Summary
Nous fournissons une description détaillée des étapes nécessaires à l’assemblage d’une cellule haute pression, à la mise en place et à l’enregistrement d’expériences de RMN à haute pression, et enfin à l’analyse des changements d’intensité maximale et de décalage chimique sous pression. Ces expériences peuvent fournir des informations précieuses sur les voies de repliement et la stabilité structurelle des protéines.
Abstract
La haute pression est une méthode de perturbation bien connue qui peut être utilisée pour déstabiliser les protéines globulaires et dissocier les complexes protéiques de manière réversible. La pression hydrostatique entraîne des équilibres thermodynamiques vers le(s) état(s) avec le volume molaire inférieur. L’augmentation de la pression offre donc la possibilité d’ajuster finement la stabilité des protéines globulaires et les équilibres d’oligomérisation des complexes protéiques. Les expériences de RMN à haute pression permettent une caractérisation détaillée des facteurs régissant la stabilité des protéines globulaires, leurs mécanismes de repliement et leurs mécanismes d’oligomérisation en combinant la capacité de réglage fin de la stabilité de la perturbation de la pression et la résolution du site offerte par la spectroscopie RMN en solution. Nous présentons ici un protocole pour sonder la stabilité de repliement local d’une protéine via un ensemble d’expériences 2D 1H-15N enregistrées de 1 bar à 2,5 kbar. Les étapes requises pour l’acquisition et l’analyse de telles expériences sont illustrées par les données acquises sur le domaine RRM2 de hnRNPA1.
Introduction
Il est reconnu depuis longtemps que les états conformationnels de protéines et de complexes protéiques à haute énergie et peu peuplés jouent un rôle clé dans de nombreuses voies biologiques1,2,3. Grâce à des expériences basées sur carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5et DEST(SDET)6 séquences d’impulsions (entre autres), la spectroscopie RMN en solution est apparue comme une méthode de choix pour caractériser les états conformationnels transitoires7. Parallèlement à ces expériences, des perturbations telles que la température, le pH ou les dénaturants chimiques peuvent être introduites pour augmenter la population relative de sous-états conformationnels d’énergie plus élevée. De même, les équilibres protéiques peuvent également être perturbés par l’application d’une pression hydrostatique élevée. Selon l’ampleur du changement de volume associé aux changements conformationnels correspondants, une augmentation de pression de quelques centaines à quelques milliers de bars peut stabiliser de manière significative un état d’énergie plus élevé ou provoquer le déploiement complet d’une protéine8,9,10. Les spectres rmN des protéines présentent généralement deux types de changements avec la pression hydrostatique: (i) les changements de décalage chimique et (ii) les changements d’intensité de pointe. Les changements de décalage chimique reflètent les changements à l’interface protéine-eau de surface et/ou la compression locale de la structure protéique sur une échelle de temps rapide (par rapport à l’échelle de temps RMN)11. Les croisements présentant une grande dépendance de pression de décalage chimique non linéaire peuvent indiquer la présence d’états conformationnels d’énergie plus élevés12,13. D’autre part, les changements d’intensité maximale indiquent des transitions conformationnelles majeures sur une échelle de temps lente, telles que des changements dans les populations d’États repliés / dépliés. La présence d’intermédiaires de repliement ou d’états d’énergie plus élevés peut être détectée à partir de grandes variations de l’ampleur du changement de volume lors du dépliage mesurée pour différents résidusd’uneprotéine donnée14,15,16,17. D’après notre expérience, même les petites protéines qui sont généralement classées comme des dossiers à deux états présentent des réponses non uniformes à la pression, ce qui fournit des informations utiles sur leur stabilité de repliement local. Décrit ici est un protocole pour l’acquisition et l’analyse de l’intensité maximale de l’amideet de la dépendance à la pression des changements chimiques 1 H, en utilisant comme protéine modèle le motif de reconnaissance d’ARN isolé 2 (RRM2) de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 (hnRNPA1).
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Protocol
REMARQUE: Le protocole décrit ici nécessite (i) une pompe et une cellule haute pression avec un tube en zircone trempé en aluminium de 2,5 kbar18,(ii) le logiciel SPARKY19 pour l’analyse des spectres RMN, et (iii) un logiciel de raccord de courbe.
1. Préparation de l’échantillon, assemblage de la cellule haute pression et mise en place des expériences.
- Choix du tampon: Utilisez un mélange égal de tampons anioniques et cationiques, tels que le phosphate et Tris20,21.
REMARQUE: Le pKa des tampons anioniques tels que le phosphate et le MES est associé à un volume de réaction important (c.-à-d. la différence entre les volumes molaux partiels de l’acide et des produits ionisés). Le pH de ces tampons peut donc être significativement affecté par un changement de pression (~0,25-0,5 unité de pH/kbar). - Assurez-vous que le volume d’échantillon requis est similaire à celui d’un tube RMN standard de 3 mm de diamètre (~300 μL).
- Introduisez l’échantillon marqué 15N avec une pipette en verre dans le tube en zircone. Assurez-vous que l’échantillon s’esso bien au bas du tube. Complétez avec 200 μL d’huile minérale pour empêcher l’échantillon de se mélanger au liquide de transmission (p. ex. eau). Remplissez le reste du tube avec du liquide de transmission.
- Placez un joint torique à usage unique sur le dessus du tube en zircone et faites glisser le tube dans la base (Figure 1A, B). Ensuite, connectez le tube à la ligne d’attache haute pression et serrez la base à la cellule d’abord à la main. Ensuite, appliquez 14,7 Nm de couple pour éviter les fuites à basse pression (Figure 1C, D).
- Pour vérifier l’intégrité de l’ensemble de la cellule de pression, pressuriser le tube jusqu’à 300 bars à l’extérieur du spectromètre à l’aide du support de cellule et du récipient de confinement. Attendez 15 minutes, réinitialisez la pression à 1 bar et vérifiez les fuites avec une lingette propre non pelucheuse.
- Insérez le tube non pressurisé dans le spectromètre en guidant soigneusement la ligne d’attache. Faites glisser le tube dans le spectromètre jusqu’à atteindre la position assise de l’échantillon (Figure 1E).
- Verrouillez, calez, assortissez et réglez les canaux 1H et 15N comme d’habitude.
REMARQUE: Les cales pour tubes en zircone haute pression sont très différentes des tubes RMN standard. Il est recommandé de sauvegarder les cales optimisées pour une utilisation ultérieure. - Mettez en place un 1H-15N-HSQC ou TROSY-HSQC et enregistrez une expérience de référence dans des conditions atmosphériques (1 bar).
2. Enregistrement d’expériences de RMN à haute pression
- Augmentez progressivement la pression de 1 bar à 2,5 kbar avec des incréments de 500 bar pour tester la stabilité globale de la protéine. Réglez la vitesse de la pompe à pression par défaut à ~18 bar/s. Si les taux de pliage/dépliage précis ne sont pas connus, laissez l’échantillon s’équilibrer 15 à 20 minutes après chaque incrément de 500 bars. Enregistrez un spectre à 2,5 kbar.
- Diminuez progressivement la pression à 1 bar avec des pas de 500 bar pour tester la réversibilité de la perturbation de pression. Enregistrez un autre spectre aux conditions atmosphériques et comparez les décalages chimiques et les intensités de crête avec ceux du spectre de référence précédemment enregistrés dans les mêmes conditions.
REMARQUE: Si les croisements natifs sont plus intenses après l’exécution de la pression, cela peut indiquer que de petits agrégats présents en solution à la pression atmosphérique peuvent s’être dissociés et correctement repliés. D’autre part, une perte d’intensité ou des changements de changement chimique importants suggèrent que la protéine peut subir un mauvais repliement non réversible dans des conditions de haute pression. - Enregistrez une série d’expériences 2D de 1 bar à 2,5 kbar tous les 500 bar. Il est recommandé d’enregistrer des expériences supplémentaires près du point d’inflexion de la transition pliage/dépliage pour améliorer la précision de l’ajustement.
3. Analyse des changements d’intensité maximale
- Traiter tous les spectres et transférer l’affectation de l’épine dorsale du spectre de référence à 1 bar au spectre enregistré à 500 bar, puis transférer l’affectation de 500 bar à 1 kbar et ainsi de suite.
REMARQUE: Étant donné que la pression induit un décalage non uniforme de 1H et 15N décalages chimiques, ne copiez pas simplement l’affectation de l’épine dorsale d’un spectre à l’autre. Ajustez-le manuellement. - Dans le menu Sparky, cliquez sur Peak > Peak List (lt). Dans la fenêtre Liste des pics, cliquez sur Options et sélectionnez l’option pour afficher à la fois fréquences (ppm) et hauteur des données. Enregistrez la liste obtenue pour chaque spectre.
- Dans un logiciel d’ajustement de courbe, copiez les valeurs d’identité de croisement et d’intensité maximale pour avoir les valeurs de pression (en bar) comme variable de l’axe X et l’intensité comme variable de l’axe Y.
- Si un dépliage complet ou presque complet (>80%) est observé, adaptez les profils d’intensité de crête individuels pour extraire l’énergie libre et le changement de volume lors du dépliage, respectivement, à l’aide d’un modèle simple à deux états:
Eq. 1
Où, « I » est l’intensité observée d’un crosspeak à une pression donnée p et IF est l’intensité du même crosspeak dans un état complètement plié. R est la constante de gaz, T est la température absolue, ΔGU0 la différence d’énergie libre de Gibbs standard entre les états déplié et plié à la pression atmosphérique p0 (1 bar), et ΔVu le changement de volume lors du dépliage. Avec la pression p en bar et la température T en kelvin, R = 1,987 cal/K, ΔGU0 est en cal/mol et ΔVU est en cal/mol/bar. Multipliez les valeurs ΔVU obtenues à partir de l’ajustement par 41,84 pour les convertir en mL/mol. Les valeurs ΔVU sont généralement comprises entre -50 et -150 mL/mol pour les protéines globulaires22. Ici, tous les paramètres sont exprimés en ce qui concerne la réaction qui se déroule mais peuvent facilement être convertis en paramètres de réaction de pliage (ΔGU0 = -ΔGF0 et ΔVU = -ΔVF).
Eq. 14. Analyse des changements de changement chimique
- Organisez les colonnes dans le logiciel afin d’avoir des points de pression variables et les décalages chimiques 1H extraits des listes Sparky comme l’axe Y.
- Adapter la dépendance à la pression des changements chimiques 1H à une équation quadratique simple:
δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2
Où, δ(p) est le décalage chimique mesuré de 1H d’un crosspeak à une pression donnée p et δ0(p0) les décalages chimiques 1H du même crosspeak dans le spectre de référence enregistré à 1 bar. B1 et B2 représentent les paramètres de premier et de deuxième ordre exprimés en ppm/bar et ppm/bar2, respectivement.
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Representative Results
Le protocole décrit ici a été utilisé pour sonder la dépendance à la pression de RRM2, le deuxième motif de reconnaissance d’ARN de hnRNPA1 (résidus 95-106), qui est presque complètement déplié dans la plage de 2,5 kbar (>90%). 1 Les spectresH-15N ont été collectés à 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar et 2,5 kbar(Figure 2). Étant donné qu’aucun des croisements natifs n’était visible au-dessus du niveau de bruit à 2,5 kbar, tous les résidus correspondants se sont vu attribuer une valeur d’intensité de 0 à cette pression(figure 3A). Au total, 45 profils individuels d’intensité de pression ont été montés selon l’équation 1 (Eq. 1) pour obtenir les changements correspondants dans l’énergie libre de Gibbs standard (ΔGU0)et le volume (ΔVU)associés à la réaction de déroulement(Figure 3A). Les valeurs ΔVU calculées allaient de -41 à -88 mL/mol et ΔGU0 de 1,8 à 3,3 kcal/mol. Lorsqu’ils sont cartographiés sur la structure du domaine (pdb 1U1R), il apparaît que les résidus ayant la plus grande amplitude de changement de volume se trouvent dans le noyau structurel du domaine (en rouge, dans la figure 3B), tandis que ceux ayant la plus petite amplitude de changement de volume sont principalement situés dans la boucle reliant les brins β 2 et 3, et la boucle reliant β brin 4 à l’hélice terminale C (en vert, Figure 3B). La dépendance à la pression des changements chimiques de l’épine dorsale native 1H a également été analysée pour sonder le degré de compressibilité et d’hétérogénéité conformationnelle de l’ensemble d’état plié. Des profils individuels de décalages chimiques 1H en fonction de la pression ont été ajustés à l’aide de l’Eq. 2 afin d’extraire des coefficients linéaires (B1)et non linéaires (B2)spécifiques au site(Figure 3C). Les résidus avec les plus grands coefficients non linéaires se trouvaient principalement dans le noyau structurel du domaine (en jaune, Figure 3D),tandis que les résidus avec les plus petits coefficients non linéaires étaient principalement situés dans des boucles reliant les différents motifs structurels (en bleu, Figure 3D).
Figure 1: Assemblage et installation de la cellule haute pression dans le spectromètre. (A-D) L’assemblage complet de la cellule haute pression nécessite un tube en zircone, un joint torique à usage unique, la base cellulaire(A, B). Le tube est relié à la ligne d’attache en resserrant la base à la cellule (C, D). Un couple de 14,7 Nm est nécessaire pour éviter les fuites à basse pression. (E) Le tube en zircone relié à la pompe à seringue Xtreme-60 via la ligne d’attache est introduit dans le spectromètre jusqu’à atteindre la position assise normale de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Dépliage du domaine hnRNPA1 RRM2 sous pression. 1H-15 N HSQC spectres collectés à (A) 1 bar, (B) 1 000 bar, (C) 1 500 bar, (D) et 2 500 bar montrent un déploiement complet du domaine RRM2 sous pression. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Analyse de l’intensité de crête RRM2 et de la dépendance chimique des décalages chimiques 1H. (A) Profils représentatifs de l’intensité maximale enregistrés pour le RRM2 entre 1 et 2 000 bar. Les lignes pleines représentent l’ajustement obtenu à l’aide de l’Eq. 1 pour calculer les changements d’énergie libre et de volume standard correspondants associés à la réaction de dépliage. (B) Les 25 % supérieurs des résidus ayant la plus grande magnitude mesurée de ΔVU sont mis en évidence par des sphères rouges sur la structure de référence RRM2 (pdb 1U1R). Les résidus de la plus petite magnitude de ΔVU sont indiqués en vert. (C) Changements représentatifs des décalages chimiques de 1H mesurés pour le RRM2 entre 1 bar et 2 000 bar. Les lignes pleines représentent l’ajustement à Eq. 2 pour calculer les coefficients de pression linéaires (B1)et non linéaires (B2). (D) Les 25 % supérieurs des résidus ayant les coefficients B2 les plus élevés sont indiqués en jaune, tandis que ceux ayant les plus petits coefficients B2 sont indiqués en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cette étude détaille un protocole mis en œuvre pour sonder les réponses structurelles et thermodynamiques des protéines à la perturbation de la pression. Les expériences à haute pression enregistrées ici sur RRM2 démontrent que de grandes variations dans les valeurs ΔVU, révélatrices d’un déploiement non entièrement coopératif, peuvent être trouvées dans une protéine relativement petite à domaine unique. Une image similaire se dégage de l’analyse des changements de décalage chimique 1H sous pression. Il convient de noter que Kalbitzer et ses collègues ont démontré qu’une analyse plus approfondie des changements de décalage chimique peut être effectuée reliant le rapport entre les coefficients non linéaires et linéaires (B2/ B1) avec le rapport du changement de compressibilité et de volume (Δβ / ΔV)23. Ces résultats mettent en évidence la capacité d’une pression hydrostatique élevée à déstabiliser des motifs structurels individuels et des sous-domaines en fonction de la stabilité thermodynamique locale et du changement de volume associé au dépliage. L’enregistrement d’un simple ensemble d’expériences de titrage sous pression peut donc fournir des informations précieuses concernant les mécanismes de repliement et l’architecture de sous-domaine d’une protéine.
L’ensemble du système de pression (pompe et contrôleur) est relativement compact et peut être installé sur un chariot utilitaire standard pour un accès facile au spectromètre(Figure 1). Toutes les séquences d’impulsions peuvent être utilisées sous pression sans modification, y compris les expériences de triple résonance. La seule limite est que les tubes en zircone à pression nominale réduisent la sensibilité des expériences rmneuses de près de 50% par rapport à un tube RMN standard de 3 mm de diamètre. Cela peut présenter un défi pour les échantillons de protéines qui ne peuvent pas être concentrés à un niveau suffisamment élevé. Par rapport à d’autres méthodes de perturbation telles que la température ou les dénaturants chimiques, la pression hydrostatique présente l’avantage d’être, à de très rares exceptions près, entièrement réversible. Parce que la pression favorise la dissociation des complexes protéiques, il y a, par exemple, très peu de risque d’agrégation d’échantillons, un problème souvent rencontré avec des températures élevées.
Bien que la pression hydrostatique soit un outil puissant pour étudier la stabilité des protéines, il est important de garder à l’esprit qu’il n’existe pas de méthode parfaite de perturbation. Chacun d’eux met en évidence la spécificité d’un paysage d’énergie sans protéines d’une manière différente. Par exemple, si deux états conformationnels ont le même volume molaire, une augmentation de la pression hydrostatique ne modifiera pas de manière significative leurs populations relatives. De même, si deux états conformationnels ont une surface exposée similaire, l’ajout de dénaturants chimiques n’augmenterait pas nécessairement la population relative d’un État par rapport à l’autre. Idéalement, différentes méthodes de perturbation devraient être combinées pour obtenir une description complète d’un paysage d’énergie sansprotéines 15,24. Enfin, il convient de noter que bien que le manuscrit se concentre sur la dépendance à la pression de l’intensité et des changements chimiques à partir de séries d’expériences 2D 1H-15 N mesurées à l’équilibre, un large éventail d’expériences RMN peuvent être couplées à la perturbation de la pression pour sonder différents aspects de la stabilité, du mécanisme de repliement et de la dynamique conformationnelle des protéines et des complexes protéiques20, 25.
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Disclosures
Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit. Ils ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds du Roy J. Carver Charitable Trust à Julien Roche. Nous remercions J. D. Levengood et B. S. Tolbert d’avoir aimablement fourni l’échantillon RRM2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
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