Summary
We geven een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn om een hogedrukcel samen te stellen, hogedruk NMR-experimenten op te zetten en op te nemen en ten slotte zowel piekintensiteit als chemische verschuivingsveranderingen onder druk te analyseren. Deze experimenten kunnen waardevolle inzichten opleveren in de vouwroutes en structurele stabiliteit van eiwitten.
Abstract
Hogedruk is een bekende perturbatiemethode die kan worden gebruikt om bolvormige eiwitten te destabiliseren en eiwitcomplexen op een omkeerbare manier te dissociëren. Hydrostatische druk drijft thermodynamische evenwichten naar de toestand (en) met het lagere molaire volume. Toenemende druk biedt daarom de mogelijkheden om de stabiliteit van bolvormige eiwitten en de oligomerisatie-evenwichten van eiwitcomplexen fijn af te stemmen. Hogedruk NMR-experimenten maken een gedetailleerde karakterisering mogelijk van de factoren die de stabiliteit van bolvormige eiwitten, hun vouwmechanismen en oligomerisatiemechanismen regelen door het fijnstabiliteitsafstemmingsvermogen van drukdoorturbatie te combineren met de locatieresolutie die wordt geboden door oplossing NMR-spectroscopie. Hier presenteren we een protocol om de lokale vouwstabiliteit van een eiwit te onderzoeken via een reeks 2D 1H-15N-experimenten geregistreerd van 1 bar tot 2,5 kbar. De stappen die nodig zijn voor de verwerving en analyse van dergelijke experimenten worden geïllustreerd met gegevens die zijn verkregen over het RRM2-domein van hnRNPA1.
Introduction
Het is al lang erkend dat hoger-energetische, dunbevolkte conformatietoestanden van eiwitten en eiwitcomplexen een sleutelrol spelen in veel biologische routes1,2,3. Dankzij experimenten op basis van onder andere Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5en dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 pulssequenties , is oplossing NMR-spectroscopie naar voren gekomen als een voorkeursmethode voor het karakteriseren van voorbijgaande conformatietoestanden7. Samen met deze experimenten kunnen verstoringen zoals temperatuur, pH of chemische denaturatiemiddelen worden geïntroduceerd om de relatieve populatie van hogere energie conformatiesubstaten te vergroten. Evenzo kunnen eiwitevenwichten ook worden verstoord door hoge hydrostatische druk toe te passen. Afhankelijk van de grootte van de volumeverandering geassocieerd met de overeenkomstige conformatieveranderingen, kan een toename van de druk met een paar honderd tot een paar duizend bar een hogere energietoestand aanzienlijk stabiliseren of ervoor zorgen dat een eiwit zich volledig ontvouwt8,9,10. Eiwit NMR-spectra vertonen doorgaans twee soorten veranderingen met hydrostatische druk: (i) chemische verschuivingsveranderingen en (ii) piekintensiteitsveranderingen. Chemische verschuivingsveranderingen weerspiegelen veranderingen op het eiwitoppervlak-waterinterface en/of lokale compressie van de eiwitstructuur op een snelle tijdschaal (ten opzichte van NMR-tijdschaal)11. Crosspeaks die grote niet-lineaire chemische verschuivingen vertonen, kunnen wijzen op de aanwezigheid van hogere energieconformatietoestanden12,13. Aan de andere kant wijzen piekintensiteitsveranderingen op belangrijke conformatieovergangen op een langzame tijdschaal, zoals veranderingen in gevouwen / ongevouwen toestandspopulaties. De aanwezigheid van vouwtussenproducten of hogere energietoestanden kan worden gedetecteerd aan de hand van grote variaties in de grootte van de volumeverandering bij het uitvouwen, gemeten voor verschillende residuen van een bepaald eiwit14,15,16,17. Op basis van onze ervaring vertonen zelfs kleine eiwitten die meestal worden geclassificeerd als tweestatenmappen niet-uniforme reacties op druk, wat nuttige informatie biedt over hun lokale vouwstabiliteit. Hier wordt een protocol beschreven voor de verwerving en analyse van amidepiekintensiteit en 1H chemische verschuivingen drukafhankelijkheid, met als modeleiwit het geïsoleerde RNA-herkenningsmotief 2 (RRM2) van het heterogene nucleaire ribonucleoproteïne A1 (hnRNPA1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het hier beschreven protocol vereist (i) een hogedrukpomp en -cel met een 2,5 kbar geharde aluminium-geharde zirkoniabuis18,(ii) de software SPARKY19 voor analyse van de NMR-spectra en (iii) een curve-fittingsoftware.
1. Monstervoorbereiding, assemblage van de hogedrukcel en opzetten van de experimenten.
- Keuze van buffer: Gebruik een gelijk mengsel van anionische en kationische buffers, zoals fosfaat en Tris20,21.
OPMERKING: De pKa van anionische buffers zoals fosfaat en MES is geassocieerd met een aanzienlijk reactievolume (d.w.z. het verschil in de partiële molale volumes van het zuur en de geïoniseerde producten). De pH van dergelijke buffers kan daarom aanzienlijk worden beïnvloed door een verandering van druk (~ 0,25-0,5 pH-eenheid / kbar). - Zorg ervoor dat het vereiste monstervolume vergelijkbaar is met dat van een NMR-buis met een standaarddiameter van 3 mm (~ 300μL).
- Introduceer het 15N-gelabelde monster met een glazen pipet in de zirkoniabuis. Zorg ervoor dat het monster aan de onderkant van de buis zit. Compleet met 200 μL minerale olie om te voorkomen dat het monster zich mengt met de transmissievloeistof (bijv. Water). Vul de rest van de buis met transmissievloeistof.
- Plaats een O-ring voor eenmalig gebruik bovenop de zirkoniabuis en schuif de buis in de basis(figuur 1A,B). Sluit vervolgens de buis aan op de hogedruk tetherlijn en draai de basis eerst met de hand aan de cel vast. Pas vervolgens 14,7 Nm koppel toe om lekken bij lagere druk te voorkomen(figuur 1C,D).
- Om de integriteit van de drukcelassemblage te controleren, zet u de buis tot 300 bar buiten de spectrometer onder druk met behulp van celondersteuning en insluitingsvat. Wacht 15 minuten, zet de druk terug op 1 bar en controleer op lekken met een schoon pluisvrij doekje.
- Plaats de buis zonder druk in de spectrometer door de tetherlijn voorzichtig te geleiden. Schuif de buis in de spectrometer totdat u de zitpositie van het monster bereikt(figuur 1E).
- Vergrendel, shim, match en stem de 1H- en 15N-kanalen zoals gewoonlijk af.
OPMERKING: Shims voor hogedruk zirkoniabuizen verschillen sterk van standaard NMR-buizen. Het wordt aanbevolen om de geoptimaliseerde shims op te slaan voor toekomstig gebruik. - Stel een 1H-15N-HSQC of TROSY-HSQC op en neem een referentie-experiment op onder atmosferische omstandigheden (1bar).
2. Opnemen van hogedruk NMR-experimenten
- Verhoog geleidelijk de druk van 1 bar tot 2,5 kbar met stappen van 500 bar om de algehele stabiliteit van het eiwit te testen. Stel het toerental van de drukpomp standaard in op ~18 bar/s. Als de precieze vouw-/uitvouwsnelheden niet bekend zijn, laat u het monster 15-20 minuten na elke stap van 500 bar in evenwicht zijn. Neem een spectrum op bij 2,5 kbar.
- Verlaag de druk geleidelijk terug tot 1 bar met stappen van 500 bar om de omkeerbaarheid van de drukperturbatie te testen. Registreer een ander spectrum bij atmosferische omstandigheden en vergelijk de chemische verschuivingen en piekintensiteiten met die van het referentiespectrum dat eerder in dezelfde omstandigheden is geregistreerd.
OPMERKING: Als de inheemse dwarspijsingen intenser zijn na de drukloop, kan dit erop wijzen dat kleine aggregaten die bij atmosferische druk in de oplossing aanwezig zijn, mogelijk zijn gedissocieerd en op de juiste manier opnieuw zijn gevouwen. Aan de andere kant suggereert een verlies in de intensiteit of significante chemische verschuivingsveranderingen dat het eiwit een niet-omkeerbare misvouw kan ervaren in omstandigheden met hoge druk. - Neem een reeks 2D-experimenten op van 1 bar tot 2,5 kbar elke 500 bar. Het wordt aanbevolen om aanvullende experimenten op te nemen in de buurt van het buigpunt van de vouw- / ontvouwende overgang om de precisie van de pasvorm te verbeteren.
3. Piekintensiteitsveranderingen analyseren
- Verwerk alle spectra en breng de backbone-toewijzing over van het referentiespectrum op 1 bar naar het spectrum dat is opgenomen op 500 bar, en breng de toewijzing vervolgens over van 500 bar naar 1 kbar enzovoort.
OPMERKING: Omdat druk een niet-uniforme verschuiving van 1H en 15N chemische verschuivingen induceert, kopieer dan niet eenvoudigweg de backbone-toewijzing van het ene spectrum naar het volgende. Pas het handmatig aan. - Klik in het Sparky-menu op Peak > Peak List (lt). Klik in het venster Pieklijst op Opties en selecteer de optie om zowel frequenties (ppm) als gegevenshoogteweer te geven. Sla de lijst op die voor elk spectrum is verkregen.
- Kopieer in een curve-aanpassingssoftware de crosspeak-identiteit en piekintensiteitswaarden om de drukwaarden (in bar) als de X-asvariabele en de intensiteit als de Y-asvariabele te hebben.
- Als een volledige of bijna volledige (>80%) ontvouwing wordt waargenomen, pas dan de individuele piekintensiteitsprofielen aan om respectievelijk de vrije energie- en volumeverandering bij het uitvouwen te extraheren, met behulp van een eenvoudig tweetoestandsmodel:
Eq. 1
Waarbij "I" de waargenomen intensiteit is van een crosspeak bij een gegeven druk p en IF de intensiteit van dezelfde crosspeak in een volledig gevouwen toestand. R is de gasconstante, T is de absolute temperatuur, ΔGU0 het standaard Gibbs vrije energieverschil tussen de uitgevouwen en gevouwen toestanden bij atmosferische druk p0 (1 bar), en ΔVu de volumeverandering bij het uitvouwen. Met de druk p in bar en temperatuur T in kelvin, R = 1,987 cal/K, ΔGU0 is in cal/mol en ΔVU in cal/mol/bar. Vermenigvuldig de ΔVU-waarden verkregen uit de pasvorm met 41,84 om om te zetten in ml / mol. ΔVU-waarden liggen meestal in het bereik van -50 tot -150 ml / mol voor bolvormige eiwitten22. Hier worden alle parameters uitgedrukt met betrekking tot de zich ontvouwende reactie, maar kunnen gemakkelijk worden omgezet in vouwreactieparameters (ΔGU0 = -ΔGF0 en ΔVU = -ΔVF).
Eq. 14. Chemische verschuivingsveranderingen analyseren
- Rangschik de kolommen in de software om drukpunten als variabel te hebben en de 1H chemische verschuivingen geëxtraheerd uit Sparky-lijsten als de Y-as.
- Pas de drukafhankelijkheid van de 1H chemische verschuivingen aan op een eenvoudige kwadratische vergelijking:
δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2
Waarbij δ(p) de gemeten 1H chemische verschuiving van een crosspeak bij een gegeven druk p en δ0( p0) de 1H chemische verschuivingen van dezelfde crosspeak in het referentiespectrum geregistreerd bij 1 bar. B1 en B2 vertegenwoordigen de parameters van de eerste en tweede orde, uitgedrukt in respectievelijk ppm/bar en ppm/bar2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol werd gebruikt om de drukafhankelijkheid van RRM2 te onderzoeken, het tweede RNA-herkenningsmotief van hnRNPA1 (residuen 95-106), dat bijna volledig is ontvouwd binnen het bereik van 2,5 kbar (>90%). 1 H-15N spectra werden verzameld bij 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar en 2,5 kbar (Figuur 2). Aangezien geen van de inheemse dwarspingen zichtbaar was boven het geluidsniveau bij 2,5 kbar, werd aan alle overeenkomstige residuen een intensiteitswaarde van 0 bij deze druk toegekend (figuur 3A). Een totaal van 45 individuele drukintensiteitsprofielen werden aangebracht volgens vergelijking 1 (Eq. 1) om de overeenkomstige veranderingen in standaard Gibbs vrije energie (ΔGU0) en volume (ΔVU) geassocieerd met de zich ontvouwende reactie te verkrijgen (Figuur 3A). De berekende ΔVU-waarden varieerden van -41 tot -88 ml/mol en ΔGU0 van 1,8-3,3 kcal/mol. Wanneer de domeinstructuur in kaart wordt gebracht (pdb 1U1R), blijkt dat residuen met de grootste omvang van volumeverandering worden gevonden in de structurele kern van het domein (in rood, in figuur 3B),terwijl die met de kleinste omvang van volumeverandering zich voornamelijk bevinden in de lus die de β-strengen 2 en 3 verbindt, en de lus die β-streng 4 verbindt met de C-terminal helix (in groen, Figuur 3B). De drukafhankelijkheid van de inheemse backbone 1H chemische verschuivingen werd ook geanalyseerd om de mate van samendrukbaarheid en conformatie heterogeniteit van het gevouwen toestand ensemble te onderzoeken. Individuele profielen van 1H chemische verschuivingen als functie van de druk werden aangebracht met behulp van Eq. 2 om plaatsspecifieke lineaire (B1)en niet-lineaire (B2)coëfficiënten te extraheren (Figuur 3C). De residuen met de grootste niet-lineaire coëfficiënten werden meestal gevonden in de structurele kern van het domein (in geel, figuur 3D),terwijl residuen met de kleinste niet-lineaire coëfficiënten zich meestal bevonden in lussen die de verschillende structurele motieven met elkaar verbonden (in blauw, figuur 3D).
Figuur 1: Montage en installatie van hogedrukcellen in de spectrometer. (A-D) De volledige hogedrukcelassemblage vereist een zirkoniabuis, een O-ring voor eenmalig gebruik, de celbasis(A,B). De buis is verbonden met de tetherlijn door de basis aan de cel aan te spannen(C,D). 14,7 Nm koppel is nodig om lekken bij lagere druk te voorkomen. (E)De zirkoniabuis die via de tether-lijn op de Xtreme-60 spuitpomp is aangesloten, wordt in de spectrometer ingebracht totdat de normale zitpositie van het monster is bereikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ontvouwing van het hnRNPA1 RRM2-domein onder druk. 1H-15N HSQC-spectra verzameld bij (A) 1 bar, (B) 1.000 bar, (C) 1.500 bar, (D) en 2.500 bar tonen een volledige ontplooiing van het RRM2-domein onder druk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van RRM2 piekintensiteit en 1H chemische verschuivingen drukafhankelijkheid. (A) Representatieve piekintensiteitsprofielen geregistreerd voor RRM2 tussen 1 en 2.000 bar. Ononderbroken lijnen vertegenwoordigen de pasvorm die is verkregen met Eq. 1 om de overeenkomstige standaard vrije-energie- en volumeveranderingen te berekenen die verband houden met de zich ontvouwende reactie. (B) De bovenste 25% residuen met de grootste gemeten magnitude van ΔVU zijn gemarkeerd met rode bollen op de RRM2-referentiestructuur (pdb 1U1R). Residuen met de kleinste magnitude van ΔVU worden in het groen weergegeven. (C) Representatieve veranderingen van 1H chemische verschuivingen gemeten voor RRM2 tussen 1 bar en 2.000 bar. Ononderbroken lijnen vertegenwoordigen de fit met Eq. 2 om de lineaire (B1)en niet-lineaire (B2)drukcoëfficiënten te berekenen. D)De bovenste 25% residuen met de grootste B2-coëfficiënten worden in geel weergegeven, terwijl die met de kleinste B2-coëfficiënten in blauw worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie beschrijft een protocol dat is geïmplementeerd om eiwit structurele en thermodynamische reacties op drukperturbatie te onderzoeken. De hogedrukexperimenten die hier op RRM2 zijn geregistreerd, tonen aan dat grote variaties in ΔV U-waarden, indicatief voor niet-volledig coöperatieve ontplooiing, kunnen worden gevonden in een relatief klein enkel domein eiwit. Een vergelijkbaar beeld komt naar voren uit de analyse van 1H chemische verschuivingsveranderingen onder druk. Opgemerkt moet worden dat Kalbitzer en collega's hebben aangetoond dat een meer diepgaande analyse van chemische verschuivingsveranderingen kan worden uitgevoerd waarbij de verhouding tussen de niet-lineaire en lineaire coëfficiënten (B2/ B1) wordt gekoppeld aan de verhouding van de verandering in samendrukbaarheid en volume (Δβ / ΔV)23. Deze resultaten benadrukken het vermogen van hoge hydrostatische druk om individuele structurele motieven en subdomeinen te destabiliseren op basis van de lokale thermodynamische stabiliteit en volumeverandering geassocieerd met ontvouwen. Het vastleggen van een eenvoudige set druktitratie-experimenten kan daarom waardevolle informatie opleveren over de vouwmechanismen en subdomeinarchitectuur van een eiwit.
Het hele druksysteem (pomp en regelaar) is relatief compact en kan op een standaard nutswagen worden geïnstalleerd voor gemakkelijke toegang tot de spectrometer(figuur 1). Alle pulssequenties kunnen onder druk zonder modificatie worden gebruikt, inclusief drievoudige resonantie-experimenten. De enige beperking is dat zirkoniabuizen onder druk de gevoeligheid van NMR-experimenten met bijna 50% verminderen in vergelijking met een standaard NMR-buis met een diameter van 3 mm. Dit kan een uitdaging vormen voor eiwitmonsters die niet tot een hoog genoeg niveau kunnen worden geconcentreerd. In vergelijking met andere perturbatiemethoden zoals temperatuur of chemische denaturatiemiddelen, heeft hydrostatische druk het voordeel dat het, op enkele uitzonderingen na, volledig omkeerbaar is. Omdat druk de dissociatie van eiwitcomplexen bevordert, is er bijvoorbeeld zeer weinig risico op monsteraggregatie, een probleem dat vaak voorkomt bij hoge temperaturen.
Hoewel hydrostatische druk een krachtig hulpmiddel is voor het bestuderen van eiwitstabiliteit, is het belangrijk om in gedachten te houden dat er geen perfecte methode van verstoring is. Elk van hen benadrukt de specificiteit van een eiwitvrij energielandschap op een andere manier. Als bijvoorbeeld twee conformatietoestanden hetzelfde molaire volume hebben, zal een toename van de hydrostatische druk hun relatieve populaties niet significant veranderen. Evenzo, als twee conformatietoestanden een vergelijkbaar blootgesteld oppervlak hebben, zou het toevoegen van chemische denaturerende stoffen niet noodzakelijkerwijs de relatieve bevolking van de ene toestand verhogen in vergelijking met de andere. Idealiter moeten verschillende perturbatiemethoden worden gecombineerd om een volledige beschrijving van een eiwitvrij energielandschap te verkrijgen15,24. Ten slotte moet worden opgemerkt dat hoewel het manuscript gericht is op de drukafhankelijkheid van intensiteit en chemische verschuivingen van reeksen 2D 1H-15N-experimenten gemeten bij evenwicht, een breed scala aan NMR-experimenten kan worden gekoppeld aan drukperturbatie om verschillende aspecten van de stabiliteit, het vouwmechanisme en de conformatiedynamiek van eiwitten en eiwitcomplexen te onderzoeken20, 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben het manuscript gelezen en goedgekeurd. Zij verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Roy J. Carver Charitable Trust aan Julien Roche. Wij danken J. D. Levengood en B. S. Tolbert voor het verzorgen van het RRM2-monster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R.
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. Sparky 3. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
