Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62701
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemistry, Iowa State University, 2Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University

Summary

אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים הנדרשים כדי להרכיב תא בלחץ גבוה, להגדיר ולתעד ניסויי NMR בלחץ גבוה, ולבסוף לנתח הן את עוצמת השיא והן שינויים במשמרות כימיות תחת לחץ. ניסויים אלה יכולים לספק תובנות חשובות על המסלולים המתקפלים והיציבות המבנית של חלבונים.

Abstract

לחץ גבוה הוא שיטת סוטה ידועה שניתן להשתמש בה כדי לערער חלבונים כדוריים ולנתק מתחמי חלבון באופן הפיך. לחץ הידרוסטטי מניע שיווי משקל תרמודינמי לכיוון המדינה(ים) עם נפח הטוחנת התחתונה. לחץ גובר מציע, אם כן, את ההזדמנויות לכוונן היטב את היציבות של חלבונים כדוריים ואת שיווי המשקל אוליגומריזציה של מתחמי חלבון. ניסויי NMR בלחץ גבוה מאפשרים אפיון מפורט של הגורמים המסדירים את היציבות של חלבונים כדוריים, מנגנוני הקיפול שלהם ומנגנוני האוליגומריזציה על ידי שילוב יכולת כוונון היציבות העדינה של סטיית לחץ ורזולוציית האתר המוצעת על ידי ספקטרוסקופיית NMR פתרון. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לחקור את היציבות המתקפלת המקומית של חלבון באמצעות קבוצה של ניסויי 2D 1H-15N שנרשמו מ 1 בר ל 2.5 kbar. השלבים הנדרשים לרכישה וניתוח של ניסויים כאלה מודגמים בנתונים שנרכשו בתחום RRM2 של hnRNPA1.

Introduction

זה זמן רב מוכר כי אנרגיה גבוהה יותר, מאוכלס בדלילות מצבים קונפורמציה של חלבונים ומתחמי חלבון לשחק תפקיד מפתח במסלולים ביולוגיים רבים1,2,3. הודות לניסויים המבוססים על קאר-פרסל-מייבום-גיל (CPMG)4, העברת רוויית חילופי כימיקלים (CEST)5,והעברת רוויית חילופי מצב כהה (DEST)6 רצפי פעימה (בין היתר), ספקטרוסקופיית NMR פתרון התגלתה כשיטת בחירה לאפיון מצבי קונפורמציה ארעיים7. יחד עם ניסויים אלה, perturbations כגון טמפרטורה, pH, או denaturants כימי ניתן להציג כדי להגדיל את האוכלוסייה היחסית של תת-מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה יותר. באופן דומה, חלבון שיווי משקל יכול גם להיות מוטרד על ידי הפעלת לחץ הידרוסטטי גבוה. בהתאם לעוצמת השינוי בנפח הקשור לשינויים הקונפורמציה המתאימים, עלייה בלחץ בכמה מאות עד כמה אלפי ברים יכולה לייצב באופן משמעותי מצבאנרגיהגבוה יותר או לגרום לחלבון להתפתח לחלוטין 8,9,10. ספקטרום NMR חלבון מציג בדרך כלל שני סוגים של שינויים עם לחץ הידרוסטטי: (i) שינויים בשינויים כימיים ו-(ii) שינויים בעוצמת השיא. שינויים בהזזה כימית משקפים שינויים בממשק מי פני השטח של החלבון ו/או דחיסה מקומית של מבנה החלבון בסולם זמן מהיר (יחסית לסולם הזמן של NMR)11. הצלבות המציגות משמרות כימיות גדולות שאינן ליניאריות תלות בלחץ יכולות להצביע על נוכחות של מצבים קונפורמציה באנרגיה גבוהה יותר12,13. מצד שני, שינויי עוצמת שיא מצביעים על מעברים קונפורמיים משמעותיים בסולם זמן איטי, כגון שינויים באוכלוסיות המצב המקופלות/נפרשות. נוכחות של ביניים מתקפלים או מצבי אנרגיה גבוהים יותר ניתן לזהות מ וריאציות גדולות בסדר הגודל של שינוי נפח על התגלגלות נמדד עבור שאריות שונות של חלבון נתון14,15,16,17. בהתבסס על הניסיון שלנו, אפילו חלבונים קטנים המסווגים בדרך כלל כתיקיות של שתי מדינות מציגים תגובות לא אחידות ללחץ, המספק מידע שימושי על היציבות המתקפלת המקומית שלהם. מתואר כאן פרוטוקול לרכישה וניתוח של עוצמת שיא amide 1H כימי מעביר תלות בלחץ, באמצעות חלבון מודל מוטיב זיהוי RNA מבודד 2 (RRM2) של ribonucleoprotein גרעיני הטרוגניים A1 (hnRNPA1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן דורש (i) משאבה בלחץ גבוה ותא עם צינור זירקוניהאלומיניום 18בדירוג אלומיניום 2.5, (ii) התוכנה SPARKY19 לניתוח ספקטרום NMR, ו - (iii) תוכנה להתאמת עקומה.

1. הכנה לדוגמה, הרכבה של התא בלחץ גבוה, והקמת הניסויים.

  1. בחירת חוצץ: השתמש בתערובת שווה של מאגרים אניוניים וקטיוניים, כגון פוספט וטרייס20,21.
    הערה: pKa של מאגרים אניוניים כגון פוספט ו MES קשורה לנפח תגובה משמעותי (כלומר, ההבדל בנפחי המותח החלקיים של החומצה והמוצרים המייננים). ה- pH של מאגרים כאלה יכול אפוא להיות מושפע באופן משמעותי על ידי שינוי של לחץ (~ 0.25-0.5 יחידת pH / kbar).
  2. ודא כי נפח המדגם הנדרש דומה לזה של צינור NMR סטנדרטי בקוטר 3 מ"מ (~ 300μL).
  3. הציגו את המדגם 15N-שכותרתו עם פיפטה זכוכית לתוך צינור זירקוניה. ודא את המושבים לדוגמה בתחתית הצינור. להשלים עם 200 μL של שמן מינרלי כדי למנוע את המדגם מערבוב עם נוזל השידור (למשל, מים). מלא את שאר הצינור בנוזל שידור.
  4. שים טבעת O חד פעמית על גבי צינור הזירקוניה והחלק את הצינור לבסיס(איור 1A,B). לאחר מכן, חבר את הצינור לקו הרצועה בלחץ גבוה והידק את הבסיס לתא תחילה ביד. לאחר מכן, יש למרוח 14.7 ננומטר של המומנט כדי למנוע דליפות בלחץ נמוך יותר(איור 1C,D).
  5. כדי לבדוק את שלמות הרכבת תא הלחץ, לחץ על הצינור עד 300 בר מחוץ לספקטרומטר באמצעות תמיכה בתא וכלי בלימה. המתינו 15 דקות, אפסו את הלחץ לבר אחד ובדקו אם יש דליפות עם מגבון נקי ללא מוך.
  6. הכנס את הצינור הלא בלחץ לספקטרומטר על-ידי הנחיית קו הרצועה בזהירות. החלק את הצינור בספקטרומטר עד להגעה לתנוחת הישיבה לדוגמה(איור 1E).
  7. לנעול, shim, להתאים, ולכוון את ערוצי 1H ו 15N כרגיל.
    הערה: Shims עבור צינורות זירקוניה מדורגים בלחץ גבוה שונים מאוד צינורות NMR סטנדרטיים. מומלץ לשמור את shims ממוטב לשימוש עתידי.
  8. הגדר 1H-15N-HSQC או TROSY-HSQC ורשום ניסוי ייחוס בתנאים אטמוספריים (1bar).

2. הקלטת ניסויי NMR בלחץ גבוה

  1. להגדיל בהדרגה את הלחץ מ 1 בר ל 2.5 kbar עם 500 תוספת בר כדי לבדוק את היציבות הכוללת של החלבון. הגדר את המהירות של משאבת הלחץ כברירת מחדל ב- ~ 18 בר /s. אם שיעורי הקיפול/פתיח המדויקים אינם ידועים, תן לדגימה להתיק 15-20 דקות לאחר כל תוספת של 500 ברים. הקלט ספקטרום ב 2.5 kbar.
  2. בהדרגה להקטין את הלחץ בחזרה 1 בר עם 500 צעדי בר כדי לבדוק את הפיך של הלחץ מוטרד. להקליט ספקטרום אחר בתנאים אטמוספריים ולהשוות את השינויים הכימיים ואת עוצמות שיא עם זה של ספקטרום הייחוס שנרשם בעבר באותם תנאים.
    הערה: אם ההצלבות המקומיות אינטנסיביות יותר לאחר ריצת הלחץ, זה עשוי להצביע על כך שאגרפים קטנים הנמצאים בתמיסה בלחץ אטמוספרי עשויים להתנתק ולתפתח מחדש כראוי. מצד שני, אובדן בעוצמה או שינויים משמעותיים בשינויים כימיים מצביעים על כך שהחלבון עלול לחוות טעות בלתי הפיכה בתנאי לחץ גבוה.
  3. הקלט סדרה של ניסויים 2D מ 1 בר ל 2.5 kbar כל 500 בר. מומלץ להקליט ניסויים נוספים ליד נקודת ההטיה של המעבר המתקפל/נפתח כדי לשפר את דיוק ההתאמה.

3. ניתוח שינויים בעוצמת השיא

  1. עבד את כל הספקטרום והעבר את הקצאת עמוד השדרה מקשת הייחוס ב- 1 סרגל לספקטרום שנרשם ב- 500 bar ולאחר מכן העבר את המשימה מ- 500 בר ל- 1 kbar וכן הלאה.
    הערה: מכיוון שלחץ נעשה שינוי לא אחיד של משמרותכימיות של שעה ו- 15N, אל תעתיקו את משימת עמוד השדרה מקשת אחת לאחרת. להתאים אותו באופן ידני.
  2. בתפריט Sparky, לחץ על שיא > רשימת שיא (lt). בחלון רשימת שיאים, לחץ על אפשרויות ובחר באפשרות להציג הן תדרים (ppm) והן גובה נתונים. שמור את הרשימה המתקבלת עבור כל ספקטרום.
  3. בתוכנה המתאימה לעקומה, העתק את זהות ההצלבה וערכי עוצמת שיא כדי שערכי הלחץ (בסרגל) ימותנו את משתנה ציר ה- X ואת העוצמה כמשתנה ציר ה- Y.
  4. אם נצפה התגלגלות מלאה או כמעט מלאה (>80%), התאם את פרופילי עוצמת השיא הבודדים כדי לחלץ את האנרגיה החופשית ושינוי הנפח עם התפתחותם, בהתאמה, באמצעות מודל פשוט של שתי מדינות:
    Equation 1א"ק 1
    איפה, "אני" הוא העוצמה הנצפית של crosspeak בלחץ נתון p ו- IF הוא העוצמה של אותו crosspeak במצב מקופל לחלוטין. R הוא קבוע הגז, T הוא הטמפרטורה המוחלטת, ΔGU0 הבדל האנרגיה החופשית של גיבס הסטנדרטי בין המצבים המפותחים והממוספלים בלחץ אטמוספרי p0 (1 בר), ו- ΔVu שינוי הנפח עם התפתחותו. עם הלחץ p בבר וטמפרטורה T בקלווין, R = 1.987 cal / K, ΔGU0 הוא ב cal / מול, ו ΔVU הוא ב cal / מול / בר. הכפל את ערכי ΔVU המתקבלים מההתאמה ב- 41.84 כדי להמיר ל- mL / mol. ערכי ΔVU נמצאים בדרך כלל בטווח של -50 עד -150 מ"ל / מול עבור חלבונים כדוריים22. כאן, כל הפרמטרים באים לידי ביטוי לגבי התגובה המתפתחת אך ניתן להמיר בקלות לפרמטרים של תגובה מתקפלת (ΔGU0 = -ΔGF0 ו- ΔVU = -ΔVF).

4. ניתוח שינויים כימיים במשמרות

  1. סדר את העמודות בתוכנה כדי לקבל נקודות לחץ כמשתנה ואת 1 H משמרותכימיות שחולצו מרשימות Sparky כציר Y.
  2. התאם את תלות הלחץ של 1H כימי עובר למשוואה ריבועית פשוטה:
    δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2
    איפה, δ(p)הוא 1H כימי shift של crosspeak ב p לחץ נתון δ0(p0) משמרות כימיות 1H של אותו crosspeak בספקטרום הייחוס שנרשם ב 1 בר. B1 ו- B2 מייצגים את הפרמטרים מסדר ראשון ושני המתבטאים ב- ppm/ bar ו- ppm / bar2, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן שימש כדי לחקור את התלות בלחץ של RRM2, מוטיב זיהוי הרנ"א השני של hnRNPA1 (שאריות 95-106), אשר נפרש כמעט לחלוטין בטווח 2.5 kbar (>90%). 1 ספקטרוםH-15N נאספו בבר אחד, 500 בר, 750 בר, 1 kbar, 1.5 kbar, 2 kbar ו 2.5 kbar(איור 2). מכיוון שאף אחד מהצלבים המקוריים לא נראה מעל רמת הרעש ב-2.5 ק"מ, כל השאריות המתאימות יוחסו לערך עוצמה של 0 בלחץ זה (איור 3A). סה"כ 45 פרופילי עוצמת לחץ בודדים הותקנו על פי משוואה 1 (Eq. 1) כדי להשיג את השינויים המתאימים באנרגיה חופשית של גיבס סטנדרטית (ΔGU0)ובנפח (ΔVU)הקשורים לתגובה המתפתחת (איור 3A). ערכי ΔVU המחושב נעו בין -41 ל- -88 מ"ל / מול ו- ΔGU0 מ 1.8-3.3 קק"ל / מול. כאשר ממופים במבנה התחום (pdb 1U1R), נראה כי שאריות עם הגודל הגדול ביותר של שינוי נפח נמצאות בתוך הליבה המבנית של התחום (באדום, באיור 3B), ואילו אלה עם הגודל הקטן ביותר של שינוי נפח ממוקמים בעיקר בלולאה המחברת את β-גדילים 2 ו -3, ואת הלולאה המחברת β-strand 4 לסליל מסוף C (בירוק, איור 3B). התלות בלחץ של עמוד השדרה המקורי 1 H משמרותכימיות נותחה גם כדי לחקור את מידת הדחיסה וההטרוגניות הקונפורמציה של הרכב המצב המקופל. פרופילים בודדים של משמרות כימיות של 1H כפונקציה של לחץ הותקנו באמצעות Eq. 2 על מנת לחלץ מקדמים ליניאריים ספציפיים לאתר (B1)ולא ליניאריים (B2) (איור 3C). השאריות עם הקדם הלא ליניארי הגדול ביותר נמצאו בעיקר בליבה המבנית של התחום (בצהוב, איור 3D),בעוד שאריות עם הקדם הלא ליניארי הקטן ביותר היו ממוקמות בעיקר בתוך לולאות המחברות את המוטיבים המבניים השונים (בכחול, איור 3D).

Figure 1
איור 1:הרכבה והתקנה של תאים בלחץ גבוה בספקטרומטר. (א-ד) הרכבת התא בלחץ גבוה מלאה דורשת צינור זירקוניה, טבעת O חד פעמית, בסיס התא (A,B). הצינור מחובר לקו הרצועה על ידי הידוק הבסיס לתא (C,D). 14.7 ננומטר של מומנט נדרש כדי למנוע דליפות בלחץ נמוך יותר. (E)צינור הזירקוניה המחובר למשאבת המזרק Xtreme-60 דרך קו הרצועה מוכנס לספקטרומטר עד להגעה לתנוחת הישיבה הרגילה של הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פתיחת תחום hnRNPA1 RRM2 תחת לחץ. ספקטרום H-15N HSQC שנאסף ב-( A) 1 בר, (B) 1,000 בר, (C) 1,500 בר, (D) ו 2,500 בר להראות התגלגלות מלאה של דומיין RRM2 תחת לחץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח עוצמת שיא RRM2 ו-1 H כימי מעביר את התלות בלחץ. (A)פרופילי עוצמת שיא מייצגים שנרשמו עבור RRM2 בין 1 ל- 2,000 בר. קווים מלאים מייצגים את ההתאמה המתקבלת באמצעות Eq. 1 כדי לחשב את התקן המתאים אנרגיה חופשית ושינויי נפח הקשורים לתגובה המתפתחת. (B)25% העליונים של שאריות עם הגודל הנמדד הגדול ביותר של ΔVU מסומנים עם כדורים אדומים על מבנה הייחוס RRM2 (pdb 1U1R). שאריות עם העוצמה הקטנה ביותר של ΔVU מוצגות בירוק. (C)שינויים מייצגים של משמרות כימיות 1H שנמדדו עבור RRM2 בין 1 בר ל 2,000 בר. קווים מלאים מייצגים את ההתאמה ל- Eq. 2 כדי לחשב את מקדמי הלחץ הליניאריים (B1) והלא ליניאריים (B2). (D)25% העליונים של שאריות עם מקדמי B2 הגדולים ביותר מוצגים בצהוב, ואילו אלה עם מקדמי B2 הקטנים ביותר מוצגים בכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה מפרט פרוטוקול המיושם לבדיקת תגובות מבניות ותרמודינמיקה של חלבון ללחץ. הניסויים בלחץ גבוה שנרשמו כאן ב- RRM2 מראים כי וריאציות גדולות בערכי ΔVU, המעידות על שיתוף פעולה לא מלא, ניתן למצוא בחלבון תחום יחיד קטן יחסית. תמונה דומה עולה מניתוח שינויים בשינויים כימיים של 1H תחת לחץ. יש לציין כי קלביצר ושותפיו לעבודה הוכיחו כי ניתן לבצע ניתוח מעמיק יותר של שינויים במשמרות כימיות המקשר בין המקדחים הלא ליניאריים והליניאריים (B2/B1) לבין היחס בין השינוי בדחיסה ובנפח (Δβ/ΔV)23. תוצאות אלה מדגישות את היכולת של לחץ הידרוסטטי גבוה לערער מוטיבים מבניים בודדים וdomains המבוססים על היציבות התרמודינמית המקומית ושינוי נפח הקשורים להתפתחות. הקלטה של קבוצה פשוטה של ניסויי טיטריון לחץ יכולה אפוא לספק מידע רב ערך לגבי מנגנוני הקיפול וארכיטקטורת תת-תחום של חלבון.

כל מערכת הלחץ (משאבה ובקר) קומפקטית יחסית וניתן להתקין אותה בעגלת שירות סטנדרטית לגישה נוחה לספקטרומטר(איור 1). ניתן להשתמש בכל רצפי הדופק תחת לחץ ללא שינוי, כולל ניסויי תהודה משולשת. המגבלה היחידה היא כי צינורות זירקוניה מדורגים בלחץ להפחית את הרגישות של ניסויי NMR על ידי כמעט 50% לעומת צינור NMR סטנדרטי בקוטר 3 מ"מ. זה עשוי להוות אתגר עבור דגימות חלבון שלא ניתן להתרכז ברמה גבוהה מספיק. בהשוואה לשיטות שיבוש אחרות כגון טמפרטורה או דנאטורים כימיים, לחץ הידרוסטטי מציג את היתרון של להיות, עם מעט מאוד יוצאים מן הכלל, הפיך לחלוטין. מכיוון שלחץ מעדיף את הניתוק של מתחמי חלבון, יש, למשל, סיכון קטן מאוד לצבירה של מדגם, בעיה נתקלת לעתים קרובות בטמפרטורות גבוהות.

בעוד לחץ הידרוסטטי הוא כלי רב עוצמה לחקר יציבות החלבון, חשוב לזכור כי אין שיטה מושלמת של perturbation. כל אחד מהם מדגיש את הספציפיות של נוף אנרגיה חופשית חלבון בצורה שונה. לדוגמה, אם לשני מצבים קונפורמיים יש את אותו נפח טוחנות, עלייה בלחץ ההידרוסטטי לא תשנה באופן משמעותי את האוכלוסיות היחסיות שלהם. באופן דומה, אם לשני מצבים קונפורמיים יש שטח פנים חשוף דומה, הוספת דנטורים כימיים לא בהכרח תגדיל את האוכלוסייה היחסית של מדינה אחת בהשוואה לאחרת. באופן אידיאלי, שיטות perturbation שונות צריך להיות משולב כדי לקבל תיאור מלא של נוף אנרגיה חופשית חלבון15,24. לבסוף, יש לציין כי למרות שכתב היד מתמקד לתלות בלחץ של אינטנסיביות ושינויים כימיים מסדרה של ניסויים 2D 1H-15N נמדד בשיווי משקל, מגוון רחב של ניסויי NMR ניתן לצמיד ללחץ perturbation לחקור היבטים שונים של היציבות, מנגנון הקיפול, ואת הדינמיקה הקונפורמציה של חלבונים וחלבונים מתחמים20, 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד. הם לא מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי כספים מקרן הצדקה רוי ג'יי קארבר לג'וליאן רוש. אנו מודים לג'יי.די. לבנגוד ו-ב.ס. טולברט על שסיפקו בחביבות את דגימת RRM2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar Daedalus Innovations LLC NMRCELL-B
Sparky3 University of California San Francisco, CA N/A
Xtreme-60 Syringe pump Daedalus Innovations LLC XTREME-60

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
  2. Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
  3. Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
  4. Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
  5. Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
  6. Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
  7. Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
  8. Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
  9. Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
  10. Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
  11. Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
  12. Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
  13. Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
  14. Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
  15. Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
  16. Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
  17. Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
  18. Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
  19. Goddard, T. D., Kneller, D. G. Sparky 3. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).
  20. Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
  21. Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
  22. Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
  23. Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
  24. de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
  25. Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).

Tags

ביוכימיה גיליון 172 NMR בלחץ גבוה קיפול חלבונים יציבות חלבונים מצבים קונפורמציה באנרגיה גבוהה
ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, T. T., Siang, S., Roche, J.… More

Nguyen, T. T., Siang, S., Roche, J. High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States. J. Vis. Exp. (172), e62701, doi:10.3791/62701 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter