Summary
Das Zusammenspiel von genetischer Anfälligkeit, Schleimhautimmunität und mikroökologischem Darmmilieu ist an der Pathogenese entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) beteiligt. In dieser Studie wandten wir die fäkale Mikrobiota-Transplantation bei IL-10-defizienten Mäusen an und untersuchten ihre Auswirkungen auf Dickdarmentzündungen und Herzfunktion.
Abstract
Mit der Entwicklung der Mikroökologie in den letzten Jahren hat der Zusammenhang zwischen Darmbakterien und entzündlichen Darmerkrankungen (CED) erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass dysbiotische Mikrobiota eine aktive Rolle bei der Auslösung oder Verschlechterung des Entzündungsprozesses bei IBD spielt und dass die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) eine attraktive therapeutische Strategie ist, da die Übertragung einer gesunden Mikrobiota auf IBD-Patienten die entsprechende Wirt-Mikrobiota-Kommunikation wiederherstellen könnte. Die molekularen Mechanismen sind jedoch unklar und die Wirksamkeit von FMT ist nicht sehr gut belegt. Daher sind weitere Studien in Tiermodellen der IBD notwendig. In dieser Methode wandten wir FMT von Wildtyp-C57BL / 6J-Mäusen auf IL-10-defiziente Mäuse an, ein weit verbreitetes Mausmodell für Colitis. Die Studie befasst sich mit dem Sammeln von Kotpellets von den Spendermäusen, der Herstellung der Stuhllösung / -suspension, der Verabreichung der Stuhllösung und der Überwachung der Krankheit. Wir fanden heraus, dass FMT die kardiale Beeinträchtigung bei IL-10-Knockout-Mäusen signifikant milderte, was ihr therapeutisches Potenzial für das IBD-Management unterstreicht.
Introduction
Das menschliche Darmmikroökosystem ist äußerst komplex, mit mehr als 1000 Bakterienarten im Darm eines gesunden Menschen1. Die Darmflora ist an der Aufrechterhaltung der normalen physiologischen Funktionen des Darms und der Immunantwort beteiligt und hat eine untrennbare Beziehung zum menschlichen Körper. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass das Darmmikrobiom das letzte menschliche Organ darstellt, das Teil des menschlichen Körpers ist, nicht nur eine Gruppe von Parasiten2. Eine "gesunde" symbiotische Beziehung zwischen der Darmmikrobiota, ihren Metaboliten und dem im frühen Leben etablierten Immunsystem des Wirts ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase. Bei einigen abnormalen Zuständen wie chronischen Entzündungen stören Veränderungen in der inneren und äußeren Umgebung des Körpers die Darmhomöostase ernsthaft, was zu einem anhaltenden Ungleichgewicht der mikrobiellen Gemeinschaft des Darms führt, die als Dysbiose3 bezeichnet wird. Tatsächlich kann die Exposition gegenüber mehreren Umweltfaktoren, einschließlich Ernährung, Medikamenten und Krankheitserregern, zu Veränderungen in der Mikrobiota führen.
Dysbiose ist mit der Pathogenese einer Vielzahl von Darmerkrankungen verbunden, wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD), Reizdarmsyndrom (IBS) und pseudomembranöse Enteritis, sowie eine wachsende Liste von extraintestinalen Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fettleibigkeit und Allergien4. Mikrobiota-Profiling zeigte, dass Patienten mit IBD eine dramatische Abnahme der bakteriellen Vielfalt sowie deutliche Veränderungen in den Populationen einiger spezifischer Bakterienstämme aufweisen 5,6. Diese Studien zeigten weniger Lachnospiraceae und Bacteroidetes, sondern mehr Proteobakterien und Actinobakterien bei IBD-Patienten. Es wird angenommen, dass die Pathogenese von IBD mit verschiedenen pathogenen Faktoren zusammenhängt, einschließlich abnormaler Darmflora, dysregulierter Immunantwort, Umweltproblemen und genetischen Varianten7. Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass Darmbakterien eine Rolle in der Anfangs- und Anwendungsphase von IBD8,9 spielen, was darauf hindeutet, dass die Korrektur der Darmdysbiose einen neuen Ansatz für die Therapie und/oder Erhaltungstherapie von IBD darstellen könnte.
Der Prototyp der fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) begann im alten China10. Im Jahr 1958 behandelten Dr. Eiseman und seine Kollegen erfolgreich vier Fälle von schwerer pseudomembranöser Enteritis mit Fäkalien von gesunden Spendern über Einläufe und eröffneten ein neues Kapitel in der modernen westlichen Medizin mit menschlichem Kot zur Behandlung menschlicher Krankheiten11. Clostridium difficile-Infektion (CDI) hat sich als Hauptursache für pseudomembranöse Enteritis12 erwiesen und FMT ist bei der Behandlung von CDI hochwirksam. In den letzten acht Jahren hat sich FMT zu einer Standardtherapie für die Behandlung von rezidivierendem CDI13 entwickelt, was zu weiteren Studien geführt hat, die die Rolle von FMT bei anderen Erkrankungen wie IBD untersuchen. In den letzten zwanzig Jahren haben zahlreiche Fallberichte und Kohortenstudien den Einsatz von FMT bei Patienten mit IBD14 dokumentiert. Eine Meta-Analyse, einschließlich 12 Studien, zeigte, dass 62% der Patienten mit Morbus Crohn (CD) eine klinische Remission nach FMT erreichten, und 69% der CD-Patienten hatten ein klinisches Ansprechen15. Trotz dieser ermutigenden Ergebnisse bleibt die Rolle von FMT bei der Behandlung von IBD ungewiss, und die Mechanismen, mit denen FMT Darmentzündungen lindert, sind kaum verstanden. Weitere Untersuchungen sind notwendig, bevor FMT sich dem aktuellen Arsenal von Behandlungsmöglichkeiten für IBD in den Kliniken anschließen kann.
In diesem Protokoll haben wir FMT auf IL-10-/- Mäuse angewendet, die spontan nach dem Absetzen eine Kolitis entwickeln und als Goldstandard gedient haben, um die multifaktorielle Natur von IBD16,17,18 widerzuspiegeln. IL-10−/−-Mäuse wurden ausgiebig zur Analyse der IBD-Ätiologie eingesetzt, da sie ähnliche molekulare und histologische Merkmale wie CED-Patienten aufweisen und die Krankheit wie Patienten mit einer Anti-TNFα-Therapie gelindert werden kann16. Alternde IL10−/−-Mäuse (>9 Monate alt) haben eine erhöhte Herzgröße und beeinträchtigte Herzfunktion im Vergleich zu altersentsprechenden Wildtyp-Mäusen19, was sie zu einem ausgezeichneten Modell für die Untersuchung von Colitis-induzierten Herzerkrankungen macht. Andere murine Modelle der Colitis, wie das Dextran-Natriumsulfat-Modell und das T-Zell-induzierte Colitis-Modell, können jedoch ebenfalls verwendet werden. Wir verabreichten fäkale Suspension über orale Gavage, die sich als wirksamer und besserer Weg als der Einlauf beim Menschen erwiesenhat 20.
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Protocol
Alle an Tieren durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch in Galveston genehmigt (Protokoll # 1512071A).
1. Sammlung von frischen Fäkalienpellets
- Bereiten Sie sterile Papiertücher, stumpfe Pinzetten und 50 ml konische Röhrchen vor.
- Einige Papierhandtücher und Pinzetten in separate Autoklavenbeutel geben und bei 180 °C bei trockener Hitze 30 min autoklavieren. Verwenden Sie auch sterile konische Schläuche. Wiegen Sie die konischen Röhrchen und notieren Sie ihr Gewicht auf die Röhrchen.
- Schalten Sie den Biosicherheitsschrank im Tierraum ein.
- Nehmen Sie einen autoklavierten, sauberen Mauskäfig ohne Einstreu und legen Sie ihn in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie die Abdeckung und den Essensständer und legen Sie sie in den Schrank.
- Legen Sie einige sterile Papiertücher auf den Boden des Käfigs und stellen Sie das Metallgestell wieder auf den Käfig.
- Identifizieren Sie altersgerechte Stuhlspender und platzieren Sie den Mauskäfig in der Biosicherheitswerkbank. Öffnen Sie den Käfig und greifen Sie vorsichtig eine Spendermaus (C57BL/6J) am Schwanz und legen Sie sie auf das Metallgestell oben auf dem sauberen Käfig.
- Stellen Sie die Käfigabdeckung auf das Gestell und warten Sie, bis das Tier (die Tiere) ihre Notdurft verrichtet haben.
HINWEIS: Legen Sie ein paar Maus-Wurfgeschwister gleichzeitig auf das Rack. - Sammeln Sie die fäkalen Pellets und legen Sie sie in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen. Poolen Sie die Pellets nach Geschlecht. Mischen Sie keine fäkalen Pellets, die von Männern und Frauen gesammelt wurden.
- Wiegen Sie das Röhrchen erneut und berechnen Sie das Gewicht der Kotpellets.
2. Herstellung der Fäkalsuspension
- Bereiten Sie eine sterile Lösung vor (10% Glycerin in normaler Kochsalzlösung).
- Fügen Sie 10 ml 10% Glycerin / normale Kochsalzlösung für jedes Gramm fäkale Pellets in das konische Röhrchen hinzu.
HINWEIS: Erhöhen Sie das Lösungsvolumen bei Bedarf auf 20 ml. Diese Studie verwendete auch 1 ml Lösung für jedes Pellet (5-10 mg). - Homogenisieren Sie die Mischung bei niedriger Geschwindigkeit mit einem Tischhomogenisator oder einem Mixer in einem Abzug, um den Kot (3 X 30 s) zu resuspendieren.
- Filtern Sie die fäkale Suspension durch 2 Schichten sterile Baumwollgaze (10,2 cm x 10,2 cm). Lagern Sie das Filtrat bis zu 6 h im Kühlschrank oder verpacken Sie es in sterile Kryofläschchen und lagern Sie es in einem -80 °C Gefrierschrank.
- Reinigen Sie den Homogenisator oder Mixer gründlich nach einem Standardverfahren.
3. Verabreichung von Stuhlsuspension durch Mundsonde
- Die gefrorene Fäkalsuspension auf Eis auftauen, wenn gefrorene Proben verwendet werden. Mischen Sie die aufgetaute fäkale Suspension durch Wirbeln.
- Die frische oder aufgetaute Fäkalsuspension in 1-ml-Spritzen geben.
HINWEIS: Jede Maus erhält insgesamt 200 μL fäkale Suspension, und jede IL-10-/- Maus in der Kontrollgruppe erhält 200 μL 10% Glycerin/ normale Kochsalzlösung17. - Wiegen Sie die Mäuse und wählen Sie die richtige Nadelgröße und das maximale Dosierungsvolumen.
HINWEIS: Verwenden Sie bei Mäusen mit einem Körpergewicht zwischen 20 und 25 Gramm eine 20 G 3,81 cm gebogene Sondennadel mit einer 2,25 mm Kugel. Bitte überprüfen Sie gavageneedle.com für weitere Informationen. - Testen Sie die Sondennadel, indem Sie die Länge von der Nasenspitze der Maus bis zum Xiphoidfortsatz (Unterseite des Brustbeins) messen. Füllen Sie die Spritze mit 10% Glycerin/Kochsalzlösung oder Fäkalsuspension und entfernen Sie Luftblasen in der Spritze und der Nadel.
HINWEIS: Wenn die Nadel länger als die Länge ist, setzen Sie eine Markierung auf Nadelschaft / Schlauch auf Höhe der Nase. Führen Sie die Nadel / den Schlauch nicht durch das Tier an diesem Punkt vorbei, um eine Magenperforation zu verhindern. - Setzen Sie einen Mauskäfig in die Biosicherheitswerkbank, entfernen Sie die Abdeckung des Kunststoffkäfigs und lassen Sie das Metallgestell an Ort und Stelle.
- Schnappen Sie sich eine Maus am Schwanz und legen Sie sie auf das Metallgestell. Halten Sie die Maus mit einer Hand am Schwanz und verwenden Sie den Daumen und Mittelfinger einer anderen Hand, um das Tier zurückzuhalten, indem Sie die Haut über die Schultern greifen. Auf diese Weise werden die Vorderbeine zur Seite gestreckt, wodurch verhindert wird, dass die Vorderfüße die Nadel herausdrücken. Strecken Sie den Kopf des Tieres vorsichtig nach hinten und halten Sie den Kopf mit einer Hand fest.
HINWEIS: Üben Sie die Handhabung der Maus, bis der Experimentator volles Vertrauen hat, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren. - Legen Sie die Sondennadel auf die Zunge im Mund. Bewegen Sie sich sanft entlang des oberen Gaumens, bis die Nadel die Speiseröhre erreicht. Führen Sie die Nadel sanft in einer Bewegung. Drücken Sie die Nadel nicht, wenn Widerstand zu spüren ist. Nehmen Sie die Nadel heraus und versuchen Sie es erneut.
- Sobald die Nadel richtig platziert und überprüft wurde, verabreichen Sie das Material langsam, indem Sie die an der Nadel befestigte Spritze drücken. Drehen Sie die Nadel nicht und drücken Sie sie nicht nach vorne, da dies die Speiseröhre reißen kann. Nach der Dosierung ziehen Sie die Nadel vorsichtig heraus.
- Bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück. Überwachen Sie das Tier für 5-10 Minuten, indem Sie nach Anzeichen von Atemnot oder Stress suchen. Überwachen Sie die Mäuse zwischen 12-24 h nach der FMT erneut.
4. Krankheitsüberwachung und Euthanasie
- Überwachen Sie die Mäuse längs auf IBD-Beginn durch okkultes Stuhlblut und / oder Koloskopie21. Bewerten Sie die Herzfunktion durch transthorakale Echokardiographie22,23.
- Euthanasieren Sie die Tiere durch Enthauptung unter einer tiefen Narkoseebene mit Isofluran (1% -4%).
- Das Blut in Mikrozentrifugenröhrchen mit Antikoagulans sammeln und bei 1000-2000 x g für 10 min in einer gekühlten Zentrifuge (4 °C) zentrifugieren. Speichern Sie das überstandene, bezeichnete Plasma in einem -80°C Gefrierschrank.
- Bereiten Sie nach der Euthanasierung den Mausdickdarm mit der Swiss-Roll-Technik24 für die histopathologische Analyse (H&E-Färbung)25 vor.
- Messung des natriuretischen B-Typ-Peptids (BNP) im Plasma unter Verwendung eines Enzymimmunoassays (EIA) Kits23.
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Representative Results
Wir führten eine gesunde Spender-FMT 3-mal (einmal im Monat für 3 Monate) an 2 Monate alten C57BL / 6J-Wildtyp- (WT) und IL-10-Knockout-Mäusen durch. Als Kotspender dienten altersgerechte C57BL/6J-Mäuse (Altersunterschied sollte <2 Monate betragen) und jedes Mal wurden frische Kotpellets verwendet. EIA-Assays zeigten, dass BNP im Plasma von IL-10-Mangelmäusen deutlich erhöht war und dass eine gesunde Spender-FMT den Anstieg der BNP-Spiegel signifikant abschwächte (Abbildung 1A, n = 5, p < 0,05). Die Echokardiographie zeigte eine signifikante Abnahme der linksventrikelförmigen Ejektionsfraktion (LVEF) bei den IL-10-/- Mäusen im Vergleich zu den WT-Mäusen ; der Rückgang wurde durch FMT signifikant aufgehoben (Abbildung 1B, n = 5, p < 0,05). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine gesunde Spender-FMT die durch Kolitis induzierte Herzfunktionsstörung mildert.
Abbildung 1. Die BNP-Hochregulierung und die LVEF-Abwärtsregulierung wurden durch fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) bei IL-10-Knockout-Mäusen gemildert. (A) Plasma-BNP-Konzentration (pg/ml) in Wildtyp- (WT) und IL-10-Knockout-Mäusen (KO), die mit Vehikel (Veh) oder FMT behandelt wurden. (B) LVEF von WT- und IL-10-KO-Mäusen, die mit/ohne FMT behandelt wurden. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD (n = 5) dargestellt. * p < 0,05 vs. WT-Mäuse, die mit Vehikel (Veh) behandelt wurden. # p < 0,05 vs. IL-10 KO Mäuse behandelt mit Veh. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Als innovative Prüfbehandlung ist FMT in den letzten Jahren zu einem heißen Thema bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen geworden, da die Dysbiose der kommensalen Mikrobiota an der Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten beteiligt ist, darunter IBD, Fettleibigkeit, Diabetes mellitus, Autismus, Herzerkrankungen und Krebs26. Obwohl der Mechanismus nicht bestimmt wurde, wird angenommen, dass FMT funktioniert, indem es eine neue biologische Flora aufbaut und den Verlust von Restbakterien verhindert. Das hierin vorgestellte Verfahren übernahm orale Sonde als Verabreichungsweg, was sich als wirksam erwiesen hat27. Wir haben uns für den oralen Weg entschieden, weil die orale Verabreichung am bequemsten und wirtschaftlichsten ist und von den meisten Patienten bevorzugt wird. Darüber hinaus hat sich FMT durch orale Kapseln in klinischen Studien als wirksamer Ansatz zur Behandlung rezidivierender CDI erwiesen28. Andere häufige obere GI-Lieferwege sind Nasensonde, Nasojejunalsonde, Jejunostomiesonde und Ösophagogastroduodenoskopie. Die häufigsten Verabreichungswege mit niedrigerem GI umfassen Koloskopie, kolonische transendoskopische enterale Schläuche (TET) und Rektumeinlauf. Der optimale Verlauf der FMT bleibt jedoch ungewiss20. Derzeit wird die Verabreichung des oberen GI als am besten geeignet angesehen29, aber es gibt keinen idealen Weg, der für alle Patienten geeignet ist.
Die Werkzeuge und Behälter, die bei der Sammlung von Kotpellets verwendet werden, sollten steril sein, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Fäkalpellets, die von Männern und Frauen gesammelt wurden, sollten aufgrund von Geschlechtsunterschieden in der Immunität nicht gemischt werden. In Tiermodellen und beim Menschen gibt es Unterschiede in der Mikrobiota zwischen den Geschlechtern30. Diese Geschlechtsunterschiede führen oft zu geschlechtsabhängigen Veränderungen der lokalen GI-Entzündung, der Immunität des Wirts und der Anfälligkeit für eine Reihe von entzündlichen Erkrankungen31. Die fäkalen Pellets können in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder 10-50% Glycerin / normaler Kochsalzlösung homogenisiert werden, und 10% Glycerin wurde weit verbreitet29. In dieser Studie wurden 10%, 20% und 50% Glycerin / Kochsalzlösung verwendet, und sie alle boten eine gute bakterielle Konservierung unter Gefrierbedingungen. Die Homogenisierung sollte mit niedriger Geschwindigkeit und in einem Abzug erfolgen, um die Exposition gegenüber lungengängigen Aerosolen, die bei diesem Prozess entstehen, zu minimieren. Die fäkale Suspension sollte durch zwei Schichten sterile Gaze oder einen 20 μm Nylonfilter gefiltert werden, um große Partikel zu entfernen, die die Nadeln verstopfen könnten. Die gefilterte fäkale Suspension zur sofortigen Verwendung sollte in einen Kühlschrank gestellt werden, der Rest kann aliquotiert und in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert werden. Das Einfrieren ist besonders notwendig, wenn die Fäkalien von menschlichen Spendern stammen. Meta-Analysen haben ergeben, dass gefrorene FMT bei Patienten mit rezidivierendem CDI32,33,34 genauso wirksam ist wie frische FMT. Cui et al. beobachteten jedoch auch, dass 6 Monate nach FMT die Ansprechrate bei CD-Patienten in der Gruppe der frischen fäkalen Bakterien um 26,7% höher war als in der Gruppe der gefrorenen fäkalen Bakterien35, was darauf hindeutet, dass frische FMT in einigen Fällen eine bessere Wahl ist als gefrorene FMT.
Die optimale Dosis und Häufigkeit der FMT-Infusion sind in diesem Stadium noch unbekannt. Studien haben gezeigt, dass die Dauer des klinischen Ansprechens auf eine einzelne FMT-Behandlung vorübergehend und unzureichend ist, um grundlegende Veränderungen in der Empfängerdarmflora zu induzieren, und dass eine sequentielle FMT-Therapie erforderlich ist, um die CD-Remissionaufrechtzuerhalten 36,37. Wir führten FMT einmal im Monat für 3 aufeinanderfolgende Monate durch, und unsere Daten zeigten eine gute therapeutische Wirksamkeit. In einer laufenden Studie führen wir 12 Monate lang monatliche FMT in einer Gruppe von IL-10-defizienten Mäusen durch und werden am Ende der Studie Darmmikrobiota, Darmentzündung und Herzfunktion bewerten. Wir erwarten, dass die sequentielle FMT eine bessere therapeutische Wirksamkeit zeigt als die einzelne FMT.
Während FMT ein enormes Potenzial zur Behebung gestörter Darmmikrobiota bietet und Sicherheitsdaten auftauchen38,39, fehlt es immer noch an medizinischen Beweisen für die Sicherheit, die Art der Verabreichung, die bakterielle Dosis, die Häufigkeit der Verabreichung und die Langzeitprognose von FMT zur Behandlung menschlicher Krankheiten. Am 12. März 2020 gab die FDA eine Sicherheitswarnung heraus, dass FMT mit einem potenziellen Risiko für schwere oder lebensbedrohliche Infektionen verbunden ist40. Die Infektionen wurden durch enteropathogene E. coli und Shiga-Toxin produzierende E. coli verursacht, und das FMT-Produkt wurde von einer Stuhlbankgesellschaft mit Sitz in den Vereinigten Staaten geliefert. Daher sind weitere mechanistische Studien und Langzeitbeobachtungen an Tieren noch erforderlich, um den Einsatz von FMT als Behandlungsmodalität bei Patienten wirklich zu verstehen. FMT bei Nagetieren wird ein leistungsfähiges Werkzeug in der Mikrobiomforschung bleiben, was das FMT-Verfahren schließlich zu einer leicht zugänglichen Behandlung mit geringerer Toxizität als andere synthetische Drogen machen könnte.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01 HL152683 und R21 AI126097 an Q. Li) und durch American Heart Association Grant-in-Aid 17GRNT33460395 (an Q. Li) (heart.org) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| Blunt end forceps | Knipex | 926443 | |
| Brain natriuretic peptide EIA kit | Sigma | RAB0386 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Lab | 000664 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Conical tubes | ThermoFisher | 339650 | |
| Curved feeding Needles | Kent Scientific | FNC-20-1.5-2 | |
| GLH-115 homogenizer | Omni International | GLH-115 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G5516 | |
| IL-10 knockout mice | Jackson Lab | 004366 | |
| Isoflurane | Piramal Critical care | NDC66794-017-10 | |
| USP normal saline | Grainger | 6280 | |
| Vaporizer | Euthanex Corp. | EZ-108SA |
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