Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בידוד, הרחבה והתמיינות של תאי גזע מזנכימליים ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק העיזים מחניק

Published: August 2, 2022 doi: 10.3791/63617
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2
1Department of Biological Sciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Kanpur, 2The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine, Indian Institute of Technology-Kanpur, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

ניתן לבודד בקלות תאי גזע מזנכימליים של כריות שומן אינפרא-פטלריות (IFP-MSCs) ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק הברך. הם מתרבים היטב במבחנה, יוצרים מושבות CFU-F, ומתבדלים לשושלות אדיפוגניות, כונדרוגניות ואוסטיאוגניות. כאן מסופקת המתודולוגיה לבידוד, הרחבה והבחנה של IFP-MSCs ממפרק מחניק עזים.

Abstract

ה- IFP, הנמצא במפרק הברך, משמש כמקור מבטיח של MSCs. ה- IFP הוא רקמה נגישה בקלות מכיוון שהיא נכרתת ומושלכת באופן שגרתי במהלך הליכים ארתרוסקופיים וניתוחי החלפת ברך. בנוסף, הסרתו קשורה לתחלואה מינימלית באתר התורם. מחקרים אחרונים הראו כי IFP-MSCs אינם מאבדים את יכולת ההתרבות שלהם במהלך התרחבות במבחנה ויש להם פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני שאינו תלוי בגיל. ל-IFP-MSCs יש פוטנציאל התמיינות כונדרוגני מעולה בהשוואה ל-MSCs (BMSCs) שמקורם במח עצם ולתאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs). למרות שתאים אלה ניתנים להשגה בקלות מחולים מבוגרים וחולים, יעילותם מוגבלת. לפיכך, חשוב להשתמש ב-IFP-MSCs מתורמים בריאים כדי לקבוע את יעילותם ביישומים ביו-רפואיים. מכיוון שהגישה לתורם אנושי בריא היא מאתגרת, מודלים של בעלי חיים יכולים להיות חלופה טובה יותר שתאפשר הבנה בסיסית. בעלי חיים גדולים כמו כלבים, סוסים, כבשים ועזים ממלאים תפקיד מכריע במחקר התרגומי. מבין אלה, העז יכולה להיות מודל מועדף מכיוון שלמפרק המחניק של העז יש את האנטומיה הקרובה ביותר למפרק הברך האנושי. יתר על כן, goat-IFP יכול למלא את מספרי MSC הגבוהים יותר הדרושים ליישומי התחדשות רקמות. יתר על כן, עלות נמוכה, זמינות ועמידה בעקרונות 3R למחקר בבעלי חיים הופכים אותם למודל אטרקטיבי. מחקר זה מדגים פרוטוקול פשוט לבידוד IFP-MSCs מהמפרק המחניק של עזים ותנאי תרבית חוץ גופית להרחבתם והתמיינותם. ה-IFP המבודד באספטית מהעז נשטף, נטחן ועוכל באופן אנזימטי. לאחר סינון וצנטריפוגה, התאים שנאספו היו בתרבית. תאים אלה היו דבקים, היו בעלי מורפולוגיה דמוית MSCs, והפגינו יכולת קלונוגנית יוצאת דופן. יתר על כן, הם נבדלו לשושלות אדיפוגניות, כונדרוגניות ואוסטיאוגניות, והפגינו את הרב-פוטנטיות שלהם. לסיכום, המחקר מדגים את הבידוד וההרחבה של MSCs, אשר מראים פוטנציאל בהנדסת רקמות וביישומים של רפואה רגנרטיבית.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם מועמדים אטרקטיביים לטיפולים מבוססי תאים ברפואה רגנרטיבית 1,2. ניתן לקצור אותם ממגוון מקורות רקמה כגון מח עצם, חבל טבור, שליה, מוך השן ורקמת שומן תת עורית3. עם זאת, מכיוון שהזמינות של תאי גזע במבוגרים מוגבלת והליך הבידוד שלהם הוא לעתים קרובות פולשני (וכתוצאה מכך תחלואה באתר התורם), רצוי שיהיה מקור חלופי לתאי גזע שיוכל לעקוף את האתגרים הללו.

מפרק הברך הוא מחסן של סוגי תאים שונים, כגון MSCs שמקורם בכריות שומן אינפרא-כוכביות, MSCs שמקורם בקרום סינוביאלי, MSCs שמקורם בנוזל סינוביאלי, פיברובלסטים של רצועות, כונדרוציטים מפרקיים וכו'4,5,6. לתאים אלה יש פוטנציאל להיחקר באופן נרחב במחקר מבוסס הנדסת רקמות שלד-שריר. לכן, מפרק הברך יכול להיות מקור אפשרי ואמין לסוגים רבים של MSCs. מחסן השומן הממוקם במפרק הברך, המכונה כרית השומן האינפרא-כוכבית (IFP) או כרית השומן של הופה, הוא בחירה מבטיחה ואלטרנטיבית של מחסן MSC. ה- IFP הוא מקור נגיש יחסית וניתן להשגה קלינית של MSCs, שכן הוא נכרת ומושלך באופן שגרתי כפסולת כירורגית במהלך ארתרוסקופיה של הברך או ניתוח ברך פתוחה. הסרת ה-IFP קשורה לתחלואה מינימלית באתר התורם, מה שהופך אותו גם למקור רקמתי אטרקטיבי. למרות שיש להם פרופיל פנוטיפי דומה, ל-MSCs מ-IFP (IFP-MSCs) יש פוטנציאל קלונוגני משופר בהשוואה לתאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BM-MSCs)6 ויכולת שגשוג טובה יותר בהשוואה לתאי גזע תת-עוריים שמקורם בשומן (ADSCs)7. באופן מעניין, בהשוואה ל-MSCs שמקורם בנוזל סינוביאלי (SF-MSCs), IFP-MSCs אינם מאבדים את יכולת ההתרבות שלהם במעברים מאוחרים, וגם זמן ההכפלה אינו גדל במעברים מאוחרים. זה מצביע על כך שבמהלך התרחבות התא, IFP-MSCs יכולים להשיג מספר גדול מספיק של תאים עבור יישומים של הנדסת רקמות במבחנה מבלי להתפשר על קצב ההתרבות שלהם8. מחקרים אחרונים גם הציעו כי ל-IFP-MSCs יש פוטנציאל התמיינות כונדרוגני מעולה בהשוואה ל-MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) ו-MSCs שמקורם בשומן (ADSCs), ככל הנראה בשל קרבתם האנטומית לסחוס מפרקי, מה שמעיד על התאמתם להנדסת רקמת סחוס 6,7,9,10. יתר על כן, יש להם גם פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני בלתי תלוי גיל11. הודגם כי הזרקה תוך-מפרקית של IFP-MSCs מפחיתה כאבים ומשפרת את תפקודי מפרק הברך במטופלים עם דלקת מפרקים ניוונית (OA)12,13. יתר על כן, תגובות חיסוניות חזקות ותכונות אימונומודולטוריות משופרות של IFP-MSCs בנוכחות ציטוקינים דלקתיים במהלך תנאים פתולוגיים דווחו גם6.

IFP-MSCs הם מקור מבטיח וחלופי של MSCs; עם זאת, התועלת הטיפולית שלהם בהנדסת רקמות וברפואה רגנרטיבית נחקרת פחות באופן יחסי. המחקרים הקיימים על IFP-MSCs השתמשו בעיקר בתאים מתורמים אנושיים. בין אלה, כמה מחקרים אחרונים חקרו IFP-MSCs מתורמים אנושיים בריאים (חולים שאינם מפרקים, בגילאי 17-60 שנים)6,14, בעוד שרוב המחקרים השתמשו ב- IFP-MSCs מחולים מבוגרים שעברו ניתוח החלפת ברך כולל (חולים חולים, בגילאי 70-80 שנים). מכיוון שידוע שגם גיל וגם מחלה משנים את התפקוד התקין של תאי גזע (מספר מופחת ואובדן פוטנציאל תפקודי), הדבר עלול להוביל לחוסר עקביות בתוצאות המחקרים מבוססי MSC 7,15,16,17. בנוסף לכך, השימוש ב- IFP-MSCs מחולים עם מצבים פתופיזיולוגיים (למשל, דלקת פרקים והשמנת יתר) מהווה גם קושי בהבנת המאפיינים הבסיסיים של תאים בריאים במבחנה, ובכך פועל כגורם מגביל בפיתוח טיפולים מבוססי MSCs. כדי להתגבר על בעיות אלה, השימוש ב- IFP-MSCs מתורמים בריאים הוא חיוני. מכיוון שהגישה לתורם אנושי בריא היא מאתגרת, מודלים של בעלי חיים יכולים להיות חלופה טובה יותר. בהקשר זה, ישנם כמה מחקרים שבהם IFP בודד מעכברים18. עם זאת, בשל גודלה הקטן של כרית השומן בעכברים רגילים, רקמות שומן מבעלי חיים רבים שולבו כדי לקבל מספיק רקמות לביצוע הליכי ניסוי משוכללים19. לפיכך, יש צורך במודל של בעלי חיים גדולים, שיוכל למלא את הדרישה למספר התאים הגבוה יותר ובמקביל לעמוד בעקרונות 3R (עידון, החלפה והפחתה) במחקר בבעלי חיים20. לשימוש בבעלי חיים גדולים יש השלכות משמעותיות במחקר התרגומי. באופן ספציפי, בהנדסת רקמות שריר-שלד, נחקרו21 מגוון של בעלי חיים גדולים כמו כלבים, חזירים, כבשים, עזים וסוסים. עז (Capra aegagrus hircus) היא בחירה מצוינת של בעל חיים גדול מכיוון שלמפרק המחניק שלה יש את האנטומיה הקרובה ביותר למפרק הברך האנושי22,23,24. המבנה הטרבקולרי של העצם התת-כונדרלית ועובי העצם התת-כונדרלית של העזים דומים לבני אדם, ודווח גם כי היחס בין הסחוס לעצם קרוב לבני אדם21. בנוסף, עזים בויתו באופן נרחב ברחבי העולם, מה שהופך אותן לזמינות בקלות כאשר הן בוגרות מבחינה שלדית. יתר על כן, עלויות תחזוקה נמוכות וטיפול קל הפכו אותם למודל בעלי חיים אטרקטיבי למחקר22.

במחקר הנוכחי מודגם פרוטוקול פשוט לבידוד של IFP-MSCs מהמפרק המחניק של Capra aegagrus hircus (עז) ותנאי תרבית במבחנה להרחבתם והבדלתם. התאים המבודדים הם דבקים, בעלי מורפולוגיה דמוית MSC, יוצרים מושבות CFU-F (יחידות יוצרות מושבה-פיברובלסט) ובעלי פוטנציאל התמיינות אדיפוגני, כונדרוגני ואוסטיאוגני. לכן, IFP-MSCs מראים פוטנציאל כמקור חלופי של MSCs עבור יישומים ביו-רפואיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול מבוסס על בידוד של IFP-MSCs מעיזים. עז IFP ודם נאספו מאבטואר מקומי. מכיוון שאיסוף רקמות כזה נמצא מחוץ לתחום אחריותה של ועדת אתיקה מוסדית לבעלי חיים, לא נדרש אישור אתי.

1. בידוד של IFP-MSCs מהמפרק femorotibial של ברך עז

  1. לאסוף מפרק femorotibial עז (דגימה) המקיף ~ 15 ס"מ כל אחד מאזורי הירך והטיביאליות של הגפיים האחוריות. הניחו מיד את הדגימה בקופסת איסוף דגימות מעוקרת ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להובלה למעבדה להמשך עיבוד. לעבד את הדגימות באופן אספטי בארון בטיחות ביולוגית, תוך שימוש בכלי ניתוח מעוקרים לאורך כל ההליך (איור 1, שלב 1).
  2. הניחו את הדגימה על צלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ ושטפו אותה היטב עם תמיסת מלח (PBS) עם חיץ פוספטים (PBS) בתוספת אנטיביוטיקה (5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 200 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ציפרופלוקסצין) כדי למנוע זיהום. הקפידו תמיד שהדגימה תישמר על הידרציה באמצעות PBS.
  3. בחן היטב את האזורים האנטומיים של הדגימה. כדי להקל על הגישה לקפסולת המפרק, ודא שהרקמות הנוספות משתי העצמות הארוכות הוסרו לחלוטין (איור 1, שלב 2).
  4. כדי להשיג זאת, ראשית, להחזיק את המשטח הסופי של עצם הירך ביד אחת, עם מספריים חדים, לחתוך לאורך לכיוון המפרק. הסר את השרירים הסובבים ואת רקמת השומן מן העצם במהלך התהליך. יש להיזהר שהרקמה המקיפה את קפסולת המפרק המיידית תישאר ללא הפרעה בתחילה.
  5. באופן דומה, לבצע חתך נוסף בקצה הטיביאלי של הדגימה ולהסיר את השרירים ורקמת השומן מהעצם הטיביאלית. ודאו ששתי העצמות הארוכות חשופות לחלוטין ושקפסולת המפרקים נראית בבירור לאחר שלב זה (איור 1, שלב 3).
  6. לאחר מכן, בצעו חתך משני צדי קרום הסינוביום כדי לפתוח את המפרק המפרקי (איור 1, שלב 4). חותכים את הפטלה הן מממברנת הסינוביום והן מהרצועות הפטאליות באמצעות אצווה טרייה של מספריים ומלקחיים מעוקרים. שמרו מיד את הפטלה המופרדת בצלחת פטרי המכילה PBS (איור 1, שלב 5).
  7. הסר את כל כרית השומן הנמצאת על המשטח הפנימי של הפטלה באמצעות מספריים ומלקחיים ואסוף את כרית השומן בצלחת פטרי טרייה אחרת (איור 1, שלב 6). טחנו את כרית השומן שנאספה באמצעות אזמל. כלול כלי ניתוח אחרים (למשל, מספריים או להבים כירורגיים) כנדרש כדי להשיג את חתיכות השומן / מקטעים הקטנים ביותר האפשריים של ~ 2-3 מ"מ.
    הערה: טחינה טובה היא קריטית כדי להביא לתפוקה טובה של תאים. תמיד לשמור על הרקמה hydrated ולא לתת לו להתייבש בכל שלב של הליך הבידוד.
  8. העבירו את הרקמה הטחונה באמצעות מרית לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ושטפו אותה עם PBS בתוספת אנטיביוטיקה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות במערבל מבחנה. חזור על שלב הכביסה 3x, 15 דקות כל אחד.
  9. לעיכול אנזימטי, דגרו את הרקמה הטחונה (~5 גרם) ב-Modified Eagle's Media של דולבקו (DMEM low glucose) המכילה 1.5 מ"ג/מ"ל קולגן מסוג II (20 מ"ל) ובתוספת 2% FBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
    הערה: בצע את העיכול במערבל מבחנה ב~15 סיבובים לדקה (סל"ד).
  10. שאפו בזהירות את הרקמה המעוכלת וסננו אותה דרך מסננת תאים (70 מיקרומטר) כדי להסיר כל רקמה לא מעוכלת. צנטריפוגה את התסנין בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ב 150 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולשטוף את הכדור עם DMEM גלוקוז נמוך לפחות 2x.
    הערה: יש לשפוך את הרקמה המעוכלת באיטיות לתוך המסננת כדי למנוע שפיכה. השתמש בצינור צנטריפוגה בנפח נמוך (15 מ"ל) כדי לקבל כדור טוב.
  11. השהה את גלולת התא המתקבלת במדיית DMEM מלאה (DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה [2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין, 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין, ו-25 מיקרוגרם/מ"ל ציפרופלוקסצין]), המכונה מדיית הרחבה בפרוטוקול בשלבים הבאים.
  12. זרעו את התאים על צלחות פטרי בקוטר 150 מ"מ ותרביתו אותם במדיית ההרחבה בתוספת גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי של 5 ננוגרם/מ"ל (bFGF) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל 2-Phospho-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיום. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 כדי לאפשר לתאים להיצמד ולהתרבות. עקוב אחר ההתקשרות והצמיחה של התאים על בסיס יומי.

2. תחזוקה והרחבה של תאים מבודדים

  1. שנה את המדיה כל 3 ימים עד שהתאים הופכים למפגשים. הוסיפו 5 ננוגרם/מ"ל bFGF טרי ו-50 מיקרוגרם/מ"ל 2-זרחן-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיום ישירות לצלחת פטרי בכל פעם שהמדיה משתנה. לאחר שהתאים הופכים למפגש של 80%-90%, תת-התרבות של התאים.
    הערה: הסר את הישויות שאינן מצייתות במהלך כל שינוי מדיה. במקרה טיפות שמן נראים לאחר 3 ימים של דגירה, לשטוף את התאים עם PBS 1x ולאחר מכן להוסיף מדיה טרייה צלחת פטרי. יש להמשיך עם שטיפת PBS לפני כל החלפת מדיה עד להסרת טיפות השמן לחלוטין.
  2. תת-תרבות של תאים: הסר את מדיית ההתפשטות מצלחת פטרי ושטוף את התאים 1x עם PBS. מוסיפים 4 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA לצלחת ודוגרים את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 למשך 4 דקות.
    הערה: המפגש (80%-90%) מושג תוך 7 ימים. יש לפזר באופן אחיד את תמיסת הטריפסין/EDTA על פני כל פני השטח של צלחת פטרי במהלך הטריפסיניזציה.
  3. נתקו את התאים על ידי הקשה על הצלחת בצד והתבוננות תחת מיקרוסקופ כדי לאשר שכל התאים מנותקים. נטרול הטריפסין לאחר הוספת נפח שווה (4 מ"ל) של מדיית הרחבה.
  4. אסוף את התאים המנותקים באמצעות פיפטה בצינור פוליפרופילן טרי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 150 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. השלך את הסופרנטנט והושיע את הכדור בנפח הרצוי של מדיית ההרחבה.
  5. ספרו את התאים בשיטת ספירת התאים הסטנדרטית ותת-תרבית בצלחות פטרי בקוטר 150 מ"מ בצפיפות זריעה של 1 x 104 תאים לס"מ2 להרחבה נוספת. עבור כל המבחנים, השתמש במונו-שכבה מקבילה של תאים של מספר המעבר P2-P5.
    הערה: הקפיא את התאים העודפים.

3. הערכת היכולת הקלונוגנית של IFP-MSCs באמצעות בדיקת יצירת מושבה (CFU-F)

  1. עבור בדיקת CFU-F, זרעו את התאים במדיית הרחבה בצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות בצפיפות זריעה של 50-100 תאים לס"מ2. הוסף מדיה כדי לקבל נפח סופי של 3 מ"ל.
    הערה: מטב את ריכוז התאים לבדיקות ולטיפול.
  2. תרבית את התאים במשך 12 יום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 בתנאי תרבית סטנדרטיים כדי לאפשר לתאים ליצור מושבות. שנה את המדיה כל 3 ימים. היו עדינים בזמן שאתם משנים את המדיה.
  3. לאחר 12 יום, שטפו את המושבות 1x עם PBS וקבעו אותן באמצעות 20% מתנול למשך 20 דקות ב-RT. הכתימו את המושבות בצבע סגול גבישי (0.5% [w/v] ב-20% מתנול) למשך 20 דקות ב-RT. ספרו את המושבות הבודדות באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
    הערה: מושבה מוגדרת כאשכול של יותר מ-50 תאים.

4. פוטנציאל בידול של IFP-MSCs

  1. גרימת התמיינות אדיפוגנית של IFP-MSCs
    1. כדי לגרום לאדיפוגנזה, זרעו את התאים בצפיפות של 25 x 103 תאים לס"מ2 בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות. הוסף מדיה כדי לקבל נפח סופי של 500 μL. תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 .
    2. יום אחד לאחר המפגש, החלף את מדיום ההרחבה ב- 500 μL של מדיית דיפרנציאציה אדיפוגנית. זה לוקח בערך 2 ימים עבור התאים להגיע למפגש.
    3. הכן את מדיית ההבחנה האדיפוגנית על ידי תוספי מדיית הרחבה (DMEM + 10% FBS + 2.5 מיקרוגרם /מ"ל אמפוטריצין, 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין ו-25 מיקרוגרם/מ"ל ציפרופלוקסצין) עם 25 mM D (+)-גלוקוז, 10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 1 μM דקסמתזון ו-100 μM אינדומתצין.
      הערה: מדיית הבידול אינה יציבה ב-4 °C לאחר חודש אחד; לפיכך, הכינו את המדיה לפי הצורך.
    4. חשבו על התאים שגודלו בתרבית במדיית ההתפשטות בתוספת 25 mM D (+) גלוקוז כבקרות לא מושרות. שנה את המדיה כל 3 ימים למשך 14 יום. בתום 14 הימים, לשטוף את התאים 1x עם PBS. תקן את התאים באמצעות פורמלין חוצץ נייטרלי (NBF; 4% פורמלדהיד ב- PBS) למשך 15 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
    5. לאחר קיבוע, לשטוף את הבארות 1x עם מים מזוקקים ולאחר מכן דגירה את התאים עם 60% isopropanol במשך 5 דקות ב RT. לאחר הסרת איזופרופנול, מכתימים את טיפות השומנים על ידי דגירה של התאים עם 500 μL של תמיסה עובדת של שמן אדום O צבע במשך 5 דקות ב RT. לשטוף את הבארות 1x עם מים מזוקקים כדי להסיר את הצבע unbound ותמונה של התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
      הערה: הכן את תמיסת המלאי של O אדום שמן (ORO) על ידי המסת 300 מ"ג ORO ב-100 מ"ל של 99% איזופרופנול. כדי להכין את פתרון העבודה, ערבבו שלושה חלקים של מלאי ORO ושני חלקים של מים מזוקקים ואפשרו לו לערבב ב- RT במשך 10 דקות. סנן את התערובת באמצעות נייר סינון בגודל 0.2 מיקרומטר. פתרון העבודה מוכן לשימוש. ניתן להכין ולאחסן את פתרון המלאי ב-RT למשך חודש אחד בחושך, בעוד שהפתרון העובד צריך להיות מוכן טרי לפני כל שימוש/הכתמה.
  2. גרימת התמיינות כונדרוגנית של MSCs של IFP
    1. בידוד של פלזמת עיזים:
      1. יש להכין 3.4% (עם v/v) נתרן-ציטראט במים מזוקקים. הוסף 5 מ"ל מתמיסת נתרן ציטראט מוכנה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
      2. לאסוף 45 מ"ל של דם עזים מבודד טרי באותו צינור. הטה מיד את הצינור כדי לערבב את הדם עם נתרן ציטראט ביסודיות כדי למנוע קרישה ולהעביר אותו למעבדה ב 4 מעלות צלזיוס.
      3. צנטריפוגה דם עז שנאסף ב 1000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופר-נטנט (פלזמה) לצינור טרי בתוך ארון בטיחות ביולוגית. סנן את הפלזמה דרך מסנני 0.2 מיקרומטר, aliquot, ואחסן ב -20 °C לשימוש נוסף.
        הערה: שמור על טמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס בזמן הטיפול בדגימות. חשוב למזער את מחזורי ההפשרה של הפלזמה.
    2. תרבית התאים המורחבים למפגש של 80%-90%, ניתוק התאים באמצעות תמיסת טריפסין/EDTA, והורדת התאים ב-150 x גרם למשך 5 דקות בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. יש לתלות את הכדור בפלזמת עיזים בצפיפות של 2 x 106 תאים לכל 50 μL של תמיסת פלזמה.
    3. הוסיפו טיפה של תאים המכילים פלזמה (50 μL) על צלחת פטרי מעוקרת בקוטר 90 מ"מ ולאחר מכן הוסיפו סידן כלורי בריכוז סופי של 0.3% (w/v). מערבבים היטב כדי לייצר הידרוג'ל פלזמה צולבת.
    4. דגירה של הידרוג'ל מפוברק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. לאחר הדגירה, העבירו את ההידרוג'לים ללוחות תרבית רקמה של 24 בארות המכילות מדיה כונדרוגנית.
    5. הכן מדיה כונדרוגנית על ידי תוספת DMEM גלוקוז נמוך עם 10 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 1.25 מ"ג/מ"ל סרום בקר אלבומין (BSA), 1 mM פרולין, 50 מיקרוגרם / מ"ל 2-Phospho-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיום, 100 nM dexamethasone, 1x אינסולין, טרנספרין, נתרן סלניט + לינולאית-BSA (ITS +1), אנטיביוטיקה (2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין, 100 U / mL פניצילין-סטרפטומיצין ו 25 מיקרוגרם / מ"ל ציפרופלוקסצין), ו-10 ng/mL גורם גדילה מתמיר- β1 (TGF-β1).
    6. ההידרוג'לים שגודלו בתרבית במדיית DMEM מלאה (DMEM גלוקוז נמוך עם 10% FBS ואנטיביוטיקה [2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין, 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין, ו-25 מיקרוגרם/מ"ל ציפרופלוקסצין]) ללא TGF-β1 נחשבים כבקרות לא מושרות. שנה את המדיה כל 3 ימים למשך 14 יום.
    7. לאחר 14 ימים של התמיינות כונדרוגנית של תאים בהידרוג'לים פלזמה, לשטוף את הידרוג'לים עם PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד ולאחר מכן לתקן את הדגימות NBF במשך 3 שעות.
      אזהרה: פורמלדהיד הוא חומר מסרטן פוטנציאלי ועלול לגרום לגירוי באף, בגרון ובריאות בעת שאיפה. בצע את כל ההליכים הקשורים פורמלדהיד במכסה אדים.
    8. הסר NBF, לשטוף את ההידרוג'לים עם PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן לדגור ב 35% (w / v) סוכרוז ב RT לילה כדי לאפשר את הפתרון להיספג לחלוטין לתוך הדגימות. התאקלמו בהידרוג'לים בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) למשך 3 שעות. הטמע את הדגימות בתרכובת OCT באמצעות תבניות סיליקון תחת חנקן נוזלי.
    9. חותכים את הדגימות בעובי של 10-12 מיקרומטר על שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין באמצעות קריוטום ומאחסנים אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. כדי לבחון את הנוכחות או התצהיר של המטריצה החוץ-תאית לאחר התמיינות כונדרוגנית, הכתימו את החלקים בצבע כחול אלקסיאני ובצבע ספרנין-O, הנקשרים לגליקוזאמינוגליקנים סולפטיים.
      הערה: כדי להכין צבע כחול אלקיאני, יש להמיס 1 גרם של צבע כחול אלקיאני ב-100 מ"ל של 0.1 N HCl ולערבב היטב במערבל מבחנה למשך הלילה. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב RT במשך חודש אחד בחושך. כדי להכין צבע ספרנין-O, יש להמיס 0.1 גרם צבע ספרנין-O ב-100 מ"ל מים מזוקקים ולערבב היטב במיקסר מבחנה למשך הלילה.
    10. לכתמים כחולים אלקיאניים, שטפו את חלקי ההידרוג'ל 1x במים מזוקקים למשך 5 דקות. כדי לתקן את הקטעים, הוסף 4% NBF לשקופיות ודגרה במשך 30 דקות.
    11. לשטוף את החלקים 1x עם מים מזוקקים במשך 5 דקות ולאחר מכן 2x עם 0.1 N HCl במשך 30 שניות כל אחד. הסירו את ה-HCl וייבשו בעדינות את השקופיות בנייר טישו. מוסיפים את הכתם הכחול האלקיאני המוכן למקטעים ומדגרים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לחות.
    12. יש לשטוף את הצבע הלא מאוגד עם 0.1 N HCl ולאחר מכן לזקק מים במשך 3 דקות. לייבש את החלקים באתנול מוחלט, לנקות אותם בקסילן, ולבסוף להרכיב את החלקים המוכתמים במדיום שרף להדמיה.
    13. לצביעת ספרנין-O, שטפו את חלקי ההידרוג'ל במים מזוקקים 1x למשך 5 דקות. כדי לתקן את הקטעים, הוסף 4% NBF לשקופיות ודגרה במשך 30 דקות. לשטוף את החלקים 1x עם מים מזוקקים במשך 5 דקות, ולאחר מכן לטבול את השקופיות 1% חומצה אצטית במשך 10-15 שניות. יבשו את המגלשות בעדינות בנייר טישו.
    14. הוסיפו צבע ספרנין-O מוכן למקטעים ודגרו במשך 10 דקות ב-RT. שטפו את הצבע הלא מאוגד ב-100% אתנול. טבלו את השקופיות ב-100% אתנול למשך 5 דקות. מייבשים את המגלשות באוויר, מנקים אותן בקסילן, ולבסוף מרכיבים את החלקים המוכתמים במדיום שרף להדמיה.
  3. גרימת התמיינות אוסטאוגנית של MSCs של IFP
    1. כדי לגרום להתמיינות אוסטאוגנית, טריפסיניז את התאים, כאמור (שלב 2.2.). זרעו את התאים בצפיפות של 3 x 103 תאים לס"מ2 בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות. הוסף מדיה כדי לקבל נפח סופי של 500 μL. תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 . יום אחד לאחר הזריעה, החלף את מדיית ההרחבה במדיית דיפרנציאציה אוסטאוגנית של 500 μL.
    2. הכן את המדיה האוסטיאוגנית על ידי תוספי מדיית הרחבה (DMEM + 10% FBS +2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין, 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין, ו-25 מיקרוגרם/מ"ל ציפרופלוקסצין) עם 25 mM D (+)-גלוקוז, 10 ננומטר דקסמתזון, 10 mM β-גליצרופוספט, 50 מיקרוגרם/מ"ל 2-זרחן-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיום, ו-10 ננומטר ויטמין D3.
      הערה: התאים שגודלו בתרבית במדיית התפשטות בתוספת גלוקוז של 25 mM D (+) נחשבים לפקדים לא מושרים.
    3. יש להחליף את המדיה האוסטאוגנית כל 3 ימים למשך 14 יום או 28 ימים. בתום 14 יום, מדוד את היקף האוסטיאוגנזה על ידי צביעת פוספטאז אלקליין (ALP).
      הערה: כדי להכין את המצע לצביעת ALP, יש להמיס טבליה אחת של 5-ברומו-4- כלורו-3-אינדוליל פוספט (BCIP)/Nitroblue Tetrazolium (NBT) ב-10 מ"ל של מים מזוקקים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. תנו לטבליה להתמוסס לחלוטין. פתרון המצע מוכן לשימוש. מכיוון שלא ניתן לאחסן את תמיסת המצע למשך זמן ארוך יותר, על פי הצורך, שוברים את הטבליה לשניים וממיסים אותה ב -5 מ"ל של מים מזוקקים. כדי להכין את חיץ החדירה, הוסיפו את Tris buffer (100 מ"מ) ומגנזיום כלוריד (5 מ"מ) למים מזוקקים. הוסף את Triton X100 (0.1%) לפתרון ותן לו להתמוסס. התאם את ה- pH של הפתרון ל- 9.25-9.75.
    4. עבור צביעת ALP, לאחר 14 יום של אינדוקציה, להסיר את המדיה ולשטוף את התאים עם PBS. תקן את התאים באמצעות NBF (4%) למשך דקה אחת. שטפו את התאים עם PBS וחדרו באמצעות מאגר התזה המוכן למשך 2-3 דקות.
    5. הוסיפו 500 μL מתמיסת המצע המוכנה לתאים ותנו לה לדגור במשך 15 דקות עד שעה, בהתאם לרמת הביטוי. בדקו את התפתחות הצבע הסגול/כחול בין לבין.
    6. הסר את תמיסת המצע ושטוף במים מזוקקים. דמיינו את התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
    7. בתום 28 יום, יש למדוד את מידת ההסתיידות לאחר אינדוקציה אוסטאוגנית על ידי הכתמת אליזרין רד-S.
      הערה: כדי להכין את תמיסת הכתמים Alizarin Red-S (40 mM), יש להמיס 2 גרם של Alizarin Red-S ב-100 מ"ל מים מזוקקים ולהתאים את ה-pH ל-4.1-4.3 עם HCl או NH4OH. סנן את התמיסה דרך קרום של 0.22 מיקרומטר ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. ה- pH של הפתרון חשוב; לפיכך מומלץ לעשות פתרון טרי או למדוד מחדש את ה- pH של הפתרון אם הוא בן יותר מחודש.
    8. עבור Alizarin Red-S מכתים, לאחר 28 ימים של אינדוקציה, להסיר את המדיה ולשטוף את התאים 1x עם PBS קר. לתקן את התאים באמצעות 70% אתנול במשך 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. הסר את fixative ולשטוף את התאים 2x עם מים מזוקקים. הסר את המים לחלוטין ולהוסיף 1 מ"ל של אליזרין Red-S פתרון לכל באר.
    10. דגירה של התאים עם התמיסה במשך שעה אחת ב-RT ודמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידוד של IFP-MSCs מהמפרק הפמורוטיבי של עז
השלבים הכרוכים בבידוד של IFP-MSCs מהמפרק המחניק של עז מתוארים באיור 1. כרית השומן שהייתה נוכחת במשטח הפנימי שאינו מפרקי של הפטלה הוסרה, נטחנה והתעכלה באופן אנזימטי. ה-IFP-MSCs בודדו בהצלחה ועברו תרבית במבחנה (איור 2A).

הרחבה ויכולת קלונוגנית של IFP-MSCs
התאים המבודדים גודלו בתרבית במבחנה במדיית הרחבה. התאים החלו להיצמד לצלחת תרבית הרקמה תוך 12 שעות מרגע הזריעה והיו ברובם עגולים בצורתם ביום 0. הם היו דבקים הומוגנית בצלחת והשיגו מורפולוגיה מוארכת תוך 24 שעות. מורפולוגיה זו נשמרה לאורך כל משך התרבות. התאים התרבו ביעילות בתרבית והפכו למפגש של 80%-90% תוך 6 ימים מההתפשטות (איור 2A). בנוסף, התאים המבודדים הציגו יכולת קלונוגנית, שהוערכה על-ידי בדיקת יחידה-פיברובלסט (CFU-F) יוצרת מושבה (איור 2B). תוצאות אלה מצביעות על כך שלתאים המבודדים יש יכולות רבייה והתחדשות עצמית יעילות במבחנה.

פוטנציאל בידול של IFP-MSCs
כדי לאפיין אם התאים המבודדים היו רב-תכליתיים ובעלי תכונות אופייניות של MSCs, הם הושרו להתמיין לשושלות מרובות. התאים המבודדים, כאשר הם מושרים לכיוון שושלת אדיפוגנית, ייצרו טיפות שומנים, כפי שניתן לראות מתמונות השדה הבהיר (איור 3A). זה אושר עוד יותר על ידי כתמי O אדומים של שמן ביום 14 וביום 21, מה שמרמז על יכולתם של תאים אלה להתמיין לאדיפוציטים. מצד שני, לא נצפו טיפות שמן נראות לעין בתאים שגודלו בתרבית בהיעדר גורמים מעוררי אדיפוגניים (איור 3B,C).

כדי לקבוע את הפוטנציאל הכונדרוגני של התאים המבודדים, התאים היו עטופים בהידרוג'ל פלזמה והורשו להתמיין לשושלת הכונדרוגנית. כפי שמתואר מהתמונות הגסות של הידרוג'ל הפלזמה (איור 4A), הניאו-רקמה שנוצרה לאחר 14 יום בקבוצה המושרה נראתה לבנה ומבריקה (בדומה לסחוס המפרקי), ואילו בקבוצה הלא מושרית, היא הייתה לבנה חיוורת, ונצפתה ברק מופחת. בנוסף, התאים בקבוצה המושרה הצליחו להפריש את אחד המרכיבים העיקריים של מטריצת הסחוס (כלומר, גליקוזאמינוגליקנים סולפטים), עדות לכך היא כתמים היסטולוגיים חיוביים עבור כחול אלקסי (איור 4B) וספרנין O (איור 4C). לעומת זאת, מקטעי ההידרוג'ל מהקבוצות הלא מושרות היו שליליים לכתמים של ספרנין O וכחול אלקי. תוצאות אלה מצביעות באופן קולקטיבי על פוטנציאל ההתמיינות הכונדרוגנית של ה-MSCs בנוכחות גירויים כונדרוגניים בלבד.

התאים המבודדים הדגימו גם פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני. לאחר 14 יום ו -21 ימים בתרבית, לא נצפתה מינרליזציה ספונטנית (קבוצה לא מושרית). עם זאת, כאשר מושרה עם מדיה אוסטאוגנית, מינרליזציה ניכרה על ידי צביעה חיובית עבור phosphatase אלקליין (ALP) בתום 14 ימים (איור 5A). יתר על כן, לאחר 28 ימים של תרבית במדיה אוסטאוגנית, תצהירים שסומנו הודגמו על-ידי צביעה חיובית של Alizarin Red-S (איור 5B). תוצאות אלה מראות שלתאים המבודדים מפד השומן התת-ת-כוכבי של עזים, כאשר הם מושרים, יש פוטנציאל להתמיין לשושלות אדיפוגניות, כונדרוגניות ואוסטיאוגניות.

Figure 1
איור 1: סכמטי לבידוד של IFP-MSC מהמפרק המחניק של ברך העז. שלב 1. לאסוף את דגימת ברך העז מבית המטבחיים ולהמשיך עם הנתיחה בארון בטיחות ביולוגית; שלב 2. בזהירות לבחון את האנטומיה של הרקמה ולהסיר את השרירים הסובבים ואת רקמת השומן; שלב 3. מבלי להפריע לקפסולה המשותפת, להסיר את השרירים ואת רקמות השומן כדי לחשוף לחלוטין את שתי העצמות הארוכות (עצם הירך ואת השוקה); שלב 4. לבצע חתך בקרום סינוביום ולחתוך לפתוח את המפרק המפרקי כדי לחשוף את הסחוס patella ו trochlear; שלב 5. הסר את הפטלה מהמפרק המפרקי בזהירות, מבלי להפריע לכרית השומן האינפרא-פטלרית (IFP), ושמור אותה על צלחת פטרי המכילה PBS; שלב 6. מסירים באיטיות את כל כרית השומן מהפטלה ושומרים אותה בצלחת פטרי טרייה לטחינה ולעיכול אנזימטי. (א. עצם הירך, ב. טיביה, ג. פטלה, ד. סחוס טרוכליר, ה. כרית שומן אינפרא-פטלרית). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה ופוטנציאל קלונוגני של IFP-MSCs . (A) מיקרוגרפים צולמו במעבר 3 באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך בהגדלה של פי 10. מיד לאחר הזריעה (יום 0), התאים נשארו עגולים בצורתם, ביום 3 רוב התאים השיגו מורפולוגיה מוארכת, וביום 6 ה-IFP-MSCs הפכו למפגש של 80%-90% (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (B) תמונות מייצגות (n = 3) של מושבות CFU-F מוכתמות בצבע סגול גבישי לאחר 12 יום של זריעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: התמיינות אדיפוגנית של IFP-MSCs. הלוח העליון מציין מיקרוגרפים של IFP-MSCs לא מושרים, והלוח התחתון מייצג IFP-MSCs המושרים לשושלת האדיפוגנית. (A) תמונות מייצגות של שדה בהיר המציגות את היווצרותם של ואקואולות שומנים במהלך אדיפוגנזה (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). תמונות מייצגות של צביעת O אדום שמן של טיפות שומנים ביום (B) 14 ו-(C) ביום 21 של הבחנה (סרגל סולם = 20 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: התמיינות כונדרוגנית של IFP-MSCs. הפאנל העליון מציין מבנים/חתכים של הידרוג'ל מהידרוג'ל לא מושרה, והפאנל התחתון מייצג הידרוג'ל הנתון לכונדרוגנזה. (A) תמונות גסות של מבני הידרוג'ל פלזמה לאחר 14 יום בתרבית בהיעדר (לא מושרה) או נוכחות (מושרית) של מדיה כונדרוגנית בתוספת TGF-β1. תמונות מייצגות של מקטעי 10 מיקרומטר של הידרוג'ל מוכתמים בצבע מחייב sGAG (B) כחול אלקסי (כחול) ו- (C) ספרנין O (אדום) (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: התמיינות אוסטאוגנית של IFP-MSCs. הלוח העליון מציין תאים לא מושרים, והלוח התחתון מציין תאים המושרים במדיה אוסטאוגנית. מיקרוגרפים ותמונות מייצגות של IFP-MSCs מוכתמים ב-(A) BCIP-NBT (פוספטאז אלקליין) לאחר 14 יום ו-(B) אליזרין אדום-S (תצהיר סידן) לאחר 28 ימים של התמיינות (סרגל סולם = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי, שיטה פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור לבידוד של MSCs מ- IFP עזים סופקה. תאים שבודדו בשיטה זו שימשו בהצלחה במחקרים הקודמים שלנו להתחדשות רקמות במבחנה. נצפה כי התאים המבודדים היו מתרבים, היו מגיבים לגורמי גדילה שונים, ושמרו על פעילותם הביולוגית כאשר נזרעו על גבי סיבים חשמליים ופיגומים25,26. יתר על כן, נצפה כי ניתן להשיג מספר רב של MSCs באיכות גבוהה ולתרבת אותם יחד עם כונדרוציטים בהידרוג'לים הניתנים להזרקה כדי להנדס סחוס מפרקי במבחנה27,28,29. בעוד שההליך לנתיחה ובידוד של תאים הוא פשוט, ישנם כמה שלבים שיש לעקוב אחריהם בקפידה לבידוד והרחבה מוצלחים של MSCs מ- IFP. ראשית, מכיוון שלא ניתן לשמור על תנאים אספטיים באמת בעת הבאת הדגימה מבית המטבחיים, מומלץ לנגב את הרקמה החיצונית ב-70% אתנול כדי לעקר את הרקמה לפני תחילת הליך הבידוד. השלב החשוב הבא הוא כריתת כרית השומן ממפרק הברך. ה-IFP ממוקם מתחת לפטלה במפרק הברך. הקצה הפרוקסימלי של ה- IFP מחובר לקצה הדיסטלי של הפטלה30,31. לפיכך, חשוב מאוד לזהות את המיקום הנכון של הפטלה בעת ביצוע הליך הבידוד. לאחר מכן, כאשר IFP מתפרק עם סחוס הטרוכליאר בעצם הירך ומכוסה בקרום הסינוביום30,31, יש צורך לבצע חתך בקרום הסינוביום כדי לחתוך את מפרק הברך. כמו כן, חשוב לבחון את הבריאות הכללית של כרית השומן האינפרא-פטלרית שנאספה. מכיוון שה-IFP מורכב מאדיפוציטים (תאים) ורקמת חיבור של שומן, כגון קולגן וגליקוזאמינוגליקנים, הרקמה נטחנת ומתעכלת באמצעות אנזים קולגן כדי לשחרר את התאים 9,32. האדיפוציטים הצפים מופרדים על ידי צנטריפוגה במהירות איטית כדי לקבל תרבית הומוגנית של MSCs. יש להסיר את האדיפוציטים הנותרים בחלק כלי הדם הסטרומלי מצלחת תרבית הרקמה בכל שינוי מדיה על ידי שטיפת מונולייר התא עם PBS לפני הוספת מדיה טרייה. יש להמשיך בשלב זה עד להסרת כל האדיפוציטים הנראים לעין. מומלץ לזרוע מחדש את התאים בצלחת חדשה לאחר שתאי P0 מגיעים למפגש כדי להיפטר מהאדיפוציטים הנותרים, שייתכן שנדבקו לדופן הצלחת וקשה להסירם. לבסוף, מכיוון שדגימות העזים מתקבלות ברובן מבית מטבחיים, קשה להתחקות אחר גילה המדויק של העז, ולכן, בעת בידוד התאים, יש לבחון ולתעד בקפידה את השונות בין הדגימות. מוצע לאפיין את התאים לצורך התחדשות עצמית (CFU-F), שגשוג ופוטנציאל התמיינות לאחר כל בידוד לפני שהם משמשים ליישומים שונים ולמחקרים מכניסטיים. בשל הדרישה של מספר רב של תאים ביישומי הנדסת רקמות מבוססי תאים, תנאי התרבית המאפשרים התפשטות, מעכבים את הסנסנציה ושומרים על גזע התאים הופכים להיות בעלי חשיבות מרכזית. נצפה כי MSCs שגודלו בתרבית של 2-Phospho-L-חומצה אסקורבית מלח טריסודיום (PAA) וגורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF) הראו עלייה של פי ~42 במספרם בהשוואה ל-MSCs שגודלו בתרבית bFGF בלבד. בנוסף, הטיפול המשותף ב-PAA וב-bFGF הפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי (בשל תכונותיהם נוגדות החמצון) ואת הסנסנציה בתאי גזע. לכן, השימוש ב- PAA במהלך הרחבה חוץ גופית של MSCs רצוי33.

בעוד שעיכול אנזימטי של רקמות נמצא בשימוש אוניברסלי והוא שיטה יעילה לבידוד MSCs, השימוש באנזימים כגון קולגן גוזל זמן ויקר34. במחקר הנוכחי, העיכול המלא של הרקמה באמצעות קולגן לקח 12-16 שעות (לילה), מה שעלול להוביל לירידה בכדאיות או לשינוי פנוטיפ פני השטח של תאים35. לפיכך, השיטה יכולה להיות מותאמת עוד יותר כדי להפחית את משך הטיפול collagenase לעיכול רקמות. לחלופין, ניתן לחקור גם שיטת תרבית explant נטולת אנזימים המשמשת לבידוד של MSCs שמקורם בשומן מליפואספירטים או רפידות שומן מפשעתיות לבידוד של IFP-MSCs34,36,37.

IFP-MSCs, בשל יכולתם להתבדל לשושלות כונדרוגניות, אדיפוגניות ואוסטיאוגניות, הן בעלות פוטנציאל טיפולי רחב. דוחות קודמים הראו כי IFP-MSCs מפגינים פוטנציאל כונדרוגני טוב יותר מאשר תאי גזע אחרים 6,7,9,10. לפיכך, IFP-MSCs צברו עניין ונחשבים למועמדים טובים יותר לטיפול מבוסס תאים לתיקון פגמים בסחוס ולהקלה על התדרדרות הסחוס בדלקת מפרקים ניוונית. במחקר פרה-קליני, העברה משותפת של IFP-MSCs עם רכיבי מטריצה חוץ-תאית של סחוס באמצעות הזרקה תוך-מפרקית הביאה להתחדשות סחוס משופרת בפגמים אוסטאוכונדרליים38. באופן דומה, הזרקה תוך-מפרקית של IFP-MSCs במודל אוסטאוארתריטיס ארנבת (OA) הובילה לירידה בפרמטרים הבאים של המחלה: פירוק סחוס, היווצרות אוסטאופיטים, עיבוי עצם תת-כונדרלית וסינוביטיס39. יתר על כן, תוצאות מניסוי קליני אקראי13 שדווח בעבר ומניסוי קליני ברמה פתוחה שלב 140 שפורסם לאחרונה הראו כי זריקות תוך-מפרקיות של IFP-MSCs בחולים עם דלקת מפרקים ניוונית בברך הן בטוחות ומביאות להפחתת כאבים ולשיפור בתפקוד המפרקים, מה שמעיד על הפוטנציאל הטיפולי המבטיח שלהם בהקלה על סיבוכים הקשורים ל-OA בברך. כמו כן, הוכח כי IFP-MSCs מפתחים תכונות אימונומודולטוריות מוגברות בנוכחות רמזים פרו-דלקתיים על ידי הקלה על פירוק של מווסת דלקתי, חומר P (SP), מה שמוביל לירידה במולקולות פרו-דלקתיות וקטבוליות, וכתוצאה מכך, טיפול משופר בדלקת ובפיברוזיס של סינוביום ו-IFP6 . חשוב מכך, IFP-MSCs שעובדו בתנאים תואמי רגולציה הראו שגשוג, יכולת התמיינות ותכונות אימונומודולטוריות טובות יותר בהשוואה לתנאי תרבית חוץ גופית סטנדרטיים, מה שמדגים את הפוטנציאל שלהם להצלחה קלינית כאשר משתמשים בהם לטיפול מבוסס תאי גזע מזנכימליים (MSC)41.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בידודם של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) שמקורם ב-INFRAPATELLAR FAT PAD (IFP) ממפרק העיזים המחניק על ידי עיכול אנזימטי ותחזוקתם בתרבית. לתאים המבודדים יש פוטנציאל שגשוג והתחדשות עצמית והם יכולים להתמיין לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות. IFP-MSCs הם מקור מבטיח של MSCs ויש להם פוטנציאל תרגום ליישומי רפואה רגנרטיבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgments

SH מודה על תמיכה ממלגת המכון לפוסט-דוקטורט של IIT Kanpur ומענק SYST מ-DST (חטיבת SEED) (SP/YO/618/2018). AM מודה למכון ההודי לטכנולוגיה-קנפור (IIT-Kanpur) על מלגת המכון. DSK מכירה בקתדרה ע"ש ג'ריש ג'נקינאת ופרופסור ובמחלקה לביוטכנולוגיה, הודו, למימון (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH ו-DSK מודים למרכז משפחת מהטה להנדסה ברפואה ב-IIT-Kanpur על תמיכתם הנדיבה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422-10G 10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA Hi-Media TCL049
15-mL centrifuge tube Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G 50 µg/mL
2-Propanol Sigma-Aldrich I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) HiMedia TCL021-50ml 10 mM
50-mL centrifuge tube Corning
Alcian Blue Hi-Media RM471 For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S S D Fine-Chem Limited 26048-25G For calcium deposition
Amphotericin B HiMedia A011 2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Sino Biologicals 10014-HNAE 5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate Sigma B5655-5TAB For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA HiMedia MB-083 Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer HiMedia TCP-182 70 µm
Centrifuge REMI
Ciprofloxacin RANBAXY LAB. Limited B17407T1 2.5 µg/mL
Crystal Violet S D Fine-Chem Limited 42555
D(+)-glucose Merck 1.94925.0521 25 mM
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915 1 µM
DMEM LG SIGMA D5523 Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol Merck 100983
FBS Gibco 10270 Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41% Merck 61780805001730
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378 100 µM
Insulin Sigma-Aldrich I9278 10 µg/mL
Inverted microscope Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1 Sigma-Aldrich I2521-5mL Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline HiMedia TO-109-25G 1 mM
Magnesium chloride Merck 61751605001730 For lysis buffer
Methanol Meck 1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) Thermoscientific
MUSE Cell analyser Merck Millipore For cell counting
OCT compound Tissue-Tek 4583 Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye S D Fine-Chem Limited 54304 For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin HiMedia A007 100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm) NEST
Safranin O S D Fine-Chem Limited 50240 For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate Sigma-Aldrich C3434 3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels For isolation of IFP-MSC
Sucrose Merck 1.94953.0521 35 % (w/v)
TGF-β1 Sino Biologicals Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 Thermoscientific
Tris buffer Merck 61771405001730 For lysis buffer
Triton X100 S D Fine-Chem Limited 40632 For lysis buffer
Type II collagenase Gibco 17101015 1.5 mg/mL
Vitamin D3 Sigma C9756-1G 10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP) NEST

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  2. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
  3. Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
  4. Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
  5. Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
  6. Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
  7. Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
  8. Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
  9. Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
  10. Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
  11. Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
  12. Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
  13. Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
  14. Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
  15. Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
  16. Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
  17. Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
  18. Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
  19. Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
  20. Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
  21. Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
  22. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
  23. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  24. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  25. Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
  26. Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
  27. Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
  28. Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
  29. Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
  30. Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
  31. Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
  32. Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
  33. Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
  34. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  35. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  36. Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
  37. Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
  38. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  39. Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
  40. Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
  41. Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 186 עז פד שומן אינפרא-כוכבי (IFP) תאי גזע מזנכימליים (MSCs) בידוד תאים תרבית תאים פוטנציאל רב-תחומי רפואה רגנרטיבית הנדסת רקמות
בידוד, הרחבה והתמיינות של תאי גזע מזנכימליים ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק העיזים מחניק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahajan, A., Hazra, S., Arora, A.,… More

Mahajan, A., Hazra, S., Arora, A., Katti, D. S. Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint. J. Vis. Exp. (186), e63617, doi:10.3791/63617 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter