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Bioengineering

बकरी के इन्फ्रापेटेलर फैट पैड से मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का अलगाव, विस्तार और भेदभाव

Published: August 2, 2022 doi: 10.3791/63617
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2
1Department of Biological Sciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Kanpur, 2The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine, Indian Institute of Technology-Kanpur, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

इन्फ्रापेटलर वसा पैड मेसेनकाइमल स्टेम सेल (आईएफपी-एमएससी) को घुटने के जोड़ के इन्फ्रापेटलर वसा पैड से आसानी से अलग किया जा सकता है। वे विट्रो में अच्छी तरह से प्रसार करते हैं, सीएफयू-एफ कॉलोनियों का निर्माण करते हैं, और एडिपोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और ओस्टोजेनिक वंशों में अंतर करते हैं। इसमें, बकरी के जोड़ से आईएफपी-एमएससी के अलगाव, विस्तार और विभेदन के लिए पद्धति प्रदान की गई है।

Abstract

आईएफपी, घुटने के जोड़ में मौजूद है, एमएससी के एक आशाजनक स्रोत के रूप में कार्य करता है। आईएफपी एक आसानी से सुलभ ऊतक है क्योंकि इसे आर्थोस्कोपिक प्रक्रियाओं और घुटने के प्रतिस्थापन सर्जरी के दौरान नियमित रूप से बचाया और त्याग दिया जाता है। इसके अतिरिक्त, इसका निष्कासन न्यूनतम दाता साइट रुग्णता से जुड़ा हुआ है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आईएफपी-एमएससी इन विट्रो विस्तार के दौरान अपनी प्रसार क्षमता नहीं खोते हैं और आयु-स्वतंत्र ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमता रखते हैं। आईएफपी-एमएससी में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी (बीएमएससी) और वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एडीएससी) की तुलना में बेहतर चोंड्रोजेनिक भेदभाव क्षमता होती है। यद्यपि ये कोशिकाएं वृद्ध और रोगग्रस्त रोगियों से आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन उनकी प्रभावशीलता सीमित है। इसलिए, बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में उनकी प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए स्वस्थ दाताओं से आईएफपी-एमएससी का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। जैसा कि एक स्वस्थ मानव दाता तक पहुंच चुनौतीपूर्ण है, पशु मॉडल मौलिक समझ को सक्षम करने के लिए एक बेहतर विकल्प हो सकता है। कुत्ते, घोड़े, भेड़ और बकरी जैसे बड़े जानवर ट्रांसलेशनल अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इनमें से, बकरी एक पसंदीदा मॉडल हो सकती है क्योंकि बकरी के दमघोंटू जोड़ में मानव घुटने के जोड़ के सबसे करीब शरीर रचना होती है। इसके अलावा, बकरी-आईएफपी ऊतक पुनर्जनन अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक उच्च एमएससी संख्याओं को पूरा कर सकता है। इसके अलावा, पशु अनुसंधान के लिए कम लागत, उपलब्धता और 3 आर सिद्धांतों के अनुपालन ने उन्हें एक आकर्षक मॉडल बना दिया है। यह अध्ययन आईएफपी-एमएससी को बकरियों के घुटन वाले जोड़ से अलग करने और उनके विस्तार और भेदभाव के लिए इन विट्रो कल्चर स्थितियों को अलग करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है। बकरी से सड़न रोकने योग्य रूप से पृथक आईएफपी को धोया गया, कीमा मारा गया, और एंजाइमेटिक रूप से पचाया गया। निस्पंदन और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एकत्रित कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था। ये कोशिकाएं अनुयायी थीं, एमएससी जैसी आकृति विज्ञान थीं, और उल्लेखनीय क्लोनोजेनिक क्षमता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, उन्होंने एडिपोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और ओस्टोजेनिक वंशों में विभेदित किया, जो उनकी बहुशक्ति का प्रदर्शन करते हैं। निष्कर्ष में, अध्ययन एमएससी के अलगाव और विस्तार को दर्शाता है, जो ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों में क्षमता दिखाता है।

Introduction

मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 में सेल-आधारितउपचारों के लिए एक आकर्षक उम्मीदवार हैं। उन्हें अस्थि मज्जा, गर्भनाल, प्लेसेंटा, दंत लुगदी और चमड़े के नीचे वसा ऊतक जैसे विभिन्न ऊतक स्रोतों से काटा जा सकताहै। हालांकि, चूंकि वयस्कों में स्टेम कोशिकाओं की उपलब्धता सीमित है और उनकी अलगाव प्रक्रिया अक्सर आक्रामक होती है (जिसके परिणामस्वरूप दाता साइट रुग्णता होती है), एक वैकल्पिक स्टेम सेल स्रोत होना वांछनीय है जो इन चुनौतियों को दरकिनार कर सकता है।

घुटने का जोड़ विभिन्न सेल प्रकारों का एक डिपो है, जैसे कि इन्फ्रापेटलर वसा पैड-व्युत्पन्न एमएससी, श्लेष झिल्ली-व्युत्पन्न एमएससी, श्लेष द्रव-व्युत्पन्न एमएससी, लिगामेंट फाइब्रोब्लास्ट, आर्टिकुलर चोंड्रोसाइट्स, आदि 4,5,6। इन कोशिकाओं में मस्कुलोस्केलेटल ऊतक इंजीनियरिंग-आधारित अनुसंधान में व्यापक रूप से पता लगाने की क्षमता है। घुटने के जोड़ में स्थित एडीपोज डिपो, जिसे इन्फ्रापेटलर फैट पैड (आईएफपी) या होफा के वसा पैड के रूप में जाना जाता है, एमएससी डिपो का एक आशाजनक और वैकल्पिक विकल्प है। आईएफपी एमएससी का अपेक्षाकृत आसानी से सुलभ और चिकित्सकीय रूप से उपलब्ध स्रोत है, क्योंकि इसे नियमित रूप से घुटने की आर्थ्रोस्कोपी या ओपन नी सर्जरी के दौरान सर्जिकल कचरे के रूप में निकाला और फेंक दिया जाता है। आईएफपी को हटाना न्यूनतम दाता-साइट रुग्णता से जुड़ा हुआ है, जो इसे एक आकर्षक ऊतक स्रोत भी बनाता है। एक समान फेनोटाइपिक प्रोफाइल होने के बावजूद, आईएफपी (आईएफपी-एमएससी) के एमएससी ने अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (बीएम-एमएससी) 6 की तुलना में क्लोनोजेनिक क्षमता को बढ़ाया है और चमड़े के नीचे वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एडीएससी) 7 की तुलना में बेहतर प्रोलिफेरेटिव क्षमता है। दिलचस्प बात यह है कि श्लेष द्रव-व्युत्पन्न एमएससी (एसएफ-एमएससी) की तुलना में, आईएफपी-एमएससी देर से मार्ग पर अपनी प्रोलिफेरेटिव क्षमता नहीं खोते हैं, न ही देर से मार्ग पर दोगुना समय बढ़ता है। इससे पता चलता है कि, सेल विस्तार के दौरान, आईएफपी-एमएससी अपने प्रसार दर8 से समझौता किए बिना इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं। हाल के अध्ययनों ने यह भी सुझाव दिया है कि आईएफपी-एमएससी में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी (बीएमएससी) और वसा-व्युत्पन्न एमएससी (एडीएससी) की तुलना में बेहतर चोंड्रोजेनिक भेदभाव क्षमता होती है, संभवतः आर्टिकुलर कार्टिलेज के लिए उनकी शारीरिक निकटता के कारण, उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग 6,7,9,10 के लिए उनकी उपयुक्तता का संकेत देती है। इसके अलावा, उनके पास आयु-स्वतंत्र ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमताभी है। आईएफपी-एमएससी के इंट्रा-आर्टिकुलर इंजेक्शन को पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) 12,13 के रोगियों में दर्द को कम करने और घुटने के जोड़ों के कार्यों में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, रोग संबंधी स्थितियों के दौरान भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति में आईएफपी-एमएससी के मजबूत इम्यूनोसप्रेसिव प्रतिक्रियाओं और बेहतर इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों कीभी सूचना दी गई है।

आईएफपी-एमएससी एमएससी का एक आशाजनक और वैकल्पिक स्रोत हैं; हालांकि, ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा में उनके चिकित्सीय लाभ अपेक्षाकृत कम खोजे गए हैं। आईएफपी-एमएससी पर मौजूदा अध्ययनों ने मानव दाताओं से कोशिकाओं का प्रमुख रूप से उपयोग किया है। इनमें से, कुछ हालिया अध्ययनों ने स्वस्थ मानव दाताओं (गैर-गठिया रोगियों, 17-60 वर्ष की आयु) 6,14 से आईएफपी-एमएससी की जांच की है, जबकि अधिकांश अध्ययनों ने कुल घुटने की प्रतिस्थापन सर्जरी (रोगग्रस्त रोगी, 70-80 वर्ष की आयु) से गुजरने वाले वृद्ध रोगियों से आईएफपी-एमएससी का उपयोग किया है। चूंकि उम्र और बीमारी दोनों को स्टेम कोशिकाओं के सामान्य कामकाज (कार्यात्मक क्षमता की कम संख्या और हानि) को बदलने के लिए जाना जाता है, इससे संभावित रूप से एमएससी-आधारित अध्ययन 7,15,16,17 के परिणाम में विसंगतियां हो सकती हैं। इसके अलावा, पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों (जैसे, गठिया और मोटापा) वाले रोगियों से आईएफपी-एमएससी का उपयोग भी विट्रो में स्वस्थ कोशिकाओं की बुनियादी विशेषताओं को समझने में कठिनाई पैदा करता है, जिससे एमएससी-आधारित उपचारों के विकास में एक सीमित कारक के रूप में कार्य किया जाता है। इन मुद्दों को दूर करने के लिए, स्वस्थ दाताओं से आईएफपी-एमएससी का उपयोग महत्वपूर्ण है। जैसा कि एक स्वस्थ मानव दाता तक पहुंच चुनौतीपूर्ण है, पशु मॉडल एक बेहतर विकल्प हो सकता है। इस संबंध में, कुछ अध्ययन हैं जहां आईएफपी को चूहों से अलग किया गया है। हालांकि, सामान्य चूहों में वसा पैड के छोटे आकार के कारण, कई जानवरों के वसा ऊतकों को विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को निष्पादित करने के लिए पर्याप्त ऊतक प्राप्त करने के लिए जोड़ा गयाहै। इसलिए, एक बड़े पशु मॉडल की आवश्यकता है, जो कोशिकाओं की अधिक संख्या की आवश्यकता को पूरा कर सकता है और साथ ही पशु अनुसंधान में 3 आर सिद्धांतों (परिष्कृत, प्रतिस्थापित और कम) का अनुपालन करसकता है। बड़े जानवरों के उपयोग का ट्रांसलेशनल अनुसंधान में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। विशेष रूप से, मस्कुलोस्केलेटल ऊतक इंजीनियरिंग में, कुत्तों, सूअरों, भेड़, बकरियों और घोड़ों जैसे बड़े जानवरोंकी एक श्रृंखला की जांच की गई है। बकरी (कैपरा एगग्रस हिर्कस) बड़े जानवर का एक उत्कृष्ट विकल्प है क्योंकि इसके दमघोंटू जोड़ में मानव घुटने के जोड़ के सबसे करीब शरीर रचना22,23,24 है। बकरियों की सबकॉन्ड्रल हड्डी ट्रेब्युलर संरचना और सबकॉन्ड्रल हड्डी की मोटाई मनुष्यों के समान होती है, और हड्डी के उपास्थि का अनुपात भी मनुष्यों के करीब बतायाजाता है। इसके अलावा, बकरियों को दुनिया भर में व्यापक रूप से पालतू बनाया गया है, जिससे वे कंकाल रूप से परिपक्व होने पर आसानी से उपलब्ध हो जाते हैं। इसके अलावा, कम रखरखाव लागत और आसान हैंडलिंग ने उन्हें अनुसंधान के लिए एक आकर्षक पशु मॉडल बना दियाहै।

वर्तमान अध्ययन में, आईएफपी-एमएससी को कैप्रा एगाग्रस हिर्कस (बकरी) के घुटन वाले जोड़ से अलग करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल और उनके विस्तार और भेदभाव के लिए इन विट्रो कल्चर स्थितियों का प्रदर्शन किया गया है। पृथक कोशिकाएं अनुयायी हैं, एमएससी जैसी आकृति विज्ञान है, सीएफयू-एफ (कॉलोनी बनाने वाली इकाई-फाइब्रोब्लास्ट) कॉलोनियां बनाती हैं, और एडिपोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमता रखती हैं। इसलिए, आईएफपी-एमएससी बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए एमएससी के वैकल्पिक स्रोत के रूप में क्षमता दिखाते हैं।

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Protocol

प्रोटोकॉल बकरियों से आईएफपी-एमएससी के अलगाव पर आधारित है। बकरी आईएफपी और रक्त एक स्थानीय बूचड़खाने से एकत्र किए गए थे। चूंकि इस तरह के ऊतक संग्रह एक संस्थागत पशु आचार समिति के दायरे से बाहर हैं, इसलिए नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी।

1. बकरी के घुटने के ऊरु जोड़ से आईएफपी-एमएससी का अलगाव

  1. बकरी फेमोरोटिबियल जोड़ (नमूना) एकत्र करें जिसमें पिछले अंगों के ऊरु और टिबियल क्षेत्रों में से प्रत्येक ~ 15 सेमी शामिल है। तुरंत नमूने को एक निष्फल नमूना संग्रह बॉक्स में रखें और इसे आगे की प्रक्रिया के लिए प्रयोगशाला में परिवहन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रक्रिया के दौरान निष्फल सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करके नमूनों को जैव सुरक्षा कैबिनेट में सड़नैदा रूप से संसाधित करें (चित्रा 1, चरण 1)।
  2. नमूने को 150 मिमी पेट्री डिश पर रखें और संदूषण से बचने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं (5 μg / mL एम्फोटेरिसिन बी, 200 यू / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 50 μg / mL सिप्रोफ्लोक्सासिन) के साथ पूरक ऑटोक्लेव ्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें। हमेशा सुनिश्चित करें कि नमूना पीबीएस का उपयोग करके हाइड्रेटेड रखा गया है।
  3. नमूने के शारीरिक क्षेत्रों की सावधानीपूर्वक जांच करें। संयुक्त कैप्सूल तक पहुंच में आसानी के लिए, सुनिश्चित करें कि दोनों लंबी हड्डियों से अतिरिक्त ऊतक पूरी तरह से हटा दिए गए हैं (चित्रा 1, चरण 2)।
  4. इसे प्राप्त करने के लिए, सबसे पहले, एक हाथ से फीमर हड्डी की अंतिम सतह को पकड़ें और, तेज कैंची के साथ, जोड़ की ओर अनुदैर्ध्य रूप से काटें। प्रक्रिया के दौरान हड्डी से आसपास की मांसपेशियों और वसा ऊतक को हटा दें। सावधान रहें कि तत्काल संयुक्त कैप्सूल के आसपास का ऊतक शुरू में अबाधित रहता है।
  5. इसी तरह, नमूने के टिबियल छोर पर एक और चीरा लगाएं और टिबियल हड्डी से मांसपेशियों और वसा ऊतक को हटा दें। सुनिश्चित करें कि दोनों लंबी हड्डियां पूरी तरह से उजागर हैं और इस चरण के बाद संयुक्त कैप्सूल स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है (चित्रा 1, चरण 3)।
  6. इसके बाद, अभिव्यक्ति जोड़ को खोलने के लिए सिनोवियम झिल्ली के दोनों ओर से एक चीरा लगाएं (चित्रा 1, चरण 4)। स्टरलाइज़्ड कैंची और फोर्सप्स के एक ताजा बैच का उपयोग करके सिनोवियम झिल्ली और पेटेलर लिगामेंट्स दोनों से पेटेला को काट लें। अलग पेटेला को तुरंत पीबीएस युक्त पेट्री डिश में रखें (चित्रा 1, चरण 5)।
  7. कैंची और फोर्स का उपयोग करके पेटेला की आंतरिक सतह पर मौजूद पूरे वसा पैड को हटा दें और वसा पैड को एक और ताजा पेट्री डिश (चित्रा 1, चरण 6) में इकट्ठा करें। स्केलपेल का उपयोग करके एकत्रित वसा पैड कीमा करें। ~ 2-3 मिमी के सबसे छोटे संभव वसा टुकड़े / खंड प्राप्त करने के लिए आवश्यक अन्य सर्जिकल उपकरण (जैसे, कैंची या सर्जिकल ब्लेड) शामिल करें।
    नोट: कोशिकाओं की अच्छी उपज के परिणामस्वरूप अच्छी कीमा महत्वपूर्ण है। ऊतक को हमेशा हाइड्रेटेड रखें और अलगाव प्रक्रिया के किसी भी चरण में इसे सूखने न दें।
  8. स्पैटुला का उपयोग करके कीमा ऊतक को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे टेस्ट ट्यूब मिक्सर में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पीबीएस के साथ धोएं। धोने के चरण को 3x, 15 मिनट दोहराएँ।
  9. एंजाइमेटिक पाचन के लिए, डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडिया (डीएमईएम कम ग्लूकोज) में कीमा ऊतक (~ 5 ग्राम) को इनक्यूबेट करें जिसमें 1.5 मिलीग्राम / एमएल टाइप द्वितीय कोलेजनेज (20 एमएल) होता है और 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2% एफबीएस के साथ पूरक होता है।
    नोट: एक टेस्ट ट्यूब मिक्सर में ~ 15 रोटेशन प्रति मिनट (आरपीएम) पर पाचन करें।
  10. पचे हुए ऊतक को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और किसी भी बिना पचे ऊतक को हटाने के लिए इसे सेल स्ट्रेनर (70 μm) के माध्यम से फ़िल्टर करें। 5 मिनट के लिए 150 x g पर 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छानना। सतह पर तैरने वाला निकालें और गोली को डीएमईएम कम ग्लूकोज के साथ कम से कम 2 गुना धो लें।
    नोट: फैलाव से बचने के लिए पचे हुए ऊतक को धीरे-धीरे छन्नी में डालें। एक अच्छा गोली प्राप्त करने के लिए कम मात्रा वाले सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (15 एमएल) का उपयोग करें।
  11. पूर्ण डीएमईएम मीडिया (डीएमईएम कम ग्लूकोज 10% एफबीएस और एंटीबायोटिक दवाओं [2.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन, 100 U / mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 μg / mL सिप्रोफ्लोक्सासिन] के साथ पूरक डीएमईएम कम ग्लूकोज) में प्राप्त सेल पेलेट को पुन: निलंबित करें, जिसे बाद के चरणों में प्रोटोकॉल में विस्तार मीडिया के रूप में संदर्भित किया जाता है।
  12. कोशिकाओं को 150 मिमी पेट्री व्यंजनों पर बीज दें और उन्हें 5 एनजी / एमएल मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ) और 50 μg / mL 2-फॉस्फो-एल-एस्कॉर्बिक एसिड ट्राइसोडियम नमक के साथ पूरक विस्तार मीडिया में कल्चर करें। कोशिकाओं को पालन करने और प्रसार करने की अनुमति देने के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। दैनिक आधार पर कोशिकाओं के लगाव और विकास की निगरानी करें।

2. पृथक कोशिकाओं का रखरखाव और विस्तार

  1. हर 3 दिनों में मीडिया को बदलें जब तक कि कोशिकाएं संकुचित न हो जाएं। ताजा 5 एनजी / एमएल बीएफजीएफ और 50 μg / mL 2-फॉस्फो-एल-एस्कॉर्बिक एसिड ट्राइसोडियम नमक को सीधे पेट्री डिश में जोड़ें। कोशिकाओं के 80% -90% कंफ्लुएंट होने के बाद, कोशिकाओं को उपसंस्कृति।
    नोट: प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के दौरान गैर-अनुयायी संस्थाओं को हटा दें। यदि इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद तेल की बूंदें देखी जाती हैं, तो कोशिकाओं को पीबीएस 1 एक्स के साथ धो लें और फिर पेट्री डिश में ताजा मीडिया जोड़ें। प्रत्येक मीडिया बदलने से पहले पीबीएस धोने के साथ जारी रखें जब तक कि तेल की बूंदें पूरी तरह से हटा न जाएं।
  2. कोशिकाओं का उप-संवर्धन: पेट्री डिश से विस्तार मीडिया को हटा दें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 1x धो लें। डिश में 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के 4 एमएल जोड़ें और 4 मिनट के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: 7 दिनों के भीतर सामंजस्य (80% -90%) हासिल किया जाता है। ट्रिप्सिनाइजेशन के दौरान पेट्री डिश की पूरी सतह पर ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान को समान रूप से वितरित करें।
  3. प्लेट को साइड में टैप करके और माइक्रोस्कोप के नीचे देखकर कोशिकाओं को हटा दें ताकि यह पुष्टि हो सके कि सभी कोशिकाएं अलग हैं। विस्तार मीडिया की समान मात्रा (4 एमएल) जोड़ने के बाद ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
  4. एक ताजा 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में पिपेट का उपयोग करके विघटित कोशिकाओं को इकट्ठा करें और आरटी में 5 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. आगे के विस्तार के लिए 1 x 104 कोशिकाओं / सेमी2 के सीडिंग घनत्व पर 150 मिमी पेट्री व्यंजनों में मानक सेल गिनती विधि और उपसंस्कृति का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। सभी परखों के लिए, मार्ग संख्या पी 2-पी 5 की कोशिकाओं के एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर का उपयोग करें।
    नोट: क्रायोप्रिजर्व अतिरिक्त कोशिकाओं का संरक्षण करते हैं।

3. कॉलोनी बनाने की परख (सीएफयू-एफ) का उपयोग करके आईएफपी-एमएससी की क्लोनोजेनिक क्षमता का मूल्यांकन

  1. सीएफयू-एफ परख के लिए, 50-100 कोशिकाओं / सेमी2 के सीडिंग घनत्व पर 6-वेल टिशू कल्चर प्लेट में विस्तार मीडिया में कोशिकाओं को बीज दें। 3 mL का अंतिम आयतन प्राप्त करने के लिए मीडिया जोड़ें।
    नोट: परख और उपचार के लिए सेल एकाग्रता को अनुकूलित करें।
  2. मानक संस्कृति स्थितियों के तहत 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर12 दिनों के लिए कोशिकाओं को कल्चर करें ताकि कोशिकाओं को उपनिवेश बनाने की अनुमति मिल सके। हर 3 दिन में मीडिया बदलें। मीडिया को बदलते समय सौम्य रहें।
  3. 12 दिनों के बाद, कॉलोनियों को पीबीएस के साथ 1x कुल्ला करें और RT पर 20 मिनट के लिए 20% मेथनॉल का उपयोग करके उन्हें ठीक करें। RT पर 20 मिनट के लिए क्रिस्टल वायलेट डाई (20% मेथनॉल में 0.5% [w/v]) के साथ कॉलोनियों को दाग दें। उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अलग-अलग कॉलोनियों की गणना करें।
    नोट: एक कॉलोनी को 50 से अधिक कोशिकाओं के समूह के रूप में परिभाषित किया गया है।

4. आईएफपी-एमएससी की विभेदन क्षमता

  1. IFP-MSCs के एडिपोजेनिक विभेदन को प्रेरित करना
    1. एडिपोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं को 24-वेल टिशू कल्चर प्लेट में25 x 103 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व पर बीज दें। 500 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए मीडिया जोड़ें। 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 °C पर कोशिकाओं को कल्चर करें।
    2. एक दिन पोस्ट-कॉन्फ्लुएंसी, विस्तार माध्यम को 500 μL एडिपोजेनिक भेदभाव मीडिया के साथ बदलें। कोशिकाओं को सामंजस्य तक पहुंचने के लिए लगभग 2 दिनों की आवश्यकता होती है।
    3. विस्तार मीडिया (डीएमईएम + 10% एफबीएस + 2.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन, 100 U / mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 μg / mL सिप्रोफ्लोक्सासिन) को 25 mM D (+)-ग्लूकोज, 10 μg / mL इंसुलिन, 1 μM डेक्सामेथासोन, और 100 μM इंडोमेथासिन के साथ पूरक करके एडिपोजेनिक भेदभाव मीडिया तैयार करें।
      नोट: भेदभाव मीडिया 1 महीने के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर अस्थिर है; इसलिए, जब भी आवश्यक हो, मीडिया तैयार करें।
    4. 25 एमएम डी (+) ग्लूकोज के साथ पूरक विस्तार मीडिया में संवर्धित कोशिकाओं को अप्रेरित नियंत्रण के रूप में देखें। 14 दिनों के लिए हर 3 दिन में मीडिया बदलें। 14 दिनों के अंत में, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 1x धो लें। न्यूट्रल बफर्ड फॉर्मेलिन (एनबीएफ; पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड) का उपयोग करके कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ठीक करें।
    5. निर्धारण के बाद, कुओं को आसुत जल के साथ 1x धो लें और फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए 60% आइसोप्रोपेनोल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। आइसोप्रोपेनॉल को हटाने के बाद, आरटी में 5 मिनट के लिए ऑयल रेड ओ डाई के कामकाजी घोल के 500 μL के साथ कोशिकाओं को इंजेक्ट करके लिपिड बूंदों को दाग दें। अनबाउंड डाई को हटाने के लिए कुओं को आसुत पानी से 1x धोएं और उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाएं।
      नोट: 99% आइसोप्रोपेनोल के 100 एमएल में 300 मिलीग्राम ओआरओ को भंग करके ऑयल रेड ओ (ओआरओ) का स्टॉक समाधान तैयार करें। काम का समाधान तैयार करने के लिए, स्टॉक ओआरओ के तीन भागों और आसुत जल के दो हिस्सों को मिलाएं और इसे 10 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण करने दें। मिश्रण को 0.2 μm फ़िल्टर पेपर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। काम करने का समाधान उपयोग करने के लिए तैयार है। स्टॉक समाधान को अंधेरे में 1 महीने के लिए आरटी पर तैयार और संग्रहीत किया जा सकता है, जबकि काम करने वाले समाधान को प्रत्येक उपयोग / धुंधला होने से पहले ताजा तैयार करने की आवश्यकता होती है।
  2. IFP MSCs के चोंड्रोजेनिक विभेदन को प्रेरित करना
    1. बकरी प्लाज्मा का अलगाव:
      1. आसुत जल में 3.4% (डब्ल्यू / वी) सोडियम-साइट्रेट तैयार करें। 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तैयार सोडियम साइट्रेट समाधान के 5 एमएल जोड़ें।
      2. एक ही ट्यूब में ताजा पृथक बकरी के रक्त के 45 एमएल एकत्र करें। थक्के को रोकने और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगशाला में परिवहन करने के लिए सोडियम साइट्रेट के साथ रक्त को अच्छी तरह से मिलाने के लिए तुरंत ट्यूब को झुकाएं।
      3. एकत्रित बकरी के रक्त को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट (प्लाज्मा) को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्लाज्मा को 0.2 μm फ़िल्टर, एलिकोट के माध्यम से फ़िल्टर करें, और आगे के उपयोग के लिए -20 °C पर स्टोर करें।
        नोट: नमूने को संभालते समय 2-8 डिग्री सेल्सियस का तापमान बनाए रखें। प्लाज्मा के फ्रीज-पिघलने चक्र को कम करना महत्वपूर्ण है।
    2. विस्तारित कोशिकाओं को 80% -90% कंफ्लुएंसी तक कल्चर करें, ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें, और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मार दें। प्लाज्मा समाधान के प्रति 50 μL में 2 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर बकरी प्लाज्मा में गोली को पुन: निलंबित करें।
    3. एक निष्फल 90 मिमी पेट्री डिश पर प्लाज्मा युक्त कोशिकाओं (50 μL) की एक बूंद जोड़ें और फिर 0.3% (w / v) की अंतिम एकाग्रता पर कैल्शियम क्लोराइड जोड़ें। क्रॉस-लिंक्ड प्लाज्मा हाइड्रोगेल बनाने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्मित हाइड्रोगेल को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, हाइड्रोगेल को चोंड्रोजेनिक मीडिया युक्त 24-वेल टिशू कल्चर प्लेटों में स्थानांतरित करें।
    5. डीएमईएम कम ग्लूकोज को 10 एमएम 4-(2-हाइड्रॉक्सीइथिल)-1-पिपेराजिनिथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस), 1.25 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), 1 एमएम प्रोलाइन, 50 μg/mL 2-फॉस्फो-एल-एस्कॉर्बिक एसिड ट्राइसोडियम नमक, 100 nM डेक्सामेथासोन, 1x इंसुलिन, ट्रांसफरिन, सोडियम सेलेनाइट + लिनोलेइक-बीएसए (आईटीएस + 1) के साथ पूरक करके चोंड्रोजेनिक मीडिया तैयार करें। और 10 एनजी / एमएल ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर- ए 1 (टीजीएफ-ए1)।
    6. पूर्ण डीएमईएम मीडिया (डीएमईएम कम ग्लूकोज के साथ 10% एफबीएस और एंटीबायोटिक्स [2.5 μg/mL एम्फोटेरिसिन, 100 U/mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 μg/mL सिप्रोफ्लोक्सासिन]) में संवर्धित हाइड्रोगेल को टीजीएफ-ए1 के बिना अनियंत्रित नियंत्रण माना जाता है। 14 दिनों के लिए हर 3 दिन में मीडिया बदलें।
    7. प्लाज्मा हाइड्रोगेल में कोशिकाओं के चोंड्रोजेनिक भेदभाव के 14 दिनों के बाद, हाइड्रोगेल को पीबीएस 3 एक्स के साथ 5 मिनट के लिए धोएं और फिर 3 घंटे के लिए एनबीएफ में नमूने ठीक करें।
      चेतावनी: फॉर्मलाडेहाइड एक संभावित कार्सिनोजेन है और साँस लेने पर नाक, गले और फेफड़ों में जलन पैदा कर सकता है। फॉर्मलाडेहाइड से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को फ्यूम हुड में करें।
    8. एनबीएफ को हटा दें, हाइड्रोगेल को पीबीएस 3 एक्स के साथ 5 मिनट के लिए धोएं, और फिर रात भर आरटी पर 35% (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज में इनक्यूबेट करें ताकि समाधान पूरी तरह से नमूनों में अवशोषित हो सके। 3 घंटे के लिए इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में हाइड्रोगेल को अनुकूलित करें। तरल नाइट्रोजन के तहत सिलिकॉन मोल्ड का उपयोग करके ओसीटी यौगिक में नमूने एम्बेड करें।
    9. एक क्रायोटोम का उपयोग करके जिलेटिन-लेपित ग्लास स्लाइड पर 10-12 μm की मोटाई पर नमूने काटें और उन्हें भविष्य के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। चोंड्रोजेनिक भेदभाव के बाद बाह्य मैट्रिक्स की उपस्थिति या जमाव की जांच करने के लिए, एल्सियन ब्लू और सैफ्रानिन-ओ डाई के साथ वर्गों को दाग दें, जो सल्फेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स से जुड़ते हैं।
      नोट: एल्सियन ब्लू डाई तैयार करने के लिए, 0.1 एन एचसीएल के 100 एमएल में 1 ग्राम एल्सियन ब्लू डाई को घोलें और रात भर टेस्ट ट्यूब मिक्सर में अच्छी तरह से मिलाएं। समाधान को अंधेरे में 1 महीने के लिए आरटी पर संग्रहीत किया जा सकता है। सैफ्रानिन-ओ डाई तैयार करने के लिए, 100 एमएल आसुत जल में 0.1 ग्राम सैफ्रानिन-ओ डाई को घोलें और रात भर टेस्ट ट्यूब मिक्सर में अच्छी तरह मिलाएं।
    10. एल्सियन ब्लू स्टेनिंग के लिए, हाइड्रोगेल सेक्शन को 5 मिनट के लिए आसुत पानी से 1x धो लें। अनुभागों को ठीक करने के लिए, स्लाइड्स में 4% एनबीएफ जोड़ें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    11. खंड 1x को आसुत जल से 5 मिनट के लिए धोएं और फिर 30 सेकंड के लिए 0.1 N HCl के साथ 2x को धोएं। एचसीएल को हटा दें और धीरे से स्लाइड्स को टिशू पेपर से सुखाएं। तैयार एल्सियन ब्लू स्टेन को अनुभागों में जोड़ें और एक ह्यूमिडिफाइड कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. अनबाउंड डाई को 0.1 एन एचसीएल के साथ धोएं और फिर 3 मिनट के लिए आसुत पानी। पूर्ण इथेनॉल में वर्गों को निर्जलित करें, उन्हें जाइलीन में साफ करें, और अंत में इमेजिंग के लिए एक राल माध्यम में दाग वाले वर्गों को माउंट करें।
    13. सैफ्रानिन-ओ धुंधला करने के लिए, हाइड्रोगेल खंडों को आसुत पानी के साथ 5 मिनट के लिए 1 गुना धो लें। अनुभागों को ठीक करने के लिए, स्लाइड्स में 4% एनबीएफ जोड़ें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। खंड 1x को आसुत जल से 5 मिनट के लिए धोएं, और फिर स्लाइड्स को 1% एसिटिक एसिड में 10-15 सेकंड के लिए डुबोएं। टिशू पेपर के साथ स्लाइड्स को धीरे से सुखाएं।
    14. तैयार सैफ्रानिन-ओ डाई को अनुभागों में जोड़ें और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अनबाउंड डाई को 100% इथेनॉल के साथ धोएं। स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में डुबोएं। स्लाइड्स को एयर-ड्राई करें, उन्हें जाइलीन में साफ़ करें, और अंत में इमेजिंग के लिए एक राल माध्यम में दाग वाले वर्गों को माउंट करें।
  3. IFP MSCs के ओस्टोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करना
    1. ओस्टोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें, जैसा कि पहले कहा गया है (चरण 2.2.)। कोशिकाओं को 24-वेल टिशू कल्चरप्लेट में 3 x 103 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व पर बीज दें। 500 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए मीडिया जोड़ें। 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 °C पर कोशिकाओं को कल्चर करें। 1 दिन की पोस्ट-सीडिंग, विस्तार मीडिया को 500 μL ओस्टोजेनिक भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
    2. विस्तार मीडिया (डीएमईएम + 10% एफबीएस + 2.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन, 100 U / mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 μg / mL सिप्रोफ्लोक्सासिन) को 25 mM D (+)-ग्लूकोज, 10 nM dexamethasone, 10 mM β-ग्लाइकेरोफॉस्फेट, 50 μg/mL 2-फॉस्फो-L/mL 2-फॉस्फो-एल-फॉस्फोडिक एसिड ट्राइसोडियम के साथ पूरक करके ओस्टोजेनिक मीडिया तैयार करें।
      नोट: 25 एमएम डी (+) ग्लूकोज के साथ पूरक विस्तार मीडिया में संवर्धित कोशिकाओं को अप्रेरित नियंत्रण माना जाता है।
    3. 14 दिनों या 28 दिनों के लिए हर 3 दिनों में ओस्टोजेनिक मीडिया बदलें। 14 दिनों के अंत में, क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) धुंधला द्वारा ओस्टियोजेनेसिस की सीमा को मापें।
      नोट: एएलपी धुंधला होने के लिए सब्सट्रेट तैयार करने के लिए, 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 एमएल आसुत जल में एक 5-ब्रोमो-4- क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआईपी)/नाइट्रोब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी) टैबलेट को घोलें। टैबलेट को पूरी तरह से घुलने दें। सब्सट्रेट समाधान उपयोग करने के लिए तैयार है। चूंकि सब्सट्रेट समाधान को लंबी अवधि के लिए संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, आवश्यकता के आधार पर, टैबलेट को आधे में तोड़ें और इसे 5 एमएल आसुत जल में घोल दें। परमेबिलाइजेशन बफर तैयार करने के लिए, आसुत जल में ट्राइस बफर (100 एमएम) और मैग्नीशियम क्लोराइड (5 एमएम) जोड़ें। घोल में ट्राइटन एक्स 100 (0.1%) जोड़ें और इसे घुलने दें। समाधान के पीएच को 9.25-9.75 पर समायोजित करें।
    4. एएलपी धुंधला करने के लिए, प्रेरण के 14 दिनों के बाद, मीडिया को हटा दें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। 1 मिनट के लिए एनबीएफ (4%) का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और 2-3 मिनट के लिए तैयार लाइसिस बफर का उपयोग करें।
    5. कोशिकाओं में तैयार सब्सट्रेट समाधान के 500 μL जोड़ें और अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर इसे 15 मिनट से 1 घंटे तक इनक्यूबेट करने दें। बीच में बैंगनी / नीले रंग के विकास की जांच करें।
    6. सब्सट्रेट घोल को हटा दें और आसुत जल से धो लें। उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दाग वाली कोशिकाओं को चित्रित करें।
    7. 28 दिनों के अंत में, एलिजारिन रेड-एस स्टेनिंग द्वारा ओस्टोजेनिक प्रेरण के बाद कैल्सीफिकेशन की सीमा को मापें।
      नोट: अलीजारिन रेड-एस स्टेनिंग समाधान (40 एमएम) तैयार करने के लिए, 100 एमएल आसुत जल में 2 ग्राम एलिजारिन रेड-एस को घोलें और पीएच को एचसीएल या एनएच 4 ओएच के साथ 4.1-4.3 में समायोजित करें। घोल को 0.22 μm झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें और अंधेरे में 4 °C पर स्टोर करें। समाधान का पीएच महत्वपूर्ण है; इसलिए या तो एक नया समाधान बनाने या समाधान के पीएच को फिर से मापने की सिफारिश की जाती है यदि यह 1 महीने से अधिक पुराना है।
    8. एलिज़ारिन रेड-एस स्टेनिंग के लिए, प्रेरण के 28 दिनों के बाद, मीडिया को हटा दें और ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 1 गुना धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें।
    9. फिक्सेटिव को हटा दें और आसुत जल के साथ कोशिकाओं को 2 गुना धो लें। पानी को पूरी तरह से निकालें और प्रत्येक कुएं में 1 एमएल एलिजारिन रेड-एस घोल जोड़ें।
    10. आरटी में 1 घंटे के लिए समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाएं।

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Representative Results

बकरी के ऊरु जोड़ से आईएफपी-एमएससी का अलगाव
एक बकरी के दमघोंटू जोड़ से आईएफपी-एमएससी के अलगाव में शामिल कदमों को चित्र 1 में दर्शाया गया है। पेटेला की आंतरिक गैर-अभिव्यक्ति सतह में मौजूद वसा पैड को हटा दिया गया, कीमा लगाया गया, और एंजाइमेटिक रूप से पचाया गया। आईएफपी-एमएससी को सफलतापूर्वक विट्रो में अलग और सुसंस्कृत किया गया (चित्रा 2 ए)।

आईएफपी-एमएससी की क्लोनोजेनिक क्षमता का विस्तार
पृथक कोशिकाओं को विस्तार मीडिया में विट्रो में सुसंस्कृत किया गया था। कोशिकाओं ने बीज बोने के 12 घंटे के भीतर ऊतक संवर्धन प्लेट का पालन करना शुरू कर दिया और दिन 0 पर आकार में ज्यादातर गोल थे। वे प्लेट के समरूप रूप से अनुयायी थे और 24 घंटे के भीतर लम्बी आकृति विज्ञान प्राप्त करते थे। इस आकृति विज्ञान को संस्कृति की अवधि के दौरान बनाए रखा गया था। कोशिकाएं संस्कृति में कुशलता से बढ़ीं और विस्तार के 6 दिनों के भीतर 80% -90% कॉन्फ्लुएंट हो गईं (चित्रा 2 ए)। इसके अतिरिक्त, पृथक कोशिकाओं ने क्लोनोजेनिक क्षमता प्रदर्शित की, जिसका मूल्यांकन कॉलोनी बनाने वाली इकाई-फाइब्रोब्लास्ट (सीएफयू-एफ) परख (चित्रा 2 बी) द्वारा किया गया था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि पृथक कोशिकाओं में विट्रो में कुशल प्रोलिफेरेटिव और आत्म-नवीकरण क्षमताएं हैं।

आईएफपी-एमएससी की विभेदन क्षमता
यह चिह्नित करने के लिए कि क्या पृथक कोशिकाएं मल्टीपोटेंट थीं और एमएससी की विशिष्ट विशेषताएं थीं, उन्हें कई वंशों में अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया था। पृथक कोशिकाएं, जब एडिपोजेनिक वंश की ओर प्रेरित होती हैं, तो लिपिड बूंदों का उत्पादन होता है, जैसा कि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (चित्रा 3 ए) से देखा जा सकता है। इसकी पुष्टि 14 वें और दिन 21 पर ऑयल रेड ओ स्टेनिंग द्वारा की गई थी, जो इन कोशिकाओं की एडिपोसाइट्स में अंतर करने की क्षमता का सुझाव देती है। दूसरी ओर, एडिपोजेनिक-उत्प्रेरण कारकों (चित्रा 3 बी, सी) की अनुपस्थिति में संवर्धित कोशिकाओं में कोई दिखाई देने वाली तेल की बूंदें नहीं देखी गईं।

पृथक कोशिकाओं की चोंड्रोजेनिक क्षमता निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को प्लाज्मा हाइड्रोगेल में समझाया गया था और चोंड्रोजेनिक वंश में अंतर करने की अनुमति दी गई थी। जैसा कि प्लाज्मा हाइड्रोगेल (चित्रा 4 ए) की सकल छवियों से दर्शाया गया है, प्रेरित समूह में 14 दिनों के बाद गठित नियोटिशू सफेद और चमकदार (आर्टिकुलर कार्टिलेज के समान) दिखाई दिया, जबकि अप्रेरित समूह में, यह हल्का सफेद था, और कम चमक देखी गई थी। इसके अतिरिक्त, प्रेरित समूह की कोशिकाएं उपास्थि मैट्रिक्स (यानी, सल्फेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स) के प्रमुख घटकों में से एक को स्रावित करने में सक्षम थीं, जो एल्सियन ब्लू (चित्रा 4 बी) और सैफ्रानिन ओ (चित्रा 4 सी) के लिए सकारात्मक हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन से स्पष्ट है। इसके विपरीत, अप्रेरित समूहों के हाइड्रोगेल खंड सैफ्रानिन ओ और एल्सियन ब्लू स्टेनिंग के लिए नकारात्मक थे। ये परिणाम सामूहिक रूप से केवल चोंड्रोजेनिक उत्तेजनाओं की उपस्थिति में एमएससी की चोंड्रोजेनिक भेदभाव क्षमता का संकेत देते हैं।

पृथक कोशिकाओं ने ओस्टोजेनिक भेदभाव क्षमता का भी प्रदर्शन किया। संस्कृति में 14 दिनों और 21 दिनों के बाद, कोई सहज खनिज (अप्रेरित समूह) नहीं देखा गया था। हालांकि, जब ओस्टोजेनिक मीडिया के साथ प्रेरित किया गया, तो खनिज 14 दिनों के अंत में क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) के लिए सकारात्मक धुंधलापन से स्पष्ट था (चित्रा 5 ए)। इसके अलावा, ओस्टोजेनिक मीडिया में 28 दिनों की संस्कृति के बाद, कैल्सीफाइड जमाव को सकारात्मक एलिज़रिन रेड-एस स्टेनिंग (चित्रा 5 बी) द्वारा कल्पना की गई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि बकरी इन्फ्रापेटलर वसा पैड से पृथक कोशिकाएं, जब प्रेरित होती हैं, तो एडिपोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और ओस्टोजेनिक वंशों में अंतर करने की क्षमता होती है।

Figure 1
चित्र 1: बकरी के घुटने के घुटने के घुटने के घुटने से आईएफपी-एमएससी के अलगाव के लिए योजनाबद्ध। चरण 1. बूचड़खाने से बकरी के घुटने का नमूना एकत्र करें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में विच्छेदन के साथ आगे बढ़ें; चरण 2. ऊतक की शारीरिक रचना की सावधानीपूर्वक जांच करें और आसपास की मांसपेशियों और वसा ऊतक को हटा दें; चरण 3. संयुक्त कैप्सूल को परेशान किए बिना, दोनों लंबी हड्डियों (फीमर और टिबिया) को पूरी तरह से उजागर करने के लिए मांसपेशियों और वसा ऊतकों को हटा दें; चरण 4. सिनोवियम झिल्ली में एक चीरा लगाएं और पेटेला और ट्रोक्लेयर कार्टिलेज को उजागर करने के लिए आर्टिकुलेट जोड़ को काट लें; चरण 5. इन्फ्रापेटलर फैट पैड (आईएफपी) को परेशान किए बिना, ध्यान से जोड़ से पेटेला को हटा दें, और इसे पीबीएस युक्त पेट्री डिश पर रखें; चरण 6. धीरे-धीरे पेटेला से पूरे वसा पैड को हटा दें और इसे एक ताजा पेट्री डिश में रखें ताकि यह सिकुड़ जाए और एंजाइमेटिक पाचन हो सके। (ए. फीमर, बी. टिबिया, सी. पटेलला, डी. ट्रोक्लियर कार्टिलेज, ई. इन्फ्रापेटलर फैट पैड)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: आईएफपी-एमएससी की आकृति विज्ञान और क्लोनोजेनिक क्षमता (ए) माइक्रोग्राफ को 10x आवर्धन पर उल्टे ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मार्ग 3 पर लिया गया था। बीज बोने (दिन 0) के तुरंत बाद, कोशिकाएं आकार में गोल रहीं, दिन 3 पर अधिकांश कोशिकाओं ने लम्बी आकृति विज्ञान प्राप्त किया, और दिन 6 पर आईएफपी-एमएससी 80% -90% कंफ्लुएंट (स्केल बार = 100 μm) बन गए। (बी) सीडिंग के 12 दिनों के बाद क्रिस्टल वायलेट डाई से सना सीएफयू-एफ कॉलोनियों के प्रतिनिधि चित्र (एन = 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आईएफपी-एमएससी का एडिपोजेनिक भेदभाव। ऊपरी पैनल अप्रेरित आईएफपी-एमएससी के माइक्रोग्राफ को इंगित करता है, और निचला पैनल एडिपोजेनिक वंश में प्रेरित आईएफपी-एमएससी का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) एडिपोजेनेसिस के दौरान लिपिड रिक्तिकाओं के गठन को दिखाने वाली प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां (स्केल बार = 100 μm)। विभेदन के (बी) दिन 14 और (सी) दिन 21 पर लिपिड बूंदों के तेल लाल ओ धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां (स्केल बार = 20 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: आईएफपी-एमएससी का चोंड्रोजेनिक भेदभाव। ऊपरी पैनल अप्रेरित हाइड्रोगेल से हाइड्रोगेल निर्माण / खंडों को इंगित करता है, और निचला पैनल चोंड्रोजेनेसिस के अधीन हाइड्रोगेल का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) प्लाज्मा हाइड्रोगेल संरचनाओं की सकल छवियां संस्कृति में 14 दिनों के बाद टीजीएफ-ए1 के साथ पूरक चोंड्रोजेनिक मीडिया की अनुपस्थिति (अप्रेरित) या उपस्थिति (प्रेरित) में बनती हैं। एसजीएजी बाइंडिंग डाई (बी) एल्सियन ब्लू (नीला) और (सी) सफ्रानिन ओ (लाल) (स्केल बार = 100 μm) के साथ सना हाइड्रोगेल के 10 μm वर्गों की प्रतिनिधि छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: आईएफपी-एमएससी का ओस्टोजेनिक भेदभाव। ऊपरी पैनल अप्रेरित कोशिकाओं को इंगित करता है, और निचला पैनल ओस्टोजेनिक मीडिया से प्रेरित कोशिकाओं को इंगित करता है। आईएफपी-एमएससी के माइक्रोग्राफ और प्रतिनिधि चित्र (ए) बीसीआईपी-एनबीटी (क्षारीय फॉस्फेट) 14 दिनों के बाद और (बी) एलिजारिन रेड-एस (कैल्शियम जमाव) 28 दिनों के भेदभाव के बाद (स्केल बार = 100 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल में, बकरी आईएफपी से एमएससी के अलगाव के लिए एक सरल, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान की गई है। इस विधि का उपयोग करके पृथक कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो ऊतक पुनर्जनन के लिए हमारे पिछले अध्ययनों में सफलतापूर्वक किया गया है। यह देखा गया कि पृथक कोशिकाएं प्रोलिफेरेटिव थीं, विभिन्न विकास कारकों के प्रति उत्तरदायी थीं, और इलेक्ट्रोस्पन फाइबर और मचानों25,26 पर बीज ति होने पर अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखा। इसके अलावा, यह देखा गया कि बड़ी संख्या में उच्च गुणवत्ता वाले एमएससी प्राप्त किए जा सकते हैं और विट्रो27,28,29 में आर्टिकुलर कार्टिलेज इंजीनियर करने के लिए इंजेक्टेबल हाइड्रोगेल में चोंड्रोसाइट्स के साथ सह-संवर्धित किया जा सकता है। जबकि कोशिकाओं के विच्छेदन और अलगाव की प्रक्रिया सरल है, आईएफपी से एमएससी के सफल अलगाव और विस्तार के लिए कुछ चरणों का सावधानीपूर्वक पालन करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, चूंकि बूचड़खाने से नमूना लाते समय वास्तव में सड़न रोकनेवाली स्थितियों को बनाए रखना संभव नहीं है, इसलिए अलगाव प्रक्रिया शुरू करने से पहले ऊतक को निष्फल करने के लिए बाहरी ऊतक को 70% इथेनॉल के साथ पोंछने की सलाह दी जाती है। अगला महत्वपूर्ण कदम घुटने के जोड़ से वसा पैड का विच्छेदन है। आईएफपी घुटने के जोड़ में पेटेला के नीचे स्थित है। आईएफपी का समीपस्थ छोर पेटेला30,31 के डिस्टल छोर से जुड़ा हुआ है। इसलिए, अलगाव प्रक्रिया करते समय पेटेला के सही स्थान की पहचान करना बहुत महत्वपूर्ण हो जाता है। इसके बाद, जैसा कि आईएफपी फीमर में ट्रोक्लियर कार्टिलेज के साथ स्पष्ट करता है और सिनोवियम झिल्ली30,31 के साथ कवर किया जाता है, घुटने के जोड़ को खोलने के लिए सिनोवियम झिल्ली पर चीरा लगाना आवश्यक है। एकत्र किए गए इन्फ्रापेटेलर वसा पैड के समग्र स्वास्थ्य का निरीक्षण करना भी महत्वपूर्ण है। चूंकि आईएफपी एडिपोसाइट्स (कोशिकाओं) और वसा संयोजी ऊतक, जैसे कोलेजन और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स से बना होता है, ऊतक को कोशिकाओंको छोड़ने के लिए कोलेजनेज एंजाइम का उपयोग करके कीमा और पचाया जाता है। फ्लोटिंग एडिपोसाइट्स को एमएससी की समरूप संस्कृति के लिए धीमी गति से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जाता है। स्ट्रोमल संवहनी अंश में शेष एडिपोसाइट्स को ताजा मीडिया जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ सेल मोनोलेयर को धोकर प्रत्येक मीडिया परिवर्तन पर ऊतक संस्कृति प्लेट से हटा दिया जाना चाहिए। इस चरण को तब तक जारी रखने की आवश्यकता है जब तक कि सभी दृश्यमान एडिपोसाइट्स को हटा नहीं दिया जाता है। यह सुझाव दिया जाता है कि शेष एडिपोसाइट्स से छुटकारा पाने के लिए पी 0 कोशिकाओं के संयोजन तक पहुंचने के बाद कोशिकाओं को एक नई प्लेट में फिर से सीज किया जाए, जो प्लेट की दीवार का पालन कर सकते हैं और हटाना मुश्किल हो सकता है। अंत में, चूंकि बकरी के नमूने ज्यादातर बूचड़खाने से प्राप्त किए जाते हैं, इसलिए बकरी की सटीक उम्र का पता लगाना मुश्किल है, और इसलिए, कोशिकाओं को अलग करते समय, नमूनों के बीच भिन्नता को सावधानीपूर्वक देखा और प्रलेखित करने की आवश्यकता होती है। विभिन्न अनुप्रयोगों और यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने से पहले प्रत्येक अलगाव के बाद स्व-नवीकरण (सीएफयू-एफ), प्रसार और भेदभाव क्षमता के लिए कोशिकाओं को चिह्नित करने का सुझाव दिया जाता है। सेल-आधारित ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता के कारण, संस्कृति की स्थिति जो प्रसार की सुविधा प्रदान करती है, शिथिलता में देरी करती है, और कोशिकाओं की स्टेमनेस को बनाए रखती है, केंद्रीय रूप से महत्वपूर्ण हो जाती है। यह देखा गया कि 2-फॉस्फो-एल-एस्कॉर्बिक एसिड ट्राइसोडियम नमक (पीएए) और बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) में संवर्धित एमएससी ने अकेले बीएफजीएफ में संवर्धित एमएससी की तुलना में उनकी संख्या में ~ 42 गुना वृद्धि दिखाई। इसके अलावा, पीएए और बीएफजीएफ के सह-उपचार ने प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (उनके एंटीऑक्सीडेंट गुणों के कारण) और स्टेम कोशिकाओं में शिथिलता के उत्पादन को कम कर दिया। इसलिए, एमएससी के इन विट्रो विस्तार के दौरान पीएए काउपयोग वांछनीय है।

जबकि ऊतकों का एंजाइमेटिक पाचन सार्वभौमिक रूप से नियोजित है और एमएससी को अलग करने के लिए एक कुशलतरीका है, कोलेजनेस जैसे एंजाइमों का उपयोग समय लेने वाला और महंगा है। वर्तमान अध्ययन में, कोलेजनेज का उपयोग करके ऊतक का पूर्ण पाचन 12-16 घंटे (रात भर) हुआ, जिससे व्यवहार्यता में कमी या कोशिकाओं की सतह फेनोटाइप में बदलाव हो सकताहै। इसलिए, ऊतक पाचन के लिए कोलेजनेज उपचार की अवधि को कम करने के लिए विधि को और अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक एंजाइम-मुक्त खोज संस्कृति विधि जिसका उपयोग लिपोएस्पिरेट या इंगुइनल वसा पैड से वसा-व्युत्पन्न एमएससी के अलगाव के लिए किया जाता है, आईएफपी-एमएससी34,36,37 के अलगाव के लिए भी खोजा जा सकता है।

आईएफपी-एमएससी, चोंड्रोजेनिक, एडिपोजेनिक और ओस्टोजेनिक वंशों में अंतर करने की उनकी क्षमता के कारण व्यापक चिकित्सीय क्षमता रखते हैं। पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि आईएफपी-एमएससी अन्य स्टेम कोशिकाओं 6,7,9,10 की तुलना में बेहतर चोंड्रोजेनिक क्षमता प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, आईएफपी-एमएससी ने रुचि प्राप्त की है और कार्टिलेज दोषों की मरम्मत और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस में उपास्थि क्षरण को कम करने के लिए सेल-आधारित चिकित्सा के लिए एक बेहतर उम्मीदवार माना जाता है। एक प्रीक्लिनिकल अध्ययन में, इंट्राआर्टिकुलर इंजेक्शन के माध्यम से उपास्थि बाह्य मैट्रिक्स घटकों के साथ आईएफपी-एमएससी के सह-वितरण के परिणामस्वरूप ओस्टियोकॉन्ड्रलदोषों में उपास्थि पुनर्जनन में वृद्धि हुई। इसी तरह, खरगोश ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) मॉडल में आईएफपी-एमएससी के इंट्रा-आर्टिकुलर इंजेक्शन से निम्नलिखित रोग मापदंडों में कमी आई: उपास्थि क्षरण, ओस्टियोफाइट गठन, सबकॉन्ड्रल हड्डी मोटा होना, और सिनोवाइटिस39। इसके अलावा, पहले रिपोर्ट किए गए यादृच्छिक नैदानिक परीक्षण13 और हाल ही में प्रकाशित ओपन लेवल 1 नैदानिक परीक्षण40 के परिणामों से पता चला है कि घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस वाले रोगियों में आईएफपी-एमएससी के इंट्रा-आर्टिकुलर इंजेक्शन सुरक्षित हैं और इसके परिणामस्वरूप दर्द में कमी और संयुक्त कार्य में सुधार होता है, जो घुटने के ओए से संबंधित जटिलताओं को कम करने में उनकी आशाजनक चिकित्सीय क्षमता का संकेत देता है। आईएफपी-एमएससी को एक भड़काऊ नियामक, पदार्थ पी (एसपी) के क्षरण की सुविधा प्रदान करके प्रोइन्फ्लेमेटरी संकेतों की उपस्थिति में संवर्धित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों को विकसित करने के लिए भी दिखाया गया है, जिससे प्रोइन्फ्लेमेटरी और कैटाबोलिक अणुओं में कमी आई है और परिणामस्वरूप, सिनोवियम और आईएफपी 6 की सूजन और फाइब्रोसिस के उपचार में सुधारहुआ है। . इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि नियामक-अनुपालन स्थितियों में संसाधित आईएफपी-एमएससी ने मानक इन विट्रो कल्चर स्थितियों की तुलना में बेहतर प्रसार, भेदभाव क्षमता और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण दिखाए, जो मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) -आधारित थेरेपी41 के लिए उपयोग किए जाने पर नैदानिक सफलता के लिए उनकी क्षमता को दर्शाता है।

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल में इन्फ्रापेटलर फैट पैड (आईएफपी) -व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) के अलगाव का वर्णन किया गया है, जो एंजाइमेटिक पाचन और संस्कृति में उनके रखरखाव द्वारा जोड़ को दबाता है। पृथक कोशिकाओं में प्रोलिफेरेटिव और आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और एडिपोजेनिक, ओस्टोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंश में अंतर कर सकती हैं। आईएफपी-एमएससी एमएससी का एक आशाजनक स्रोत हैं और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए ट्रांसलेशनल क्षमता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एसएच आईआईटी कानपुर के इंस्टीट्यूट पोस्ट-डॉक्टोरल फैलोशिप और डीएसटी (सीड डिवीजन) (एसपी / वाईओ / 618/2018) से एसवाईएसटी अनुदान से समर्थन स्वीकार करता है। एएम ने इंस्टीट्यूट फैलोशिप के लिए भारतीय प्रौद्योगिकी संस्थान-कानपुर (आईआईटी-कानपुर) को स्वीकार किया। डीएसके ने गिरीश जानकीनाथ चेयर प्रोफेसरशिप और जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत को वित्त पोषण (बीटी /पीआर 22445/ एमईडी / 32/571/2016) के लिए स्वीकार किया। एएम, एसएच और डीएसके ने आईआईटी-कानपुर में द मेहता फैमिली सेंटर फॉर इंजीनियरिंग इन मेडिसिन को उनके उदार समर्थन के लिए धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422-10G 10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA Hi-Media TCL049
15-mL centrifuge tube Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G 50 µg/mL
2-Propanol Sigma-Aldrich I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) HiMedia TCL021-50ml 10 mM
50-mL centrifuge tube Corning
Alcian Blue Hi-Media RM471 For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S S D Fine-Chem Limited 26048-25G For calcium deposition
Amphotericin B HiMedia A011 2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Sino Biologicals 10014-HNAE 5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate Sigma B5655-5TAB For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA HiMedia MB-083 Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer HiMedia TCP-182 70 µm
Centrifuge REMI
Ciprofloxacin RANBAXY LAB. Limited B17407T1 2.5 µg/mL
Crystal Violet S D Fine-Chem Limited 42555
D(+)-glucose Merck 1.94925.0521 25 mM
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915 1 µM
DMEM LG SIGMA D5523 Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol Merck 100983
FBS Gibco 10270 Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41% Merck 61780805001730
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378 100 µM
Insulin Sigma-Aldrich I9278 10 µg/mL
Inverted microscope Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1 Sigma-Aldrich I2521-5mL Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline HiMedia TO-109-25G 1 mM
Magnesium chloride Merck 61751605001730 For lysis buffer
Methanol Meck 1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) Thermoscientific
MUSE Cell analyser Merck Millipore For cell counting
OCT compound Tissue-Tek 4583 Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye S D Fine-Chem Limited 54304 For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin HiMedia A007 100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm) NEST
Safranin O S D Fine-Chem Limited 50240 For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate Sigma-Aldrich C3434 3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels For isolation of IFP-MSC
Sucrose Merck 1.94953.0521 35 % (w/v)
TGF-β1 Sino Biologicals Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 Thermoscientific
Tris buffer Merck 61771405001730 For lysis buffer
Triton X100 S D Fine-Chem Limited 40632 For lysis buffer
Type II collagenase Gibco 17101015 1.5 mg/mL
Vitamin D3 Sigma C9756-1G 10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP) NEST

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बायोइंजीनियरिंग अंक 186 बकरी इन्फ्रापेटलर फैट पैड (आईएफपी) मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) सेल अलगाव सेल कल्चर मल्टीलीनेज क्षमता पुनर्योजी चिकित्सा ऊतक इंजीनियरिंग
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Mahajan, A., Hazra, S., Arora, A.,… More

Mahajan, A., Hazra, S., Arora, A., Katti, D. S. Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint. J. Vis. Exp. (186), e63617, doi:10.3791/63617 (2022).

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