Summary
Proporcionamos una descripción detallada de los pasos necesarios para ensamblar una celda de alta presión, configurar y registrar experimentos de RMN de alta presión y, finalmente, analizar tanto la intensidad máxima como los cambios de cambio químico bajo presión. Estos experimentos pueden proporcionar información valiosa sobre las vías de plegamiento y la estabilidad estructural de las proteínas.
Abstract
La alta presión es un método de perturbación bien conocido que se puede utilizar para desestabilizar las proteínas globulares y disociar los complejos de proteínas de manera reversible. La presión hidrostática impulsa los equilibrios termodinámicos hacia el estado (s) con el volumen molar más bajo. El aumento de la presión ofrece, por lo tanto, la oportunidad de ajustar finamente la estabilidad de las proteínas globulares y los equilibrios de oligomerización de los complejos de proteínas. Los experimentos de RMN de alta presión permiten una caracterización detallada de los factores que gobiernan la estabilidad de las proteínas globulares, sus mecanismos de plegamiento y los mecanismos de oligomerización mediante la combinación de la capacidad de ajuste de estabilidad fina de la perturbación de la presión y la resolución del sitio ofrecida por la espectroscopia de RMN de solución. Aquí presentamos un protocolo para sondear la estabilidad de plegamiento local de una proteína a través de un conjunto de experimentos 2D 1H-15N registrados desde 1 bar hasta 2.5 kbar. Los pasos necesarios para la adquisición y el análisis de tales experimentos se ilustran con datos adquiridos en el dominio RRM2 de hnRNPA1.
Introduction
Durante mucho tiempo se ha reconocido que los estados conformacionales de mayor energía y escasamente poblados de proteínas y complejos de proteínas desempeñan un papel clave en muchas vías biológicas1,2,3. Gracias a experimentos basados en secuencias de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5y dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 (entre otras), la espectroscopia de RMN en solución ha surgido como un método de elección para caracterizar estados conformacionales transitorios7. Junto con estos experimentos, se pueden introducir perturbaciones como la temperatura, el pH o los desnaturalizantes químicos para aumentar la población relativa de subestados conformacionales de mayor energía. Del mismo modo, los equilibrios de proteínas también pueden ser perturbados mediante la aplicación de alta presión hidrostática. Dependiendo de la magnitud del cambio de volumen asociado con los cambios conformacionales correspondientes, un aumento de la presión de unos pocos cientos a unos pocos miles de bares puede estabilizar significativamente un estado de energía más alto o hacer que una proteína se despliegue completamente8,9,10. Los espectros de RMN de proteínas suelen mostrar dos tipos de cambios con presión hidrostática: (i) cambios de cambio químico y (ii) cambios de intensidad máxima. Los cambios químicos reflejan cambios en la interfaz proteína superficie-agua y/o compresión local de la estructura de la proteína en una escala de tiempo rápida (en relación con la escala de tiempo de RMN)11. Los cruces que exhiben grandes cambios químicos no lineales la dependencia de la presión pueden indicar la presencia de estados conformacionales de mayor energía12,13. Por otro lado, los cambios de intensidad máxima apuntan a transiciones conformacionales importantes en una escala de tiempo lenta, como cambios en las poblaciones de estados plegados / desplegados. La presencia de intermedios plegables o estados de energía superior se puede detectar a partir de grandes variaciones en la magnitud del cambio de volumen al desplegarse medido para diferentes residuos de una proteína dada14,15,16,17. Según nuestra experiencia, incluso las proteínas pequeñas que generalmente se clasifican como carpetas de dos estados exhiben respuestas no uniformes a la presión, lo que proporciona información útil sobre su estabilidad de plegamiento local. Aquí se describe un protocolo para la adquisición y análisis de la intensidad máxima de la amida y la dependencia de la presión de los cambios químicos de 1H, utilizando como proteína modelo el motivo de reconocimiento de ARN aislado 2 (RRM2) de la ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1 (hnRNPA1).
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Protocol
NOTA: El protocolo descrito aquí requiere (i) una bomba y celda de alta presión con un tubo de zirconia templado en aluminio de 2,5 kbar18,(ii) el software SPARKY19 para el análisis de los espectros de RMN, y (iii) un software de ajuste de curvas.
1. Preparación de la muestra, montaje de la celda de alta presión y puesta en preparación de los experimentos.
- Elección del tampón: Utilice la misma mezcla de tampones aniónicos y catiónicos, como fosfato y Tris20,21.
NOTA: El pKa de los tampones aniónicos como el fosfato y el MES se asocia con un volumen de reacción sustancial (es decir, la diferencia en los volúmenes molales parciales del ácido y los productos ionizados). Por lo tanto, el pH de tales tampones puede verse afectado significativamente por un cambio de presión (~ 0.25-0.5 unidad de pH / kbar). - Asegúrese de que el volumen de muestra requerido sea similar al de un tubo de RMN estándar de 3 mm de diámetro (~300μL).
- Introduzca la muestra etiquetada con 15N con una pipeta de vidrio en el tubo de zirconia. Asegúrese de que la muestra se atraque en la parte inferior del tubo. Completo con 200 μL de aceite mineral para evitar que la muestra se mezcle con el líquido de transmisión (por ejemplo, agua). Llene el resto del tubo con líquido de transmisión.
- Coloque una junta tórica de un solo uso en la parte superior del tubo de zirconia y deslice el tubo hacia la base(Figura 1A,B). Luego, conecte el tubo a la línea de sudación de alta presión y apriete la base a la celda primero a mano. Luego, aplique 14.7 Nm de torque para evitar fugas a menor presión(Figura 1C,D).
- Para comprobar la integridad del conjunto de la celda de presión, presurice el tubo hasta 300 bar fuera del espectrómetro utilizando el soporte de la celda y el recipiente de contención. Espere 15 minutos, restablezca la presión a 1 bar y verifique si hay fugas con una toallita limpia y sin pelusa.
- Inserte el tubo no presurizado en el espectrómetro guiando cuidadosamente la línea de sujeción. Deslice el tubo en el espectrómetro hasta alcanzar la posición sentada de la muestra (Figura 1E).
- Bloquea, shim, combina y sintoniza los canales 1H y 15N como de costumbre.
NOTA: Los shims para tubos de zirconia con clasificación de alta presión son muy diferentes de los tubos de RMN estándar. Se recomienda guardar los shims optimizados para su uso futuro. - Configure un 1H-15N-HSQC o TROSY-HSQC y registre un experimento de referencia en condiciones atmosféricas (1bar).
2. Registro de experimentos de RMN de alta presión
- Aumente gradualmente la presión de 1 bar a 2,5 kbar con incrementos de 500 bar para probar la estabilidad general de la proteína. Ajuste la velocidad de la bomba de presión de forma predeterminada en ~ 18 bar / s. Si no se conocen las tasas precisas de plegado/despliegue, deje que la muestra se equilibre 15-20 min después de cada incremento de 500 bares. Registre un espectro a 2,5 kbar.
- Disminuya gradualmente la presión a 1 bar con pasos de 500 bar para probar la reversibilidad de la perturbación de presión. Registrar otro espectro en condiciones atmosféricas y comparar los cambios químicos y las intensidades máximas con los del espectro de referencia previamente registrado en las mismas condiciones.
NOTA: Si los cruces nativos son más intensos después de la carrera de presión, puede indicar que pequeños agregados presentes en solución a presión atmosférica pueden haberse disociado y replechado adecuadamente. Por otro lado, una pérdida en la intensidad o cambios químicos significativos sugieren que la proteína puede experimentar un mal plegamiento no reversible en condiciones de alta presión. - Graba una serie de experimentos 2D desde 1 bar hasta 2,5 kbar cada 500 bar. Se recomienda registrar experimentos adicionales cerca del punto de inflexión de la transición de plegado/despliegue para mejorar la precisión del ajuste.
3. Análisis de los cambios de intensidad máxima
- Procese todos los espectros y transfiera la asignación de la columna vertebral del espectro de referencia a 1 bar al espectro registrado a 500 bar, y luego transfiera la asignación de 500 bar a 1 kbar y así sucesivamente.
NOTA: Debido a que la presión induce un desplazamiento no uniforme de 1H y 15N cambios químicos, no se limite a copiar la asignación de la columna vertebral de un espectro a otro. Ajústelo manualmente. - En el menú Sparky, haga clic en Peak > Peak List (lt). En la ventana Lista de picos, haga clic en Opciones y seleccione la opción para mostrar tanto Frecuencias (ppm) como Altura de datos. Guarde la lista obtenida para cada espectro.
- En un software de ajuste de curvas, copie la identidad de cruce y los valores de intensidad máxima para tener los valores de presión (en bar) como la variable del eje X y la intensidad como la variable del eje Y.
- Si se observa un despliegue completo o casi completo (>80%), ajuste los perfiles de intensidad máxima individuales para extraer la energía libre y el cambio de volumen al desplegarse, respectivamente, utilizando un modelo simple de dos estados:
Eq. 1
Donde, "I" es la intensidad observada de un diacruces a una presión dada p e IF es la intensidad del mismo diapasón en un estado completamente plegado. R es la constante del gas, T es la temperatura absoluta, ΔGU0 la diferencia de energía libre de Gibbs estándar entre los estados desplegado y plegado a presión atmosférica p0 (1 bar), y ΔVu el cambio de volumen al desplegarse. Con la presión p en bar y la temperatura T en kelvin, R = 1.987 cal/K, ΔGU0 está en cal/mol, y ΔVU está en cal/mol/bar. Multiplique los valores de ΔVU obtenidos del ajuste por 41,84 para convertirlos en mL/mol. Los valores de ΔVU están típicamente en el rango de -50 a -150 mL/mol para proteínas globulares22. Aquí, todos los parámetros se expresan con respecto a la reacción de despliegue, pero se pueden convertir fácilmente en parámetros de reacción de plegamiento (ΔGU0 = -ΔGF0 y ΔVU = -ΔVF).
Eq. 14. Análisis de los cambios químicos en los cambios
- Organice las columnas en el software para que los puntos de presión como variables y los desplazamientos químicos de 1H extraídos de las listas Sparky como el eje Y.
- Ajuste la dependencia de la presión de los cambios químicos de 1H a una ecuación cuadrática simple:
δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2
Donde, δ(p) es el desplazamiento químico medido de 1H de un cruce de una diafonía a una presión dada p y δ0(p0) los desplazamientos químicos de 1H del mismo cruce en el espectro de referencia registrado a 1 bar. B1 y B2 representan los parámetros de primer y segundo orden expresados en ppm/bar y ppm/bar2,respectivamente.
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Representative Results
El protocolo aquí descrito se utilizó para sondear la dependencia de la presión de RRM2, el segundo motivo de reconocimiento de ARN de hnRNPA1 (residuos 95-106), que se despliega casi por completo dentro del rango de 2,5 kbar (>90%). 1 Los espectrosH-15N se recogieron a 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1.5 kbar, 2 kbar y 2.5 kbar(Figura 2). Dado que ninguno de los cruces nativos era visible por encima del nivel de ruido a 2,5 kbar, a todos los residuos correspondientes se les atribuyó un valor de intensidad de 0 a esta presión(Figura 3A). Se ajustaron un total de 45 perfiles individuales de intensidad de presión de acuerdo con la Ecuación 1 (Eq. 1) para obtener los cambios correspondientes en la energía libre estándar de Gibbs (ΔGU0)y el volumen (ΔVU)asociados con la reacción de despliegue(Figura 3A). Los valores calculados de ΔVU variaron de -41 a -88 mL/mol y ΔGU0 de 1,8 a 3,3 kcal/mol. Cuando se mapea en la estructura del dominio (pdb 1U1R), parece que los residuos con la mayor magnitud de cambio de volumen se encuentran dentro del núcleo estructural del dominio (en rojo, en la Figura 3B),mientras que aquellos con la menor magnitud de cambio de volumen se encuentran principalmente en el bucle que conecta las β-strands 2 y 3, y el bucle que conecta β-strand 4 a la hélice C-terminal (en verde, Figura 3B). También se analizó la dependencia de la presión de los cambios químicos de la columna vertebral nativa 1H para sondear el grado de compresibilidad y heterogeneidad conformacional del conjunto de estado plegado. Los perfiles individuales de los desplazamientos químicos de 1H en función de la presión se ajustaron utilizando Eq. 2 para extraer coeficientes lineales (B1)y no lineales (B2)específicos del sitio(Figura 3C). Los residuos con los coeficientes no lineales más grandes se encontraron principalmente en el núcleo estructural del dominio (en amarillo, Figura 3D),mientras que los residuos con los coeficientes no lineales más pequeños se localizaron principalmente dentro de bucles que conectan los diferentes motivos estructurales (en azul, Figura 3D).
Figura 1: Montaje e instalación de celdas de alta presión en el espectrómetro. (A-D) El conjunto completo de celdas de alta presión requiere un tubo de zirconia, una oroba de un solo uso, la base de la celda (A, B). El tubo se conecta a la línea de sución apretando la base a la celda(C, D). Se requieren 14,7 Nm de par para evitar fugas a menor presión. (E) El tubo de zirconia conectado a la bomba de jeringa Xtreme-60 a través de la línea de sución se introduce en el espectrómetro hasta alcanzar la posición normal de la muestra sentada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Despliegue del dominio hnRNPA1 RRM2 bajo presión. 1Espectros H-15 N HSQC recogidos en (A) 1 bar, (B) 1.000 bar, (C) 1.500 bar, (D) y 2.500 bar muestran un despliegue completo del dominio RRM2 bajo presión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de laintensidad máxima de RRM2 y la dependencia de la presión de los cambios químicos de 1H. (A) Perfiles representativos de intensidad máxima registrados para RRM2 entre 1 y 2.000 bar. Las líneas sólidas representan el ajuste obtenido utilizando Eq. 1 para calcular los correspondientes cambios estándar de energía libre y volumen asociados con la reacción de despliegue. (B) El 25% superior de los residuos con la mayor magnitud medida de ΔVU se resaltan con esferas rojas en la estructura de referencia RRM2 (pdb 1U1R). Los residuos con la magnitud más pequeña de ΔVU se muestran en verde. (C) Cambios representativos de los desplazamientos químicos de 1H medidos para RRM2 entre 1 bar y 2.000 bar. Las líneas sólidas representan el ajuste a Eq. 2 para calcular los coeficientes de presión lineales (B1) y no lineales (B2). (D) El 25 % superior de los residuos con los coeficientes B2 más grandes se muestran en amarillo, mientras que los que tienen los coeficientes B2 más pequeños se muestran en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio detalla un protocolo implementado para sondear las respuestas estructurales y termodinámicas de las proteínas a la perturbación de la presión. Los experimentos de alta presión registrados aquí en RRM2 demuestran que se pueden encontrar grandes variaciones en los valores de ΔVU, indicativos de un despliegue no totalmente cooperativo, en una proteína de dominio único relativamente pequeña. Una imagen similar surge del análisis de los cambios de cambio químico de 1H bajo presión. Cabe señalar que Kalbitzer y sus colaboradores han demostrado que se puede realizar un análisis más profundo de los cambios de desplazamiento químico vinculando la relación entre los coeficientes no lineales y lineales (B2/ B1) con la relación del cambio en la compresibilidad y el volumen (Δβ / ΔV)23. Estos resultados resaltan la capacidad de la alta presión hidrostática para desestabilizar motivos estructurales individuales y subdominios basados en la estabilidad termodinámica local y el cambio de volumen asociado con el despliegue. Por lo tanto, registrar un conjunto simple de experimentos de titulación de presión puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos de plegamiento y la arquitectura del subdominio de una proteína.
Todo el sistema de presión (bomba y controlador) es relativamente compacto y se puede instalar en un carro de utilidad estándar para facilitar el acceso al espectrómetro (Figura 1). Todas las secuencias de pulsos se pueden utilizar bajo presión sin modificaciones, incluidos los experimentos de triple resonancia. La única limitación es que los tubos de zirconia con clasificación de presión reducen la sensibilidad de los experimentos de RMN en casi un 50% en comparación con un tubo de RMN estándar de 3 mm de diámetro. Esto puede presentar un desafío para las muestras de proteínas que no se pueden concentrar a un nivel lo suficientemente alto. En comparación con otros métodos de perturbación como la temperatura o los desnaturalizantes químicos, la presión hidrostática presenta la ventaja de ser, con muy pocas excepciones, totalmente reversible. Debido a que la presión favorece la disociación de los complejos de proteínas, existe, por ejemplo, muy poco riesgo de agregación de muestras, un problema que a menudo se encuentra con las altas temperaturas.
Si bien la presión hidrostática es una herramienta poderosa para estudiar la estabilidad de las proteínas, es importante tener en cuenta que no existe un método perfecto de perturbación. Cada uno de ellos destaca la especificidad de un paisaje de energía libre de proteínas de una manera diferente. Por ejemplo, si dos estados conformacionales tienen el mismo volumen molar, un aumento en la presión hidrostática no cambiará significativamente sus poblaciones relativas. Del mismo modo, si dos estados conformacionales tienen un área de superficie expuesta similar, la adición de desnaturalizantes químicos no necesariamente aumentaría la población relativa de un estado en comparación con el otro. Idealmente, se deben combinar diferentes métodos de perturbación para obtener una descripción completa de un paisaje de energía libre deproteínas 15,24. Finalmente, cabe señalar que aunque el manuscrito se centra en la dependencia de la presión de la intensidad y los cambios químicos de las series de experimentos 2D 1H-15N medidos en equilibrio, una amplia gama de experimentos de RMN se pueden acoplar a la perturbación de la presión para sondear diferentes aspectos de la estabilidad, el mecanismo de plegamiento y la dinámica conformacional de proteínas y complejos de proteínas20, 25.
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Disclosures
Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito. Declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos del Roy J. Carver Charitable Trust a Julien Roche. Agradecemos a J. D. Levengood y B. S. Tolbert por proporcionar amablemente la muestra RRM2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
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