchez la pression, déplacez lentement le potentiel de fixation à-65 mV et appliquez une aspiration douce par la bouche pour faciliter la formation de giga-joint.
- Pour établir la configuration de l’ensemble des cellules, appliquez une aspiration forte et brève pour briser la membrane. Jetez l’enregistrement si le neurone a un potentiel membranaire plus dépolarisé que 50 mV, si le courant de détention augmente au-delà de 100 pA ou si la résistance à l’accès augmente au-delà de 30 MΩ.
- Après l’enregistrement (pour un remplissage suffisant de somata et de dendrites au moins 15 min sont recommandés; pour le remplissage des axones complexes jusqu’à une heure peut-êtrenécessaire 31) soigneusement enlever l’électrode. À cette fin, réglez le potentiel de détention à 0 mV et essayez de re-former un giga-joint en rétractant lentement la pipette dans la direction opposée à l’approche, par exemple pour obtenir une configuration de patch extérieur.
REMARQUE : La présence du colorant Alexa dans les solutions intracellulaires aide à l’enlèvement visuellement guidé de la pipette de la surface neuronale. Si le noyau de la cellule n’est pas en contact avec la pointe pipette, une méthode rapide pour réformer le joint tire la pipette hors du tissu en diagonale et vers le haut à grande vitesse. Si le noyau ou une partie de la membrane réside dans la pointe, il y a un danger de casser la membrane plasmatique. Dans ce cas, une légère application de pression positive et un mouvement latéral peuvent aider. - Notez la position de la cellule et l’orientation de la tranche. Après fixation, l’orientation exacte de la tranche et l’intégrité de la cellule remplie peuvent être vérifiées au microscope fluorescent.
5. Immunostaining, acquisition d’images et reconstruction morphologique
- Après enregistrement, transférer les tranches dans une plaque de 24 puits pour la fixer en paraformaldéhyde (PFA) 4 % en solution saline phosphatée (PBS) de 0,1 M. Incuber pendant 60 min à RT ou toute la nuit à 4 °C, selon la sensibilité des anticorps primaires utilisés. Les tranches peuvent être stockées dans 0,1 M PBS et 0,02% NaN3.
ATTENTION: PFA est toxique. Utiliser sous le capot. - Effectuer l’immunostaining et la révélation de biocytine dans la semaine qui a suivi l’enregistrement selon les protocolesétablis 32,33.
REMARQUE : Nous utilisons une procédure qui évite le re-sectionnement de la tranche pour préserver l’intégrité des processus dendritiques et axonals. Cependant, cette procédure nécessite des temps d’incubation plus longs car les anticorps doivent pénétrer dans le tissu. Nous suggérons de tester le temps de pénétration optimale des anticorps dans le tissu avant d’effectuer l’expérience. - Obtenez des images à l’aide d’un microscope confocal avec fonction Z-stack et carrelage.
- Effectuer la reconstruction morphologique à l’aide de Fidji imageJ34.
REMARQUE : Plusieurs formats de fichiers d’image peuvent être importés dans le programme à l’aide du plugin bio-format. Nous recommandons l’utilisation du plugin Simple Neurite Tracer (STN)35 pour la reconstruction des dendrites et de l’axon. Un tutoriel simple et clair est disponible à l’https://imagej.net/SNT et http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/. Le fichier contenant les données de traçage (.traces), s’il est enregistré non compressé, peut être converti en fichier texte et ouvert avec Matlab ou d’autres logiciels pour le traitement des données textuelles.
Representative Results
Dans ce protocole, nous décrivons comment préparer les tranches hippocampiques aiguës de la partie dorsale-intermédiaire de l’hippocampe (Figure 1A). Le protocole est particulièrement approprié pour les expériences qui étudient les mécanismes impliqués dans l’apprentissage spatial et peuvent être combinés avec le travail comportemental ou les stratégies virales d’étiquetage ou de manipulation dans l’hippocampe dorsal35. L’application de la procédure de section décrite ici aux animaux injectés avec le GFP cre-dépendant exprimant le virus adeno-associé (AAV-FLEX-GFP) dans l’hippocampe dorsale des souris de Pvalb-IRES-Cre à différentes coordonnées de Bregma AP-1.94 mm, ML ± 0,5-2 mm, profondeur-1,25-2,25 mm pour cibler différentes régions de la formation hippocampale36, nous avons pu obtenir au moins trois tranches transversales contenant les régions infectées(figure 1A coloration vert clair sur le modèle 3D de l’hippocampe). En outre, plusieurs tranches non transversales mais saines peuvent être obtenues à partir des parties plus rostrales de l’hippocampe dorsale (Figure 1C).
Pour démontrer la qualité et la viabilité de nos tranches, nous avons enregistré des paramètres électrophysiologiques et morphologiques de base des cellules granuleuses et des interurones parvalbumin-positifs (PV+) étiquetés tdTomato dans le gyrus bosselé de Pvalb-IRES-Cre; Souris transgéniques Ai9 (7-12 semaines) et les ont comparées à des enregistrements de tranches coronaires de la même région obtenus avec un protocole standard.
Lors de l’inspection visuelle au microscope infrarouge de contraste différentiel-interférence (IR-DIC), nous avons déjà remarqué des différences claires entre notre tranche transversale et la tranche coronale. Alors que les neurones de la couche cellulaire principale dans les tranches coronale apparaissaient souvent grossiers et présentaient des contours fortement contrastés, les neurones de la tranche transversale montraient surtout des surfaces lisses et seulement des bordures légèrement contrastées, ce qui indique une meilleure vitalité cellulaire (figure 2A). La raison de ces différences dans la viabilité cellulaire entre les tranches coronale et transversale peut résider dans l’orientation du plan de sectionnement par rapport aux voies de fibre. Comme ceux-ci ne sont pas en parallèle dans les sections coronaires, les axones et les dendrites seront sectionnés. Conformément à cette hypothèse, nous avons constaté qu’à l’intérieur des tranches, les plans de surface de la couche et de l’hilus des cellules granulées présentaient une plus grande discontinuité dans le coronal que la tranche transversale (taille des pas dans les plans de surface : 41,40 ± 3,28 μm contre 25,60 ± 2,94 μm, Moyenne ± SEM, T-test non apprélisé P = 0,023), suggérant un plus grand degré de déconnexion tissulaire dans la tranche coronale (Figure 2B). Cela signifie que les cellules appropriées pour les enregistrements patch-clamp ne seront trouvées qu’à des plans plus profonds de la couche cellulaire granuleuse pour les tranches coronales, ce qui à son tour peut réduire le débit des enregistrements patch-clamp. En effet, le temps moyen de formation des joints dans notre tranche transversale était plus rapide que pour les tranches coronales (cellules granuleuses : 12,64 ± 1,50 s, n=11 en coronal contre 8,40 ± 0,75 s, n=14 en tranches transversales, moyenne ± SEM, P = 0,0335 test Mann-Whitney; INTERurones PV+ : 31,11 ± 2,60 s, n=9 en coronal contre 22,00 ± 2,18, n=7 en tranches transversales, moyenne ± SEM, P = 0,0283 test Mann-Whitney) (figure 2C). En tant que proxy pour l’intégrité et la santé cellulaires, nous avons ensuite enregistré les potentiels de membrane de repos (RMP) des cellules granuleuses et des interurones PV+, qui ont été significativement plus dépolarisés dans les cellules granuleuses et les interurones PV+ dans coronal vs. tranches transversales (cellules granulées:-62,55 ± 3,54 mV, n=11 en coronal vs-71,06 ± 2,31 mV, n=14 en tranches transversales, moyenne ± SEM, P=0,0455 Mann-Whitney essai; PV+ interneurones:-52.75 ± 1.66 mV, n=7 en coronal vs.-59.36 ± 2.25 mV, n=6 en tranches transversales Moyenne ± SEM,, P= 0.0271 Mann-Whitney test) (Figure 2D). Ces données suggèrent un nombre plus élevé de neurones sains dans la préparation transversale par rapport à la préparation de la tranche coronale. En effet, l’introduction d’un cut-off pour le RMP acceptable (-55 mV pour les cellules granuleuses;-45 mV pour les interurones PV+) a entraîné un pourcentage plus élevé de cellules exclues dans les tranches coronales que dans les tranches transversales (39,67 ± 8,37 %, n=3 sessions expérimentales contre 23,00 ± 3,85 %, n=4 sessions expérimentales) (Figure 2E). En outre, la reconstruction de la morphologie neuronale à partir de cellules granuleuses enregistrées a indiqué que, comme prévu, les chances étaient beaucoup mieux de récupérer une arborisation axonale complète pour les cellules granuleuses dans la tranche transversale (Figure 3A,B). En outre, la reconstruction morphologique des interurones PV+ en tranches transversales a permis la représentation d’arborisations axonales et dendritiques étendues, y compris la visualisation de petits détails tels que les épines dendritiques35(Figure 3C).
Figure 1: Illustration de la procédure de sectionnement pour obtenir des tranches de l’hippocampe dorsale-intermédiaire. (A) Représentation tridimensionnelle de la formation hippocampale montrant son orientation spatiale dans le cerveau (modifiée de Brain Explorer, Allen Institute)37. Les divisions dorsales, intermédiaires et ventrales de l’hippocampe (dHPC, iHPC, vHPC) sont indiquées, selon Dong et coll. (2009)7. La partie de l’hippocampe dorsale-intermédiaire qui sera tranchée est indiquée en vert clair. L’encart à droite montre l’orientation des axes de référence. (B) Dessin animé d’un hémisphère cérébral représentant l’alignement du cortex pariétal avec les lignes parallèles sur la boîte de Petri. La ligne pointillée rouge indique où effectuer la coupe de coupe (point 3.9 dans le protocole) pour créer la surface pour coller l’hémisphère sur le porte-spécimen. Les lignes pointillées noires indiquent où les tranches sont collectées. (C) Série d’images de champ lumineux de tranches hippocampiques obtenues à la suite de cette procédure. De la surface piale, dorsale au ventral : (i) 0,70 mm, (ii) 1,05 mm, (iii) 1,40 mm, iv) 1,75 mm, v) 2,10 mm, (vi) 2,45 mm (vii) 2,80 mm, (viii) 3,15 mm. Barre d’échelle = 1 mm. (D) Photo de la chambre de stockage et du matériau nécessaire à son assemblage. 1. Grille de l’espaceur Vial à partir d’une boîte de stockage de flacon cryogénique de 81 x, 2. Boîte en plastique cylindrique. 3. Filet de nylon, 4. Pointe pipette. introduire. Vue latérale de la grille et du support du tube à insérer dans la boîte cylindrique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 :La tranche transversale montre une meilleure viabilité des tranches par rapport à la tranche coronale. (A) Micrographes DIC-IR montrant des exemples sains (flèches noires) et malsains (flèches blanches) de somata neuronal dans les tranches transversales et coronaires. Hil=hilus, gcl=couche cellulaire granule, ml= couche moléculaire. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Les deux procédures de sectionnement produisent une étape entre la surface de la couche de cellules granulées et le hilus (indiqué par des têtes fléchées). La hauteur de l’étape est indicative de l’étendue de la déconnexion tissulaire et est significativement plus faible dans les sections transversales que dans le coronal (n=5 tranches transversales et n=5 tranches coronale, Moyenne±SEM, P=0,0238 Mann-Whitney test). (C) Temps de formation de joints giga-ohm dans les cellules granuleuses (n=14 cellules dans les cellules transversales, n=11 cellules coronales; Tranches mean±SEM, P= 0.0355, Mann-Whitney) et PV+ INs (n=7 cellules dans des tranches transversales, n=9 en tranches coronales, Moyenne±SEM, P= 0.0283 Mann-Whitney test). (D) Potentiel de membrane de repos (RMP) des cellules patchées (respectivement, n = 14 et n =11 cellules granuleuses. Test ±SEM, P=0,0455 Mann-Whitney. n=7 PV+ INs et n=10 PV+ INs, P= 0.0271 Mann-Whitney test). (E) Pourcentage de cellules jetées au cours d’une session expérimentale (n=3 séances avec tranche coronale, n=4 avec tranche transversale, Moyenne±SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Conservation morphologique des cellules granuleuses et des interurones dans la tranche transversale. Images confocales montrant des cellules granuleuses remplies de biocytine dans une tranche transversale (A) et dans une tranche coronale (B) de Pvalb-IRES-Cre; Souris transgéniques Ai9. Les axones respectifs ont été reconstruits en gris et gris clair. Notez la différence de longueur d’axon et de complexité entre les préparations. Barre d’échelle=100 μm. (C1) Image confoccale montrant un interneurone tdTomato-positif rempli de biocityn. Hil=hilus, gcl=granule cell layers, ml= couche moléculaire. Bar à l’échelle =50 μm. (C2) Grossissement de la zone en boîte en C1, montrant des épines dendritiques. Scale bar=2 μm (D) Reconstruction morphologique des axones et des dendrites de l’interneurone rempli de biocytine en C1 (axone en gris, soma et dendrites en noir). (E) Fermez-vous vers le haut du somata des cellules représentées dans C1 montrant la colocalisation de la biocytine et de la parvalbumin-immunoréactivité (PVir). Scale bar=20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
L’hippocampe dorsal a été largement étudié pour son rôle dans l’apprentissage spatial et la navigation principalement par des expériences comportementales, des traçages anatomiques et des manipulations spécifiques à chaque région. Pour combiner les demandes de soins électrophysiologiques en tranches avec ces techniques, nous avons assemblé un protocole qui utilise un angle de sectionnement similaire à celui du tranchage horizontal modifié pour la région intermédiaire-ventrale de l’hippocampe, mais qui utilise un ordre de tranchage inversé pour obtenir des tranches précoces de la région dorsale-intermédiaire. Cette approche réduit le temps nécessaire pour trancher et recueillir la région dorsale de l’hippocampe, améliorant ainsi la viabilité des tranches.
En utilisant cette méthode, nous sommes en mesure de récupérer régulièrement environ trois tranches par hémisphère de la région hippocampale dorsale entre 1,4 mm-2,4 mm de la surface piale, comme le montre la figure 1C. Bien qu’il ne soit pas possible avec cette procédure d’obtenir des tranches transversales à partir du pôle très septal de l’hippocampe, il est possible de recueillir environ deux tranches non transversales viables supplémentaires par hémisphère à partir du pôle septal (Figure 1C ii,iii). Si le pôle septal de l’hippocampe est le principal centre de recherche, d’autres protocoles, qui permettent la collecte de tranches transversales, en particulier à partir du pôle très septal de l’hippocampe, peuvent être mieuxadaptés 21,32. Des expériences comportementales sur la navigation spatiale et l’apprentissage sont de préférence réalisées chez des souris matures avec une connectivité neuronale pleinement développée. Par conséquent, nous avons optimisé notre procédure de tranchage pour l’application au cerveau d’animaux adultes (montré ici pour les souris de trois mois), qui sont plus sensibles au stress que la préparation juvénile résiliente. À cette fin, nous avons combiné plusieurs stratégies qui réduisent le stress hypoxique auquel le cerveau est exposé entre l’extraction et le placement des tranches dans l’ACSF oxygéné. La solution de coupe protectrice est un ACSF25 , 27,28 à base de NMDG avec faible Na+ et Ca2+ mais élevé Mg2+ pour réduire les dommages excitotoxiques et l’enflure cellulaire due à l’activation des récepteurs NMDA. En outre, HEPES fournit une protection tampon stable et des composés tels que l’ascorbate et le pyruvate réduisent le stress oxydatif. La perfusion trans-cardiale avec la solution de coupe protectrice réfrigérée et oxygénée tire parti du réseau capillaire extrêmement dense fournissant au cerveau pour réduire rapidement et homogènement la demande métabolique et l’excitotoxicité induite par le glutamate dans le tissu cérébral. Par la suite, presque toutes les étapes suivant la décapitation sont effectuées dans les solutions refroidies et oxygénées pour maintenir le métabolisme et la privation d’oxygène au minimum pendant toute la procédure. D’autres stratégies pour réduire des dommages de cerveau pendant le tranchage existent et peuvent être égalementvalables 38. Pour démontrer la qualité de notre préparation, nous la comparons à une préparation de tranche coronale, qui est couramment utilisée pour enregistrer à partir de l’hippocampe dorsal. Même si les tranches coronale peuvent être utilisées pour obtenir un bon enregistrement patch-clamp dans le gyrus bosselé, le nombre de neurones malsains et déconnectés est plus élevé que dans la tranche transversale. De plus, l’intégrité des arborisations axonales et dendritiques est mieux préservée dans la tranche transversale. En fait, l’intégrité des axones granulés (Figure 3A), qui courent orthogonal à l’axe longitudinal de l’hippocampe sert d’indicateur d’un plan transversal de découpage1.
Pour le remplissage des neurones patchés, nous suggérons une résistance à l’électrode entre 3 et 5 MΩ. Un diamètre de la pointe d’environ 1 μm, permet l’accomplissement d’une bonne résistance des joints pendant l’enregistrement et une bonne ré-scellement lors de la rétractation des électrodes. Le détail le plus crucial est d’éviter l’aspiration de parties du soma ou du noyau dans la pipette. Pour cette raison, nous suggérons d’inclure un colorant Alexa dans la solution intracellulaire lorsque c’est possible. Le colorant permet de surveiller la forme de la cellule lors de l’enregistrement et du réancellement. En outre, il permet d’évaluer l’intégrité de la cellule patchée après fixation, ce qui peut sauver du temps d’immunohistochimie, en cas de remplissages infructueux. En raison des dyes Alexa sont trempés avec un long temps de fixation, nous suggérons une fixation courte si possible.
Pour l’immunostaining ultérieur, nous utilisons un protocole qui ne nécessite pas le re-section de la tranche. Nous suggérons de faire la coloration dans une semaine après la fixation. Plus les tranches restent longtemps dans le réfrigérateur, plus le risque de dégradation des tissus est élevé. Si un stockage long ne peut pas être évité, nous suggérons d’augmenter la concentration de NaN3 dans le PBS à 0,05% et de la rafraîchir chaque semaine. L’immunostaining de la tranche entière signifie que les temps d’incubation avec les anticorps primaires et secondaires augmentent. Habituellement, pour révéler la biocytine, une incubation d’une nuit à 4 °C suffit, mais si elle est combinée avec la coloration pour d’autres protéines, l’ensemble de la procédure de coloration peut durer beaucoup plus longtemps. Le blocage de la perméabilisation et l’incubation anticorps doivent être optimisés individuellement. Habituellement, pour l’anticorps primaire, deux jours sont suffisants tandis qu’un jour peut suffire pour le secondaire. Nous recommandons d’augmenter la durée des étapes de lavage ainsi que des incubations d’anticorps plus longues pour éviter l’augmentation du fond.
Dans ce protocole, nous avons présenté une méthode de tranchage pour obtenir des tranches hippocampales transversales ou presque transversales préservant la viabilité neuronale du tissu adulte et une approche pratique pour récupérer la morphologie et l’identité neurochimique des neurones patchés. Cette méthode peut être facilement exécutée pour assortir des résultats électrophysi physiologiques avec des études anatomiques et comportementales se concentrant sur la partie intermédiaire-dorsale de l’hippocampe.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Kerstin Kronenbitter et Didier Gremelle pour leur assistance technique. Nous remercions Umberto Morelli pour son aide aux logiciels graphiques et Mathias Hoppe pour la vidéographie et le montage vidéo. Les travaux dans notre laboratoire ont été soutenus par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Project-ID 434434223) et GRK2154, la subvention du Conseil de recherches médicales G1100546/2 et l’Université kiel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringes Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
| 24 multiwells | SARSTEDT | 8,33,922 | |
| 81x criogenic vial storage box | Fisherscientific | 15-350-107B | storage chamber |
| Alexa Hydrazide dye | Invitrogen | A10436 | |
| Big scissor | Fine science tool | 14010-15 | graefe forceps |
| Biocytin | IRIS biotech. | LS3510.0250 | |
| Borosilicate Glass capillaries | Science products | GB150TF-10 | storage chamber |
| Brush 5 | Leonhardy | 241 | Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.2 | aCSF solution |
| Carbon steel microtome blade | feather | C35 | |
| Chloridric acid | Roth | K025.1 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | with Airyscan |
| Cyanoacrylate glue | UHU | 509141 | |
| Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond | 3M | ||
| EGTA | Roth | 3054.1 | |
| Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
| Filter paper 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
| Fine tip tweezer | Dumont | 0245fo | |
| Glass becker (150 ml) | ROTILABO Roth | X690.1 | incubation chamber and dissection |
| Glass Petri dishes (10 cm dia.) | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | aCSF solution |
| Heated water bath | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF solution |
| Isofluoran | baxter | 5239.2 | Anesthetic |
| Large spatula | Roth | E286.1 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
| Microfil | World precision instruments | MF34G | |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF solution |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | 566380 | |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments | 64-0198 | incubation chamber and storage chamber |
| Paraformaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline 10X | Panbiotech | P04-53500 | |
| Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | |
| Pipette puller | Sutter instrument | P-2000 | |
| Pipette tips | SARSTEDT | 7,07,62,211 | incubation chamber |
| Plastic box for syringe filters | SUPELCO | 54135-U | storage chamber |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.3 | aCSF solution |
| Potassium Gluconate | Roth | P1847 | |
| Probenbecker becker (100 ml) | ROTILABO Roth | HT85.1 | incubation chamber |
| Rounded tip tweezers | Fine science tool | 11051-10 | |
| Sainless steel blade | Gillette | Vibratome | |
| Small scissor | Fine science tool | 14010-10 | mayo scissor straight |
| Sodium Ascorbate | Roth | 3149.2 | aCSF solution |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium Bicarbonate | Roth | 6885.1 | aCSF solution |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | aCSF solution |
| Sodium Hydroxide | Roth | K021.1 | |
| Sodium Phosphate monobasicdihydrat | Roth | K300.1 | aCSF solution |
| Sodium Pyruvate | Roth | 8793.2 | aCSF solution |
| Streptavidin conjiugated Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
| Thin spatula | Roth | E286.1 | Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm |
| Transfer pipette | Sarstedt | 861171 | |
| Triton x100 | Roth | 3051.1 | |
| Vibratome | Thermoscientific | Microm HM650V | |
| Filter device for ultrapure water | Merck-Millipore | Milli-Q IQ 7000 |
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