Summary
Wir bieten eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um eine Hochdruckzelle zusammenzubauen, Hochdruck-NMR-Experimente einzurichten und aufzuzeichnen und schließlich sowohl die Spitzenintensität als auch chemische Verschiebungsänderungen unter Druck zu analysieren. Diese Experimente können wertvolle Einblicke in die Faltungswege und die strukturelle Stabilität von Proteinen liefern.
Abstract
Hochdruck ist eine bekannte Störungsmethode, mit der globuläre Proteine destabilisiert und Proteinkomplexe reversibel dissoziiert werden können. Hydrostatischer Druck treibt thermodynamische Gleichgewichte in Richtung des/der Zustand(e) mit dem unteren molaren Volumen. Steigender Druck bietet daher die Möglichkeit, die Stabilität von kugelförmigen Proteinen und die Oligomerisierungsgleichgewichte von Proteinkomplexen fein abzustimmen. Hochdruck-NMR-Experimente ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung der Faktoren, die die Stabilität von kugelförmigen Proteinen, ihre Faltungsmechanismen und Oligomerisierungsmechanismen steuern, indem die Feinstabilitätsabstimmungsfähigkeit der Druckstörung und die Standortauflösung der Lösungs-NMR-Spektroskopie kombiniert werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der lokalen Faltungsstabilität eines Proteins über eine Reihe von 2D-1H-15N-Experimenten, die von 1 bar bis 2,5 kbar aufgezeichnet wurden. Die für die Erfassung und Analyse solcher Experimente erforderlichen Schritte werden anhand von Daten veranschaulicht, die auf der RRM2-Domäne von hnRNPA1 erfasst wurden.
Introduction
Es ist seit langem bekannt, dass energiereichere, dünn besiedelte Konformationszustände von Proteinen und Proteinkomplexen eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Signalwegen spielen1,2,3. Dank Experimenten, die unter anderem auf Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5und Dark-State Exchange Saturation Transfer (DEST)6 Pulssequenzen basieren, hat sich die Lösungs-NMR-Spektroskopie als Methode der Wahl zur Charakterisierung transienter Konformationszustände7herauskristallisiert. Zusammen mit diesen Experimenten können Störungen wie Temperatur, pH-Wert oder chemische Denaturierungsmittel eingeführt werden, um die relative Population von konformationsreicheren Substaten zu erhöhen. In ähnlicher Weise können Proteingleichgewichte auch durch Anwendung eines hohen hydrostatischen Drucks gestört werden. Abhängig von der Größenordnung der Volumenänderung, die mit den entsprechenden Konformationsänderungen verbunden ist, kann ein Druckanstieg um einige hundert bis einige tausend bar einen höheren Energiezustand signifikant stabilisieren oder dazu führen, dass sich ein Protein vollständig entfaltet8,9,10. Protein-NMR-Spektren zeigen typischerweise zwei Arten von Veränderungen mit hydrostatischem Druck: (i) chemische Verschiebungsänderungen und (ii) Änderungen der Spitzenintensität. Chemische Verschiebungsänderungen spiegeln Veränderungen an der Proteinoberflächen-Wasser-Grenzfläche und/oder lokale Kompression der Proteinstruktur auf einer schnellen Zeitskala (relativ zur NMR-Zeitskala)wider 11. Crosspeaks, die große nichtlineare chemische Verschiebungen aufweisen, können auf das Vorhandensein von konformationsreicheren Zuständen hinweisen12,13. Auf der anderen Seite deuten Änderungen der Spitzenintensität auf große Konformationsübergänge auf einer langsamen Zeitskala hin, wie z. B. Veränderungen in gefalteten / entfalteten Zustandspopulationen. Das Vorhandensein von Faltungszwischenprodukten oder höheren Energiezuständen kann aus großen Variationen in der Größe der Volumenänderung bei der Entfaltung nachgewiesen werden, gemessen für verschiedene Rückstände eines bestimmten Proteins14,15,16,17. Basierend auf unserer Erfahrung zeigen selbst kleine Proteine, die typischerweise als Zwei-Zustands-Ordner klassifiziert werden, ungleichmäßige Reaktionen auf Druck, was nützliche Informationen über ihre lokale Faltungsstabilität liefert. Hier wird ein Protokoll zur Erfassung und Analyse der Amid-Spitzenintensität und der 1H chemischen Verschiebungen der Druckabhängigkeit beschrieben, wobei als Modellprotein das isolierte RNA-Erkennungsmotiv 2 (RRM2) des heterogenen kernen Ribonukleoproteins A1 (hnRNPA1) verwendet wird.
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Protocol
HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll erfordert (i) eine Hochdruckpumpe und -zelle mit einem 2,5 kbar aluminiumgespannten Zirkonoxidrohr18,(ii) die Software SPARKY19 zur Analyse der NMR-Spektren und (iii) eine Kurvenanpassungssoftware.
1. Probenvorbereitung, Montage der Hochdruckzelle und Aufbau der Experimente.
- Wahl des Puffers: Verwenden Sie eine gleiche Mischung aus anionischen und kationischen Puffern wie Phosphat und Tris20,21.
HINWEIS: Der pKa von anionischen Puffern wie Phosphat und MES ist mit einem erheblichen Reaktionsvolumen verbunden (d.h. der Differenz in den partiellen Molalvolumina der Säure und der ionisierten Produkte). Der pH-Wert solcher Puffer kann daher durch eine Druckänderung (~0,25-0,5 pH-Einheit/kbar) erheblich beeinflusst werden. - Stellen Sie sicher, dass das erforderliche Probenvolumen dem eines Standard-NMR-Röhrchens mit 3 mm Durchmesser (~ 300μL) ähnelt.
- Die 15N-markierte Probe mit einer Glaspipette in das Zirkonoxidröhrchen einführen. Stellen Sie sicher, dass die Probe am Boden des Röhrchens sitzt. Komplett mit 200 μL Mineralöl, um zu verhindern, dass sich die Probe mit der Transmissionsflüssigkeit (z. B. Wasser) vermischt. Füllen Sie den Rest des Röhrchens mit Getriebeflüssigkeit.
- Legen Sie einen Einweg-O-Ring auf das Zirkonoxidrohr und schieben Sie das Rohr in die Basis (Abbildung 1A, B). Verbinden Sie dann das Rohr mit der Hochdruck-Haltelinie und ziehen Sie die Basis zuerst von Hand an der Zelle fest. Wenden Sie dann 14,7 Nm Drehmoment an, um Leckagen bei niedrigerem Druck zu verhindern (Abbildung 1C, D).
- Um die Integrität der Druckzellenanordnung zu überprüfen, drücken Sie das Rohr bis zu 300 bar außerhalb des Spektrometers mit Zellunterstützung und Containment-Gefäß. Warten Sie 15 Minuten, setzen Sie den Druck auf 1 bar zurück und überprüfen Sie mit einem sauberen, fusselfreien Tuch auf Lecks.
- Setzen Sie das drucklose Rohr in das Spektrometer ein, indem Sie die Seillinie vorsichtig führen. Schieben Sie das Röhrchen in das Spektrometer, bis die Sitzposition der Probe erreicht ist (Abbildung 1E).
- Sperren, Shimen, Anpassen und Abstimmen der 1H- und 15N-Kanäle wie gewohnt.
HINWEIS: Shims für Hochdruck-Zirkonoxidrohre unterscheiden sich stark von Standard-NMR-Rohren. Es wird empfohlen, die optimierten Shims für die zukünftige Verwendung zu speichern. - Richten Sie einen 1H-15N-HSQC oder TROSY-HSQC ein und zeichnen Sie ein Referenzexperiment unter atmosphärischen Bedingungen auf (1bar).
2. Aufzeichnung von Hochdruck-NMR-Experimenten
- Erhöhen Sie schrittweise den Druck von 1 bar auf 2,5 kbar mit 500 bar-Schritten, um die Gesamtstabilität des Proteins zu testen. Stellen Sie die Drehzahl der Druckpumpe standardmäßig auf ~18 bar/s ein. Wenn die genauen Falt-/Entfaltungsraten nicht bekannt sind, lassen Sie die Probe 15-20 Minuten nach jedem 500-bar-Schritt ausgleichen. Zeichnen Sie ein Spektrum mit 2,5 kbar auf.
- Verringern Sie den Druck allmählich wieder auf 1 bar mit 500 bar Schritten, um die Reversibilität der Druckstörungen zu testen. Zeichnen Sie ein anderes Spektrum unter atmosphärischen Bedingungen auf und vergleichen Sie die chemischen Verschiebungen und Spitzendichten mit denen des Referenzspektrums, das zuvor unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet wurde.
HINWEIS: Wenn die nativen Kreuze nach dem Drucklauf intensiver sind, kann dies darauf hindeuten, dass kleine Aggregate, die bei atmosphärem Druck in Lösung vorhanden sind, sich dissoziiert und ordnungsgemäß neu gefaltet haben können. Auf der anderen Seite deuten ein Intensitätsverlust oder signifikante chemische Verschiebungsänderungen darauf hin, dass das Protein unter Hochdruckbedingungen eine nicht reversible Fehlfaltung erfahren kann. - Zeichnen Sie eine Reihe von 2D-Experimenten von 1 bar bis 2,5 kbar alle 500 bar auf. Es wird empfohlen, zusätzliche Experimente in der Nähe des Wendepunkts des Falt-/Entfaltungsübergangs aufzuzeichnen, um die Präzision der Passform zu verbessern.
3. Analyse von Änderungen der Spitzenintensität
- Verarbeiten Sie alle Spektren und übertragen Sie die Backbone-Zuweisung vom Referenzspektrum bei 1 bar auf das bei 500 bar aufgezeichnete Spektrum und übertragen Sie dann die Zuweisung von 500 bar auf 1 kbar und so weiter.
HINWEIS: Da Druck eine ungleichmäßige Verschiebung von 1H und 15N chemische Verschiebungen induziert, kopieren Sie nicht einfach die Backbone-Zuordnung von einem Spektrum zum nächsten. Passen Sie es manuell an. - Klicken Sie im Sparky-Menü auf Peak > Peak List (lt). Klicken Sie im Fenster Peakliste auf Optionen und wählen Sie die Option, um sowohl Frequenzen (ppm) als auch Datenhöheanzuzeigen. Speichern Sie die für jedes Spektrum erhaltene Liste.
- Kopieren Sie in einer Kurvenanpassungssoftware die Crosspeak-Identität und die Spitzenintensitätswerte, um die Druckwerte (in bar) als X-Achsenvariable und die Intensität als Y-Achsenvariable zu erhalten.
- Wenn eine vollständige oder nahezu vollständige (>80%) Entfaltung beobachtet wird, passen Sie die einzelnen Spitzenintensitätsprofile an, um die freie Energie- bzw. Volumenänderung bei der Entfaltung mit einem einfachen Zwei-Zustands-Modell zu extrahieren:
Gleichung 1
Dabei ist "I" die beobachtete Intensität eines Crosspeaks bei einem gegebenen Druck p und IF ist die Intensität desselben Crosspeaks in einem vollständig gefalteten Zustand. R ist die Gaskonstante, T ist die absolute Temperatur, ΔGU0 die Standard-Gibbs-Freie-Energiedifferenz zwischen dem entfalteten und dem gefalteten Zustand bei Atmosphärendruck p0 (1 bar) und ΔVu die Volumenänderung beim Entfalten. Mit dem Druck p in bar und der Temperatur T in Kelvin, R = 1,987 cal/K, ist ΔGU0 in cal/mol und ΔVU in cal/mol/bar. Multiplizieren Sie die ΔVU-Werte, die aus der Anpassung erhalten wurden, mit 41,84, um sie in ml/mol umzurechnen. ΔVU-Werte liegen typischerweise im Bereich von -50 bis -150 ml/mol für kugelförmige Proteine22. Hier werden alle Parameter in Bezug auf die Entfaltungsreaktion ausgedrückt, können aber leicht in Faltreaktionsparameter umgewandelt werden (ΔGU0 = -ΔGF0 und ΔVU = -ΔVF).
Gleichung 14. Analyse chemischer Verschiebungsänderungen
- Ordnen Sie die Spalten in der Software so an, dass druckpunkte als variabel und die aus Sparky extrahierten chemischen Verschiebungen von 1H als Y-Achse aufgeführt werden.
- Passen Sie die Druckabhängigkeit der chemischen Verschiebungenvon 1 H an eine einfache quadratische Gleichung an:
δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Äq. 2
Wobei δ(p) die gemessene chemische Verschiebung eines Crosspeaks um 1 H bei einemgegebenen Druck p und δ0(p0) die 1H chemischen Verschiebungen desselben Crosspeaks im Referenzspektrum bei 1 bar gemessen wird. B1 und B2 stellen die Parameter erster und zweiter Ordnung dar, ausgedrückt in ppm/bar bzw. ppm/bar2.
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Representative Results
Mit dem hier beschriebenen Protokoll wurde die Druckabhängigkeit von RRM2, dem zweiten RNA-Erkennungsmotiv von hnRNPA1 (Rückstände 95-106), untersucht, das sich im 2,5 kbar-Bereich (>90%) nahezu vollständig entfaltet. 1 H-15N-Spektren wurden bei 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar und 2,5 kbar gesammelt (Abbildung 2). Da keine der nativen Quersprechen oberhalb des Geräuschpegels bei 2,5 kbar sichtbar war, wurde allen entsprechenden Rückständen bei diesem Druck ein Intensitätswert von 0 zugeschrieben (Bild 3A). Insgesamt wurden 45 individuelle Druckintensitätsprofile nach Gleichung 1 (Eq. 1) angepasst, um die entsprechenden Änderungen der Mitentfaltungsreaktion verbundenen Standard-Gibbs-Freie-Energie (ΔGU)und des Volumens (ΔVU)zu erhalten (Abbildung 3A). Die berechneten ΔVU-Werte reichten von -41 bis -88 mL/mol und ΔGU0 von 1,8-3,3 kcal/mol. Bei der Abbildung auf die Domänenstruktur (pdb 1U1R) scheint es, dass Rückstände mit der größten Größe der Volumenänderung innerhalb des Domänenstrukturkerns gefunden werden (in rot, in Abbildung 3B),während sich diejenigen mit der geringsten Volumenänderung hauptsächlich in der Schleife befinden, die die β-Stränge 2 und 3 verbindet, und die Schleife, die β-Strang 4 mit der C-Terminal-Helix verbindet (in grün, Abbildung 3B). Die Druckabhängigkeit der nativen chemischen Verschiebungen des Rückgrats 1H wurde ebenfalls analysiert, um den Grad der Kompressibilität und konformationellen Heterogenität des gefalteten Zustandsensembles zu untersuchen. Individuelle Profile von 1H chemischen Verschiebungen in Abhängigkeit vom Druck wurden mit Eq. 2 angepasst, um ortsspezifische lineare(B1)und nichtlineare (B2) Koeffizientenzu extrahieren (Abbildung 3C). Die Rückstände mit den größten nichtlinearen Koeffizienten fanden sich meist im strukturellen Kern der Domäne (gelb, Abbildung 3D),während sich Rückstände mit den kleinsten nichtlinearen Koeffizienten meist in Schleifen befanden, die die verschiedenen Strukturmotive verbanden (in blau, Abbildung 3D).
Abbildung 1: Hochdruckzellenmontage und Installation im Spektrometer. (A-D) Die vollständige Hochdruckzellenanordnung erfordert ein Zirkonoxidrohr, einen Einweg-O-Ring, die Zellbasis(A,B). Das Rohr wird mit der Seillinie verbunden, indem die Basis an der Zelle (C, D) festgezogen wird. 14,7 Nm Drehmoment sind erforderlich, um Leckagen bei niedrigerem Druck zu verhindern. (E) Das Zirkonoxidrohr, das über die Seilleitung mit der Xtreme-60-Spritzenpumpe verbunden ist, wird in das Spektrometer eingeführt, bis die normale Probensitzposition erreicht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Entfaltung der hnRNPA1 RRM2-Domäne unter Druck. 1H-15N HSQC-Spektren, die bei (A) 1 bar, (B) 1.000 bar, (C) 1.500 bar, (D) und 2.500 bar gesammelt wurden, zeigen eine vollständige Entfaltung der RRM2-Domäne unter Druck. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Analyse der RRM2-Spitzenintensität und der Druckabhängigkeit von 1H chemischen Verschiebungen. (A) Repräsentative Spitzenintensitätsprofile, die für RRM2 zwischen 1 und 2.000 bar aufgezeichnet wurden. Durchgezogene Linien stellen die Anpassung dar, die mit Eq. 1 erhalten wurde, um die entsprechenden Standardänderungen an freier Energie und Volumen zu berechnen, die mit der Entfaltungsreaktion verbunden sind. (B) Die oberen 25 % der Rückstände mit der größten gemessenen Größe von ΔVU sind mit roten Kugeln auf der RRM2-Referenzstruktur (pdb 1U1R) hervorgehoben. Rückstände mit der kleinsten Größe von ΔVU sind grün dargestellt. (C) Repräsentative Änderungen der für RRM2 gemessenen chemischen Verschiebungen von 1H zwischen 1 bar und 2.000 bar. Durchgezogene Linien stellen die Anpassung an Äq. 2 dar, um die linearen (B1) und nichtlinearen (B2)Druckkoeffizienten zu berechnen. (D) Die oberen 25 % der Rückstände mit den größtenB2-Koeffizienten sind gelb dargestellt, während die Rückstände mit den kleinstenB2-Koeffizienten blau dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das implementiert wurde, um die strukturellen und thermodynamischen Reaktionen von Proteinen auf Druckstörungen zu untersuchen. Die hier auf RRM2 aufgezeichneten Hochdruckexperimente zeigen, dass große Variationen derΔV-U-Werte, die auf eine nicht vollständig kooperative Entfaltung hinweisen, in einem relativ kleinen Einzeldomänenprotein gefunden werden können. Ein ähnliches Bild ergibt sich aus der Analyse von 1H chemischen Verschiebungsänderungen unter Druck. Es sei darauf hingewiesen, dass Kalbitzer und seine Mitarbeiter gezeigt haben, dass eine eingehendere Analyse chemischer Verschiebungsänderungen durchgeführt werden kann, bei der das Verhältnis zwischen den nichtlinearen und linearen Koeffizienten (B2/ B1) mit dem Verhältnis der Änderung der Kompressibilität und des Volumens (Δβ / ΔV)23verknüpft wird. Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit eines hohen hydrostatischen Drucks, einzelne Strukturmotive und Subdomänen basierend auf der lokalen thermodynamischen Stabilität und Volumenänderung, die mit der Entfaltung verbunden sind, zu destabilisieren. Die Aufzeichnung eines einfachen Satzes von Drucktitrationsexperimenten kann daher wertvolle Informationen über die Faltungsmechanismen und die Subdomänenarchitektur eines Proteins liefern.
Das gesamte Drucksystem (Pumpe und Regler) ist relativ kompakt und kann für einen einfachen Zugang zum Spektrometer auf einem Standard-Versorgungswagen installiert werden (Abbildung 1). Alle Pulssequenzen können unter Druck ohne Modifikation verwendet werden, einschließlich Dreifachresonanzexperimenten. Die einzige Einschränkung besteht darin, dass druckbelastbare Zirkonoxidröhrchen die Empfindlichkeit von NMR-Experimenten im Vergleich zu einem Standard-NMR-Rohr mit 3 mm Durchmesser um fast 50% reduzieren. Dies kann eine Herausforderung für Proteinproben darstellen, die nicht auf ein ausreichend hohes Niveau konzentriert werden können. Im Vergleich zu anderen Störungsmethoden wie Temperatur oder chemischen Denaturierungsmitteln bietet der hydrostatische Druck den Vorteil, dass er mit sehr wenigen Ausnahmen vollständig reversibel ist. Da der Druck die Dissoziation von Proteinkomplexen begünstigt, besteht beispielsweise nur ein sehr geringes Risiko der Probenaggregation, ein Problem, das häufig bei hohen Temperaturen auftritt.
Während hydrostatischer Druck ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Proteinstabilität ist, ist es wichtig zu bedenken, dass es keine perfekte Methode der Störung gibt. Jeder von ihnen unterstreicht die Spezifität einer proteinfreien Energielandschaft auf andere Weise. Wenn beispielsweise zwei Konformationszustände das gleiche molare Volumen haben, wird ein Anstieg des hydrostatischen Drucks ihre relativen Populationen nicht signifikant verändern. Wenn zwei Konformationszustände eine ähnliche exponierte Oberfläche haben, würde die Zugabe chemischer Denaturierungsmittel nicht unbedingt die relative Population eines Staates im Vergleich zum anderen erhöhen. Idealerweise sollten verschiedene Störungsmethoden kombiniert werden, um eine vollständige Beschreibung einer proteinfreien Energielandschaft zu erhalten15,24. Schließlich ist anzumerken, dass, obwohl sich das Manuskript auf die Druckabhängigkeit von Intensität und chemischen Verschiebungen aus Serien von 2D 1H-15N-Experimenten konzentriert, die im Gleichgewicht gemessen wurden, eine breite Palette von NMR-Experimenten mit Druckstörungen gekoppelt werden kann, um verschiedene Aspekte der Stabilität, des Faltungsmechanismus und der Konformationsdynamik von Proteinen und Proteinkomplexen zu untersuchen 20. ( 25) DER PRÄSIDENT. - Nach der 25
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Disclosures
Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt. Sie erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Roy J. Carver Charitable Trust an Julien Roche unterstützt. Wir danken J. D. Levengood und B. S. Tolbert für die freundliche Bereitstellung der RRM2-Probe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
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