Summary
高圧セルの組み立て、高圧NMR実験の設定と記録に必要なステップの詳細な説明を提供し、最後に圧力下でのピーク強度と化学シフトの両方の変化を分析します。これらの実験は、タンパク質の折りたたみ経路と構造安定性に関する貴重な洞察を提供することができます。
Abstract
高圧は、球状タンパク質を不安定化させ、タンパク質複合体を可逆的に解化するために使用できる、よく知られた摂動法です。静水圧は、熱力学的平衡を、より低いモル体積の状態に向かって駆動します。圧力の上昇は、したがって、球状タンパク質の安定性とタンパク質複合体のオリゴマー化平衡を細かく調整する機会を提供します。高圧NMR実験は、NMR分光法の溶液によって提供される圧力摂動の微細な安定性調整能力と部位分解能を組み合わせることにより、球状タンパク質の安定性、その折りたたみ機構、およびオリゴマー化メカニズムを支配する因子の詳細な特徴付けが可能になります。ここでは、1バーから2.5kbarまで記録された2D 1H-15N実験のセットを介してタンパク質の局所的な折りたたみ安定性をプローブするプロトコルを提示する。このような実験の取得および分析に必要なステップは、hnRNPA1のRRM2ドメイン上で取得したデータと共に示されている。
Introduction
タンパク質およびタンパク質複合体の高エネルギー、まばらな立体構造状態が、多くの生物学的経路1、2、3において重要な役割を果たすことが長い間認識されてきた。Carr-パーセル-Meiboom-Gill (CPMG)4、化学交換飽和伝達(CEST)5、および暗い状態交換飽和伝達(DEST)6パルス配列(とりわけ)に基づく実験のおかげで、溶液NMR分光法は、一過性の立体状態を特徴付けるための選択肢として出現した7。これらの実験に加えて、温度、pH、または化学変性物質などの摂動を導入して、より高いエネルギー立体構造サブステイトの相対的集団を増加させることができる。同様に、タンパク質平衡は、高い静水圧を加えることによっても摂動することができる。対応する立体構造変化に伴う体積変化の大きさに応じて、数百から数千のバーの圧力の増加は、より高いエネルギー状態を有意に安定させ、またはタンパク質が8、9、10を完全に展開する原因となる。タンパク質NMRスペクトルは、通常、静水圧で2種類の変化を表示する:(i)化学シフト変化および(ii)ピーク強度変化。化学シフトの変化は、タンパク質表面水界面における変化および/またはタンパク質構造の局所圧縮を速い時間スケール(NMR時間スケールに対する)11に反映する。大きな非線形化学シフト圧力依存性を示すクロスピークは、より高いエネルギー立体構造状態12,13の存在を示すことができる。一方、ピーク強度の変化は、折り畳まれた状態/展開された状態の人口の変化など、遅い時間スケールでの主要な立体構造遷移を指します。フォールディング中間体または高いエネルギー状態の存在は、所与のタンパク質14、15、16、17の異なる残基について測定された展開時の体積変化の大きさの大きな変動から検出することができる。我々の経験に基づいて、通常2状態フォルダとして分類される小さなタンパク質でさえ、圧力に対する不均一な応答を示し、局所的な折りたたみの安定性に関する有用な情報を提供します。ここで説明するアミドピーク強度および1H化学シフト圧力依存の取得及び分析のためのプロトコルは、異種核リボヌクレオプロテインA1(hnRNPA1)の単離されたRNA認識モチーフ2(RRM2)をモデルタンパク質として用いる。
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Protocol
注:ここで説明するプロトコルは、(i)2.5 kbarと2.5 kbarの高圧ポンプとセルを定め、(ii)NMRスペクトルの分析用のソフトウェアSPARKY19、 および(iii)曲線フィッティングソフトウェアを必要とする。
1.サンプル調製、高圧セルの組み立て、および実験を設定する。
- バッファの選択: リン酸塩とトリス20,21などの陰イオンバッファーとカチオンバッファーの等しい混合を使用します。
注:リン酸やMESなどのアニオン性緩衝液のpKaは、実質的な反応量(すなわち、酸とイオン化産物の部分モル量の差)に関連付けられます。したがって、このようなバッファーの pH は圧力の変化 (〜0.25-0.5 pH 単位/kbar) によって大きな影響を受ける可能性があります。 - 必要なサンプル量が、標準の直径3mmのNMRチューブ(〜300μL)と同様であることを確認してください。
- ガラスピペットを含む 15個のN標識サンプルをジルコニアチューブに導入します。チューブの下部にあるサンプルシートを確認します。200 μLのミネラルオイルを完備し、透過液(例えば、水)と混合するのを防ぎます。チューブの残りの部分を液体を透過して充填します。
- ジルコニアチューブの上に使い捨てのOリングを置き、チューブをベースにスライドさせます(図1A、B)。次に、チューブを高圧テザーラインに接続し、最初に手でセルにベースを締めます。次に、14.7 Nmのトルクを適用して、低圧での漏れを防ぎます(図1C、D)。
- 圧力セルアセンブリの完全性を確認するには、細胞支持体と格納容器を使用して、分光計の外に最大300バーを加圧します。15分待ってから、圧力を1バーにリセットし、きれいな糸くずのないワイプで漏れをチェックします。
- テザーラインを慎重に導いて、無加圧チューブを分光器に挿入します。サンプルの座っている位置に到達するまで、分光計でチューブをスライドさせます(図1E)。
- 通常どおり 1 H と15N チャネルをロック、シム、マッチ、および調整します。
注:高圧評価ジルコニアチューブ用シムは、標準のNMRチューブとは大きく異なります。今後の使用のために最適化されたシムを保存することをお勧めします。 - 1H-15N-HSQC または TROSY-HSQC を設定し、大気条件での参照実験を記録します (1bar)。
2. 高圧NMR実験の記録
- タンパク質の全体的な安定性をテストするために、徐々に1バーから2.5 kbarに500バーインクリメントの圧力を増加させます。圧力ポンプの速度を、デフォルトで~18 bar/sに設定します。正確な折り畳み/展開速度が不明な場合は、サンプルが各500バーの増分の後に15〜20分を平衡にします。2.5 kbar でスペクトルを記録します。
- 圧力の摂動の可逆性をテストするために、500棒ステップで1バーに戻って圧力を徐々に減らします。大気条件で別のスペクトルを記録し、化学シフトとピーク強度を、以前に同じ条件で記録された基準スペクトルの基準スペクトルと比較します。
注: 圧力が発生した後にネイティブのクロスピークがより強い場合、大気圧で溶液中に存在する小さな凝集体が解別され、適切に折り直された可能性があります。一方、強度の損失または有意な化学シフト変化は、タンパク質が高圧条件で非可逆的なミスフォールディングを経験する可能性があることを示唆している。 - 1 つの棒から 2.5 kbar までの一連の 2D 実験を 500 bar ごとに記録します。フィットの精度を向上させるために、折り畳み/展開遷移の変曲点付近で追加の実験を記録することをお勧めします。
3. ピーク強度の変化を分析する
- すべてのスペクトルを処理し、1バーの基準スペクトルから500バーで記録されたスペクトルにバックボーンの割り当てを転送し、500バーから1kbarなどに割り当てを転送します。
注:圧力は1Hと15Nの化学シフトの不均一なシフトを誘発するので、単に1つのスペクトルから次のスペクトルにバックボーンの割り当てをコピーしないでください。手動で調整します。 - スパーキーメニューでピーク >ピークリスト (lt)をクリックします。ピーク リスト ウィンドウで 、オプション をクリックし、 周波数(ppm) と データ高さの両方を表示するオプションを選択します。各スペクトルに対して取得したリストを保存します。
- カーブフィッティングソフトウェアでは、クロスピークの同一性値とピーク強度の値をコピーして、圧力値(バー)をX軸変数に、強度をY軸変数として使用します。
- 完全またはほぼ完全な (>80%) 展開が観察された場合は、個々のピーク強度プロファイルをフィットして、単純な 2 状態モデルを使用して、展開時にそれぞれ自由エネルギーと体積変化を抽出します。
Eq. 1
ここで、「I」は、与えられた圧力pでのクロスピークの観測強度であり、IFは完全に折り畳まれた状態で同じクロスピークの強度である。Rはガス定数、Tは絶対温度、ΔGU0は大気圧p0(1バー)で展開状態と折り畳まれた状態の間の標準的なギブス自由エネルギー差、展開時の体積変化をΔVuとする。圧力pをバーで、温度Tをケルビンに、R = 1.987 cal/K、ΔGU0はカル/モル、ΔVUはカル/モル/バーに入っています。適合から得られたΔVU値を41.84で乗算してmL/molに変換するΔVU値は、典型的には球状タンパク質22に対して-50〜-150 mL/molの範囲である。ここでは、展開反応に関して全てのパラメータが表現されますが、折りたたみ反応パラメータに簡単に変換することができます(ΔGU0 = -ΔGF0およびΔVU = -ΔVF)。
Eq. 14. 化学シフト変化の解析
- 圧力点を可変値として、1H 化学シフトを Y軸としてスパーキーリストから抽出するために、ソフトウェアの列を整列します。
- 1H化学シフトの圧力依存性を単純な二次方程式に適合させます。
δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq.
ここで、δ(p)は、1バーで記録された基準スペクトルにおける同じクロスピークの1H化学シフトをδ 0(p0)でのクロスピークの測定1H化学シフトである。B1と B2は、それぞれ ppm/bar および ppm/bar2で表される 1 番目と 2 番目のパラメーターを表します。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、2.5kbar範囲(>90%)内でほぼ完全に展開されたhnRNPA1(残基95〜106)の第2RNA認識モチーフであるRRM2の圧力依存性をプローブするために使用した。1H-15Nスペクトルは、1バー、500バー、750バー、1 kbar、1.5 kbar、2 kbar、および2.5kbarで収集した(図2)。2.5 kbarのノイズレベルより上に現れたクロスピークはどれも見えなかったので、対応するすべての残基は、この圧力で0の強度値を帰属させた(図3A)。式1(Eq. 1)に従って合計45個の個別圧力強度プロファイルを取り付け、展開反応に関連する標準的なGibbs自由エネルギー(ΔGU0)および体積(ΔVU)の対応する変化を得た(図3A)。計算されたΔVU値は、-41から-88 mL/mol、ΔGU0の範囲が1.8〜3.3kcal/molでした。ドメイン構造(pdb 1U1R)にマッピングすると、体積変化の大きさが最も大きい残留物がドメイン構造コア内(図3Bでは赤)に見つかるのに対し、体積変化の最も小さい部分は主にβ鎖2と3を結ぶループに位置し、ループβストランド4をC端子ヘリクス(緑色、緑)に接続しているループ(緑色、体積変化) 図 3B)。天然骨格1H化学シフトの圧力依存性も解析し、折り畳まれた状態アンサンブルの圧縮性および立体構造の不均一性の程度を調査した。圧力の関数として1H化学シフトの個々のプロファイルは、部位特異的な線形(B1)および非線形(B2)係数を抽出するためにEq.2を用いて適合した(図3C)。非線形係数が最も大きい残基は、主にドメインの構造コア(黄色、図3D)に見られ、非線形係数が最小の残基は、異なる構造モチーフを接続するループ内に位置していました(青色、図3D)。
図1:分光器に高圧セルアセンブリと設置(A-D)完全高圧細胞アセンブリには、ジルコニアチューブ、単回使用Oリング、セルベース(A,B)が必要です。チューブは、セル(C,D)にベースを締めることによってテザーラインに接続されています。14.7 Nmのトルクは、低圧での漏れを防ぐために必要です。(E)テザーラインを介してXtreme-60シリンジポンプに接続されたジルコニアチューブは、通常のサンプルの座り位置に到達するまで分光計に導入されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:圧力下でhnRNPA1 RRM2ドメインの展開.1H-15N HSQCスペクトルを(A)1バーで収集し、(B)1,000バー、(C)1,500 bar、(D)および2,500バーは、圧力下でRRM2ドメインの完全な展開を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RRM2ピーク強度と1H化学シフト圧力依存性の解析(A)1から2,000の棒の間のRRM2のために記録される代表的なピーク強度のプロフィール。実線は、展開反応に関連する対応する標準自由エネルギーおよび体積変化を計算するために Eq. 1 を使用して得られた適合度を表します。(B) 測定された大きさが最大の残基の上位25%が、RRM2参照構造(pdb 1U1R)上の赤い球で強調表示されます。ΔVUの最も小さい大きさの残基は緑色で示されています。(C) 1バーと2,000棒の間のRRM2のために測定された1H化学シフトの代表変化。実線は、線形(B1)および非線形(B2)圧力係数を計算するEq.2に適合を表します。(D)B2係数が最も大きい残基の上位25%は黄色で示され、B2係数が最も小さいものは青色で示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、圧力摂動に対するタンパク質構造および熱力学応答をプローブするために実装されたプロトコルを詳述する。ここでRRM2に記録された高圧実験は、非完全に協力的な展開を示すΔVU値の大きな変動が、比較的小さな単一ドメインタンパク質に見つけることができることを示しています。同様の画像は、圧力下での1H化学シフト変化の分析から浮かび上がる。なお、カルビッツァーと同僚は、化学シフト変化のより詳細な分析を行うことができることを実証した方が、非線形係数と線形係数(B2/B1)と圧縮率と体積の変化の比率(Δβ/ΔV)23との間の比率をリンクすることができる。これらの結果は、局所熱力学的安定性と展開に関連する体積変化に基づいて、個々の構造モチーフおよびサブドメインを不安定にする高静水圧の能力を強調する。単純な圧力滴定実験を記録することで、タンパク質の折りたたみ機構とサブドメインアーキテクチャに関する貴重な情報を提供できます。
全体の圧力システム(ポンプおよびコントローラー)は比較的コンパクトで、分光計に簡単にアクセスするための標準的なユーティリティカートに取り付けることができます(図1)。すべてのパルスシーケンスは、三重共鳴実験を含む、変更せずに圧力下で使用することができます。唯一の制限は、圧力評価ジルコニアチューブは、標準の3mm直径NMRチューブと比較して、NMR実験の感度をほぼ50%低下させることです。これは、高いレベルに集中できないタンパク質サンプルに対する課題を提示する可能性があります。温度や化学変性物質などの他の摂動方法と比較して、静水圧は、非常に少数の例外を除いて、完全に可逆性であるという利点を提示する。圧力はタンパク質複合体の解離を好むため、例えば、サンプル凝集のリスクが非常に少なく、高温でしばしば遭遇する問題がある。
静水圧はタンパク質の安定性を研究するための強力なツールですが、摂動の完璧な方法がないことを念頭に置いておく必要があります。それぞれのタンパク質自由エネルギーの景観の特異性を異なる方法で強調しています。たとえば、2 つの立体構造状態が同じモル体積を持つ場合、静水圧の上昇は、その相対的な集団を大きく変えるわけではありません。同様に、2つの立体構造状態が同様の露出表面積を有する場合、化学変性剤を添加しても、一方の状態の相対的な集団が他の状態と比較して必ずしも増加するとは限らない。理想的には、異なる摂動法を組み合わせて、タンパク質自由エネルギー景観15,24の完全な記述を得るべきである。最後に、平衡状態で測定された一連の2D 1H-15N実験からの強度と化学シフトの圧力依存性に焦点を当てた原稿であるが、幅広いNMR実験は、安定性の異なる側面、折りたたみ機構、およびタンパク質およびタンパク質複合体の立体構造ダイナミクスをプローブするために圧力摂動に結合することができることに留意すべきである。 25.
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Disclosures
すべての著者は原稿を読んで承認しました。彼らは利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、ロイ・J・カーバー慈善信託からジュリアン・ロシュへの資金によって支えられました。RrM2サンプルを親切に提供してくれたJ・D・レヴェングッドとB.S.トルバートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
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