Summary
髌下脂肪垫间充质干细胞（IFP-MSCs）可以很容易地从膝关节的髌下脂肪垫中分离出来。它们 在体外增殖良好，形成CFU-F集落，并分化为成脂、软骨和成骨谱系。本文提供了从山羊扼杀关节分离、扩增和分化IFP-MSCs的方法。
Abstract
存在于膝关节中的IFP是MSC的有希望的来源。IFP是一种易于接近的组织，因为它在关节镜手术和膝关节置换手术中被常规切除和丢弃。此外，其移除与最低供体部位发病率相关。最近的研究表明，IFP-MSCs在 体外 扩增过程中不会失去其增殖能力，并且具有与年龄无关的成骨分化潜力。与骨髓来源的MSC（BMSC）和脂肪来源的干细胞（ADSC）相比，IFP-MSCs具有优越的软骨分化潜力。虽然这些细胞很容易从老年和患病患者中获得，但它们的有效性是有限的。因此，使用来自健康供体的IFP-MSCs对于确定其在生物医学应用中的功效非常重要。由于获得健康的人类供体具有挑战性，动物模型可能是实现基本理解的更好选择。狗、马、绵羊和山羊等大型动物在转化研究中起着至关重要的作用。其中，山羊可能是首选模型，因为山羊的窒息关节与人类膝关节的解剖结构最接近。此外，山羊IFP可以满足组织再生应用所需的更高MSC数。此外，低成本、可用性和符合动物研究的 3R 原则使其成为一个有吸引力的模型。本研究展示了一种简单的方案，用于从山羊的扼杀关节和 体外 培养条件下分离IFP-MSCs，以实现其扩增和分化。从山羊中无菌分离的IFP被洗涤，切碎并酶消化。过滤和离心后，将收集的细胞培养。这些细胞是贴壁的，具有MSCs样形态，并显示出显着的克隆生成能力。此外，它们分化为成脂肪、软骨和成骨谱系，证明了它们的多能性。总之，该研究证明了间充质干细胞的分离和扩增，显示出在组织工程和再生医学应用中的潜力。
Introduction
间充质干细胞（MSCs）是再生医学中基于细胞的疗法的有吸引力的候选者1，2。它们可以从各种组织来源中收获，例如骨髓、脐带、胎盘、牙髓和皮下脂肪组织3.然而，由于成人干细胞的可用性有限，并且它们的分离程序通常是侵入性的（导致供体部位的发病率），因此希望有一种替代的干细胞来源来规避这些挑战。
膝关节是各种细胞类型的储存库，如髌下脂肪垫衍生的MSC，滑膜来源的MSC，滑液来源的MSC，韧带成纤维细胞，关节软骨细胞等4，5，6。这些细胞有可能在基于肌肉骨骼组织工程的研究中得到广泛探索。因此，膝关节可能是多种类型间充质干细胞的可能和可靠来源。 位于膝关节的脂肪库，称为髌下脂肪垫（IFP）或霍法脂肪垫，是MSC储存库的有前途的替代选择。IFP是一种相对容易获得和临床上可获得的MSCs来源，因为它在膝关节镜检查或开放膝关节手术中被常规切除并作为手术废物丢弃。去除IFP与最低供体部位发病率相关，这也使其成为一种有吸引力的组织来源。虽然具有相似的表型特征，但与骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）6相比，IFP（IFP-MSCs）的MSCs具有增强的克隆生成潜力，与皮下脂肪来源干细胞（ADSC）相比，具有更好的增殖能力7。有趣的是，与滑液衍生的MSC（SF-MSCs）相比，IFP-MSCs在晚期传代时不会失去其增殖能力，在晚期传代时也不会增加倍增时间。这表明，在细胞扩增过程中，IFP-MSCs可以实现足够多的细胞用于体外组织工程应用，而不会影响其增殖速率8。最近的研究还表明，与骨髓来源的MSC（BMSC）和脂肪来源的MSC（ADSC）相比，IFP-MSCs具有优越的软骨分化潜力，这可能是因为它们在解剖学上接近关节软骨，表明它们适用于软骨组织工程6，7，9，10。此外，它们还具有与年龄无关的成骨分化潜力11。关节内注射IFP-MSC已被证明可以减轻骨关节炎（OA）患者的疼痛并改善膝关节功能12，13。此外，还报道了在病理条件下存在炎性细胞因子的情况下IFP-MSCs的强免疫抑制反应和改善的免疫调节特性6。
IFP-MSCs是MSCs的一个有前途的替代来源;然而，它们在组织工程和再生医学中的治疗益处相对较少被探索。现有的IFP-MSCs研究主要利用了来自人类供体的细胞。其中，最近的一些研究调查了来自健康人类供体（非关节炎患者，年龄在17-60岁）的IFP-MSCs6，14，而大多数研究使用了来自接受全膝关节置换手术的老年患者（患病患者，年龄70-80岁）的IFP-MSC。由于已知年龄和疾病都会改变干细胞的正常功能（数量减少和功能潜力丧失），这可能导致基于MSC的研究结果不一致7，15，16，17。除此之外，来自病理生理状况（例如关节炎和肥胖症）患者的IFP-MSC的使用也给体外理解健康细胞的基本特征带来了困难，从而成为基于MSCs的疗法开发的限制因素。为了克服这些问题，使用来自健康供体的IFP-MSC至关重要。由于获得健康的人类供体具有挑战性，动物模型可能是更好的选择。在这方面，有一些研究已经从小鼠中分离出IFP18。然而，由于正常小鼠脂肪垫的尺寸很小，来自多种动物的脂肪组织已经结合以获得足够的组织来执行复杂的实验程序19。因此，需要一个大型动物模型，它可以满足对更多细胞的要求，同时符合动物研究中的3R原则（精制，替换和减少）20。大型动物的使用在转化研究中具有重要意义。具体来说，在肌肉骨骼组织工程中，已经研究了一系列大型动物，如狗，猪，绵羊，山羊和马21。山羊（Capra aegagrus hircus）是大型动物的绝佳选择，因为它的窒息关节与人类膝关节的解剖结构最接近22，23，24。山羊的软骨下骨小梁结构和软骨下骨厚度与人类相似，据报道软骨与骨骼的比例也接近人类21。此外，山羊在世界各地被广泛驯化，使它们在骨骼成熟时很容易获得。此外，低维护成本和易于操作使它们成为有吸引力的研究动物模型22。
在本研究中，展示了一种简单的方案，用于从山 羊（山 羊）的扼杀关节中分离IFP-MSCs，以及用于其扩增和分化的 体外 培养条件。分离的细胞是贴壁的，具有MSC样形态，形成CFU-F（集落形成单位成纤维细胞）集落，并具有脂肪，软骨和成骨分化潜力。因此，IFP-MSCs显示出作为生物医学应用MSCs替代来源的潜力。
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Protocol
该协议基于从山羊中分离IFP-MSC。山羊IFP和血液是从当地的屠宰场收集的。由于此类组织收集不属于机构动物伦理委员会的职权范围，因此不需要伦理批准。
1. IFP-MSCs与山羊膝关节股骨关节的分离
- 收集山羊股骨关节（样本），包括后肢的股骨和胫骨区域各~15厘米。立即将样品放入无菌样品收集盒中，并将其储存在4°C，以便运输到实验室进行进一步处理。在整个过程中使用无菌手术工具在生物安全柜中无菌处理样品（图1，步骤1）。
- 将样品放在 150 mm 培养皿上，并用补充有抗生素（5 μg/mL 两性霉素 B、200 U/mL 青霉素-链霉素和 50 μg/mL 环丙沙星）的高压灭菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 彻底冲洗，以避免污染。始终确保使用PBS保持样品水合。
- 仔细检查样本的解剖区域。为了便于进入关节囊，请确保完全去除两块长骨中多余的组织（图1，步骤2）。
- 为此，首先，用一只手握住股骨的末端表面，然后用锋利的剪刀向关节纵向切割。在此过程中，从骨骼中去除周围的肌肉和脂肪组织。请注意，即刻关节囊周围的组织最初保持不受干扰。
- 同样，在样本的胫骨端做另一个切口，并从胫骨中去除肌肉和脂肪组织。在此步骤之后，确保两个长骨都完全暴露并且关节囊清晰可见（图1，步骤3）。
- 接下来，从滑膜的任一侧切开一个切口以切开关节（图1，步骤4）。使用一批新鲜的消毒剪刀和镊子从滑膜和髌骨韧带上切开髌骨。立即将分离的髌骨保存在含有PBS的培养皿中（图1，步骤5）。
- 使用剪刀和镊子去除髌骨内表面上存在的整个脂肪垫，并将脂肪垫收集在另一个新鲜的培养皿中（图1，步骤6）。用手术刀将收集的脂肪垫切碎。根据需要包括其他手术工具（例如剪刀或手术刀片），以获得~2-3毫米的最小脂肪块/段。
注意：良好的切碎对于获得良好的细胞产量至关重要。始终保持组织水分，并且在分离过程的任何阶段都不要让它干燥。 - 使用刮刀将切碎的组织转移到50mL离心管中，并在试管混合器中用补充有抗生素的PBS洗涤15分钟。重复洗涤步骤3次，每次15分钟。
- 对于酶消化，将切碎的组织（~5g）在含有1.5mg / mLII型胶原酶（20mL）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM低葡萄糖）中孵育，并在37°C下补充2%FBS12-16小时。
注意：在试管混合器中以每分钟~15转（RPM）的速度进行消解。 - 小心地吸出消化的组织并通过细胞过滤器（70μm）过滤以去除任何未消化的组织。将滤液在150× g 的15mL离心管中离心5分钟。除去上清液并用DMEM低葡萄糖洗涤沉淀至少2倍。
注意：将消化的组织缓慢倒入过滤器中，以避免溢出。使用小容量离心管（15 mL）获得良好的沉淀。 - 将获得的细胞沉淀重悬于完全DMEM培养基中（补充有10%FBS和抗生素的DMEM低葡萄糖[2.5μg/ mL两性霉素，100 U / mL青霉素链霉素和25μg/ mL环丙沙星]），在后续步骤的方案中称为扩增培养基。
- 将细胞接种在 150 mm 培养皿上，并在补充有 5 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 和 50 μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的扩增培养基中培养。将细胞在37°C的5%CO2 培养箱中孵育，以使细胞粘附和增殖。每天监测细胞的附着和生长。
2. 隔离细胞的维护和扩增
- 每3天更换一次培养基，直到细胞汇合。每次更换培养基时，将新鲜的 5 ng/mL bFGF 和 50 μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐直接添加到培养皿中。细胞汇合80%-90%后，传代培养细胞。
注：在每次更换介质期间移除非粘附实体。如果在孵育3天后看到油滴，用PBS 1x洗涤细胞，然后将新鲜培养基添加到培养皿中。在更换每种介质之前继续PBS清洗，直到油滴完全去除。 - 细胞传代培养：从培养皿中取出扩增培养基，并用PBS洗涤细胞1x。向培养皿中加入4mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA，并将细胞在37°C的5%CO2 培养箱中孵育4分钟。
注意：汇合度（80%-90%）在7天内实现。在胰蛋白酶消化过程中将胰蛋白酶/ EDTA溶液均匀分布在培养皿的整个表面上。 - 通过敲击侧面的板并在显微镜下观察来去除细胞，以确认所有细胞都已分离。加入等体积（4 mL）的扩增培养基后中和胰蛋白酶。
- 使用移液管在新鲜的15 mL聚丙烯管中收集解离的细胞，并在室温下以150 x g 离心5分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于所需体积的膨胀培养基中。
- 使用标准细胞计数方法计数细胞并在150mm培养皿中以1 x 104个细胞 / cm2 的接种密度传代培养以进一步扩增。对于所有测定，使用传代数为 P2-P5 的汇合单层细胞。
注意：冷冻保存多余的细胞。
3. 使用集落形成测定法（CFU-F）评估IFP-MSCs的克隆生成能力
- 对于CFU-F测定，将细胞接种在6孔组织培养板中的扩增培养基中，接种密度为50-100个细胞/ cm2。加入培养基以获得 3 mL 的最终体积。
注意：优化细胞浓度以进行测定和处理。 - 在标准培养条件下，在5%CO2 培养箱中在37°C下培养细胞12天，以使细胞形成菌落。每 3 天更换一次介质。更换介质时要轻柔。
- 12天后，用PBS冲洗菌落1次，并在室温下用20%甲醇固定20分钟。 用结晶紫染料（0.5%[w / v]在20%甲醇中）在室温下染色菌落20分钟。 使用倒置显微镜计数单个菌落。
注意：菌落定义为超过50个细胞的簇。
4. IFP-MSCs的分化潜力
- 诱导IFP-MSCs的成脂分化
- 为了诱导脂肪生成，在24孔组织培养板中以25 x 103 细胞/cm 2 的密度接种细胞。加入培养基以获得 500 μL 的最终体积。 在5%CO2 培养箱中以37°C培养细胞。
- 汇合后一天，用 500 μL 脂肪分化培养基替换膨胀培养基。细胞大约需要 2 天才能达到汇合。
- 通过补充扩增培养基（DMEM + 10% FBS + 2.5 μg/mL 两性霉素、100 U/mL 青霉素-链霉素和 25 μg/mL 环丙沙星）与 25 mM D （+）-葡萄糖、10 μg/mL 胰岛素、1 μM 地塞米松和 100 μM 吲哚美辛来制备成脂肪分化培养基。
注意：1个月后分化培养基在4°C下不稳定;因此，请在需要时准备介质。 - 考虑在补充有25mM D （+）葡萄糖的扩增培养基中培养的细胞作为未诱导的对照。每 3 天更换一次介质，持续 14 天。在14天结束时，用PBS洗涤细胞1倍。使用中性缓冲福尔马林（NBF;PBS中的4%甲醛）在4°C下固定细胞15分钟。
- 固定后，用蒸馏水洗涤孔1x，然后在室温下用60%异丙醇孵育细胞5分钟。去除异丙醇后，通过将细胞与500μL油红O染料的工作溶液在室温下孵育5分钟来染色脂滴。 用蒸馏水洗涤孔1x以除去未结合的染料并使用倒置显微镜对细胞进行成像。
注意：通过将 300 mg ORO 溶解在 100 mL 99% 异丙醇中来制备油红 O （ORO） 储备溶液。为了制备工作溶液，混合三份库存ORO和两份蒸馏水，使其在室温下混合10分钟。使用0.2μm滤纸过滤混合物。工作解决方案已准备就绪。储备溶液可以在室温下在黑暗中制备和储存1个月，而工作溶液需要在每次使用/染色之前新鲜制备。
- 诱导IFP MSC的软骨分化
- 山羊血浆的分离：
- 在蒸馏水中制备3.4%（w / v）柠檬酸钠。将 5 mL 制备的柠檬酸钠溶液加入 50 mL 离心管中。
- 在同一管中收集 45 mL 新鲜分离的山羊血。立即倾斜试管，将血液与柠檬酸钠彻底混合以防止凝固，并将其运送到4°C的实验室。
- 将收集的山羊血在4°C下以1000× g 离心20分钟。 将上清液（血浆）转移到生物安全柜内的新鲜管中。通过0.2μm过滤器过滤血浆，等分试样，并储存在-20°C以备进一步使用。
注意：处理样品时保持2-8°C的温度。尽量减少血浆的冻融循环很重要。
- 将扩增的细胞培养至80%-90%汇合度，使用胰蛋白酶/ EDTA溶液解离细胞，并在15 mL离心管中以150 x g 沉淀细胞5分钟。将沉淀重悬于山羊血浆中，密度为每50μL血浆溶液2 x 106 个细胞。
- 将一滴含血浆的细胞（50μL）加入灭菌的90mm培养皿上，然后加入终浓度为0.3%（w / v）的氯化钙。充分混合以制造交联等离子水凝胶。
- 将制备的水凝胶在37°C孵育40分钟。孵育后，将水凝胶转移到含有成软骨培养基的24孔组织培养板中。
- 通过补充 DMEM 低血糖制备 DMEM 低血糖 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸 （HEPES）、1.25 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA）、1 mM 脯氨酸、50 μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、100 nM 地塞米松、1x 胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠 + 亚油酸 BSA （ITS+1）、抗生素（2.5 μg/mL 两性霉素、100 U/mL 青霉素-链霉素和 25 μg/mL 环丙沙星）， 和 10 ng/mL 转化生长因子 - β1 （TGF-β1）。
- 在完全DMEM培养基（DMEM低葡萄糖与10%FBS和抗生素[2.5μg/mL两性霉素，100 U/mL青霉素-链霉素和25 μg/mL环丙沙星]）中培养的水凝胶，不含TGF-β1被认为是非诱导对照。每 3 天更换一次介质，持续 14 天。
- 在血浆水凝胶中细胞的软骨分化14天后，用PBS 3x洗涤水凝胶每次5分钟，然后将样品固定在NBF中3小时。
注意：甲醛是一种潜在的致癌物质，吸入后会对鼻子、喉咙和肺部造成刺激。在通风橱中执行与甲醛相关的所有程序。 - 除去NBF，用PBS 3x洗涤水凝胶，每次5分钟，然后在室温下在35%（w / v）蔗糖中孵育过夜，以使溶液完全吸收到样品中。将水凝胶在最佳切割温度（OCT）化合物中适应3小时。在液氮下使用硅胶模具将样品嵌入OCT化合物中。
- 使用冷冻切片机在明胶涂层载玻片上以10-12μm的厚度切割样品，并将其储存在-20°C以备将来使用。为了检查软骨分化后细胞外基质的存在或沉积，用与硫酸化糖胺聚糖结合的Alcian Blue和Safranin-O染料对切片进行染色。
注意：要制备阿尔新蓝染料，请将 1 g 阿尔新蓝染料溶解在 100 mL 的 0.1 N HCl 中，并在试管混合器中充分混合过夜。该溶液可以在室温下在黑暗中储存1个月。要制备Safranin-O染料，请将0.1gSafranin-O染料溶解在100 mL蒸馏水中，并在试管混合器中充分混合过夜。 - 对于阿尔新蓝染色，用蒸馏水洗涤水凝胶切片1x5分钟。要固定切片，请在载玻片中加入 4% NBF 并孵育 30 分钟。
- 用蒸馏水1x洗涤切片5分钟，然后用0.1N HCl洗涤2x，每次30秒。取出HCl，用薄纸轻轻擦干载玻片。将准备好的阿尔新蓝染色剂加入切片，并在加湿室中于37°C孵育30分钟。
- 用0.1N HCl洗涤未结合的染料，然后蒸馏水洗涤3分钟。在无水乙醇中脱水切片，用二甲苯清除它们，最后将染色切片安装在树脂介质中进行成像。
- 对于Safranin-O染色，用蒸馏水洗涤水凝胶切片1x5分钟。要固定切片，请在载玻片中加入 4% NBF 并孵育 30 分钟。用蒸馏水清洗切片1x5分钟，然后将载玻片浸入1%乙酸中10-15秒。用薄纸轻轻擦干载玻片。
- 将准备好的Safranin-O染料添加到切片中，并在室温下孵育10分钟。 用100%乙醇洗涤未结合的染料。将载玻片浸入100%乙醇中5分钟。风干载玻片，用二甲苯清除它们，最后将染色部分安装在树脂介质中进行成像。
- 山羊血浆的分离：
- 诱导IFP MSC的成骨分化
- 为了诱导成骨分化，如前所述，胰蛋白酶消化细胞（步骤2.2）。在24孔组织培养板中以3 x 103 细胞/ cm2 的密度接种细胞。加入培养基以获得 500 μL 的最终体积。 在5%CO2 培养箱中以37°C培养细胞。接种后 1 天，用 500 μL 成骨分化培养基替换膨胀培养基。
- 通过补充扩增培养基（DMEM + 10% FBS + 2.5 μg/mL 两性霉素、100 U/mL 青霉素-链霉素和 25 μg/mL 环丙沙星）与 25 mM D （+）-葡萄糖、10 nM 地塞米松、10 mM β-甘油磷酸盐、50 μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐和 10 nM 维生素 D3 来制备成骨培养基。
注意：在补充有25mM D （+）葡萄糖的扩增培养基中培养的细胞被认为是未诱导的对照。 - 每 3 天更换一次成骨培养基，持续 14 天或 28 天。在 14 天结束时，通过碱性磷酸酶 （ALP） 染色测量成骨程度。
注意：要制备用于ALP染色的底物，请将一片5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）/硝基蓝四唑（NBT）片剂溶解在15 mL离心管中的10 mL蒸馏水中。让片剂完全溶解。基材溶液已准备就绪。由于底物溶液不能储存更长时间，因此根据需要将片剂分成两半，并将其溶解在5mL蒸馏水中。要制备透化缓冲液，请将Tris缓冲液（100mM）和氯化镁（5mM）加入蒸馏水中。将Triton X100（0.1%）加入溶液中，使其溶解。将溶液的pH值调节至9.25-9.75。 - 对于ALP染色，诱导14天后，取出培养基并用PBS洗涤细胞。使用NBF（4%）固定细胞1分钟。用PBS洗涤细胞并使用制备的裂解缓冲液渗透2-3分钟。
- 向细胞中加入 500 μL 制备的底物溶液，并根据表达水平孵育 15 分钟至 1 小时。检查紫色/蓝色之间的发展。
- 取出底物溶液并用蒸馏水洗涤。使用倒置显微镜对染色细胞进行成像。
- 在28天结束时，测量通过茜素Red-S染色诱导成骨后的钙化程度。
注意：要制备茜素红-S染色溶液（40mM），请将2g茜素红-S溶解在100mL蒸馏水中，并用HCl或NH 4 OH将pH调节至4.1-4.3。通过0.22μm膜过滤溶液，并在黑暗中储存在4°C。溶液的pH值很重要;因此，建议制作新鲜溶液或重新测量溶液的pH值，如果溶液超过1个月。 - 对于茜素红S染色，诱导28天后，取出培养基并用冷PBS洗涤细胞1倍。使用70%乙醇在4°C下固定细胞1小时。
- 取出固定剂并用蒸馏水洗涤细胞2次。完全除去水，向每个孔中加入 1 mL 茜素红 S 溶液。
- 将细胞与溶液在室温下孵育1小时，并使用倒置显微镜对细胞进行成像。
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Representative Results
从山羊股骨关节中分离IFP-MSCs的
将IFP-MSCs与山羊的窒息关节分离所涉及的步骤如图 1所示。去除髌骨内非关节表面的脂肪垫，切碎并酶消化。成功分离IFP-MSCs并在 体外 培养（图2A）。
IFP-MSCs的扩增和克隆生成能力
分离的细胞在扩增培养基中体 外 培养。细胞在接种后12小时内开始粘附在组织培养板上，并且在第0天大多呈圆形。它们均匀地粘附在板上，并在24小时内达到细长的形态。这种形态在整个培养过程中保持不变。细胞在培养物中有效增殖，并在扩增后6天内汇合80%-90%（图2A）。此外，分离的细胞显示出克隆生成能力，通过集落形成单位成纤维细胞（CFU-F）测定评估（图2B）。这些结果表明，分离出的细胞在 体外具有有效的增殖和自我更新能力。
IFP-MSCs的差异化潜力
为了表征分离的细胞是否具有多能细胞并具有MSC的特征，诱导它们分化为多个谱系。当诱导到成脂谱系时，分离的细胞会产生脂滴，从明场图像中可以观察到（图3A）。在第14天和第21天的油红O染色进一步证实了这一点，表明这些细胞能够分化成脂肪细胞。另一方面，在没有脂肪诱导因子的情况下，在培养的细胞中没有观察到可见的油滴（图3B，C）。
为了确定分离细胞的软骨生成潜力，将细胞封装在血浆水凝胶中并使其分化为成软骨谱系。如血浆水凝胶的总图像（图4A）所示，诱导组14天后形成的新生组织呈现白色和光泽（类似于关节软骨），而在未诱导组中，它是淡白色，并且观察到光泽度降低。此外，诱导组中的细胞能够分泌软骨基质的主要成分之一（即硫酸化糖胺聚糖），阿尔新蓝（图4B）和Safranin O（图4C）的组织学染色阳性证明了这一点。相比之下，来自未诱导组的水凝胶切片对Safranin O和Alcian Blue染色呈阴性。这些结果共同表明，MSCs仅在存在软骨刺激的情况下具有成软骨分化潜力。
分离的细胞也显示出成骨分化的潜力。培养14天和21天后，未观察到自发矿化（未诱导组）。然而，当用成骨介质诱导时，在14天结束时碱性磷酸酶（ALP）的阳性染色明显地矿化（图5A）。此外，在成骨培养基中培养28天后，通过阳性茜素Red-S染色可视化钙化沉积（图5B）。这些结果表明，从山羊髌下脂肪垫中分离出的细胞在诱导时具有分化为成脂肪、软骨和成骨谱系的潜力。
图1：IFP-MSC与山羊膝关节的隔离示意图。 第 1 步。从屠宰场收集山羊膝盖样本，并在生物安全柜中进行解剖;第 2 步。仔细检查组织的解剖结构，去除周围的肌肉和脂肪组织;第 3 步。在不干扰关节囊的情况下，去除肌肉和脂肪组织，以完全暴露长骨（股骨和胫骨）;第 4 步。在滑膜上切开一个切口，切开关节，露出髌骨和滑车软骨;第5步。小心地从关节上取下髌骨，不要干扰髌下脂肪垫（IFP），并将其保存在含有PBS的培养皿上;第 6 步。慢慢地从髌骨上去除整个脂肪垫，并将其保存在新鲜的培养皿中，以进行切碎和酶消化。（a. 股骨、b. 胫骨、c. 髌骨、d. 滑车软骨、e. 髌下脂肪垫）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：IFP-MSCs的形态学和克隆发生潜力 。 （A）在第3代使用倒置明场显微镜以10倍放大倍率拍摄显微照片。接种后（第0天），细胞立即保持圆形，在第3天，大多数细胞达到细长的形态，在第6天，IFP-MSCs变得80%-90%汇合（比例尺= 100μm）。（B）接种12天后用结晶紫染料染色的CFU-F菌落的代表性图片（n = 3）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：IFP-MSCs的成脂分化。 上图表示未诱导的IFP-MSC的显微照片，下图表示诱导到成脂谱系中的IFP-MSC。（A）代表性明场图像显示脂肪生成过程中脂质液泡的形成（比例尺= 100μm）。在分化的（B）第14天和（C）第21天（比例尺= 20μm）时脂滴的油红O染色的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。
图4：IFP-MSCs的成软骨分化。 上图表示来自未诱导水凝胶的水凝胶构建体/切片，下图表示经受软骨生成的水凝胶。（A）在没有（未诱导）或存在（诱导）补充有TGF-β1的成软骨培养基的情况下培养14天后血浆水凝胶构建体的总图像。用sGAG结合染料（B）阿尔新蓝（蓝色）和（C）Safranin O（红色）（比例尺= 100μm）染色的水凝胶切片的10μm的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。
图5：IFP-MSCs的成骨分化。 上图表示未诱导的细胞，下图表示由成骨培养基诱导的细胞。14天后用（A）BCIP-NBT（碱性磷酸酶）染色和（B）茜素红-S（钙沉积）染色的IFP-MSC的显微照片和代表性图像（比例尺= 100μm）。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在本协议中，提供了一种简单、可靠且可重现的从山羊IFP中分离MSCs的方法。使用这种方法分离的细胞已成功用于我们以前的体外组织再生研究。观察到分离的细胞是增殖的，对各种生长因子有反应，并且在接种在静电纺丝纤维和支架上时保持其生物活性25，26。此外，观察到可以获得大量高质量的MSCs并与可注射水凝胶中的软骨细胞共培养，以在体外设计关节软骨27，28，29。虽然细胞的解剖和分离程序很简单，但需要仔细遵循几个步骤才能从IFP中成功分离和扩增MSC。首先，由于从屠宰场取出样品时不可能保持真正的无菌条件，因此建议在开始分离程序之前用70%乙醇擦拭外部组织以对组织进行灭菌。下一个重要步骤是从膝关节解剖脂肪垫。IFP位于膝关节髌骨下方。IFP的近端连接到髌骨30，31的远端。因此，在执行隔离程序时确定髌骨的正确位置变得非常重要。接下来，由于IFP与股骨中的滑车软骨相连并被滑膜30，31覆盖，因此需要在滑膜上切开以切开膝关节。观察收集的髌下脂肪垫的整体健康状况也很重要。由于IFP由脂肪细胞（细胞）和脂肪结缔组织（例如胶原蛋白和糖胺聚糖）组成，因此使用胶原酶将组织切碎并消化以释放细胞9，32。通过缓慢离心分离漂浮的脂肪细胞，以获得均匀的MSC培养物。在加入新鲜培养基之前，必须在每次更换培养基时通过用PBS洗涤细胞单层从组织培养板中去除基质血管部分中的剩余脂肪细胞。此步骤需要继续，直到去除所有可见的脂肪细胞。建议在P0细胞达到汇合后将细胞重新接种在新板中，以去除剩余的脂肪细胞，这些脂肪细胞可能已粘附在板壁上并且难以去除。最后，由于山羊样本大多来自屠宰场，因此很难追踪山羊的确切年龄，因此，在分离细胞时，需要仔细观察和记录样本之间的差异。建议在每次分离后表征细胞的自我更新（CFU-F），增殖和分化潜力，然后再将其用于各种应用和机理研究。由于基于细胞的组织工程应用中需要大量细胞，因此促进增殖、延缓衰老和维持细胞干性的培养条件变得至关重要。观察到，与单独在bFGF中培养的MSC相比，在2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐（PAA）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）中培养的MSCs的数量增加了~42倍。此外，PAA和bFGF的共同处理减少了干细胞中活性氧的产生（由于其抗氧化特性）和衰老。因此，在MSCs的体外扩增期间使用PAA是可取的33。
虽然酶消化组织是普遍采用的并且是分离MSCs的有效方法，但使用胶原酶等酶既耗时又昂贵34。在本研究中，使用胶原酶对组织的完全消化需要12-16小时（过夜），这可能导致细胞35的活力降低或表面表型改变。因此，可以进一步优化该方法以缩短组织消化胶原酶治疗的持续时间。或者，也可以探索一种用于从脂吸物或腹股沟脂肪垫中分离脂肪来源的MSC的无酶外植体培养方法，以分离IFP-MSC34，36，37。
IFP-MSCs，由于其分化为软骨，脂肪和成骨谱系的能力，具有广泛的治疗潜力。以前的报告已经表明，IFP-MSCs比其他干细胞表现出更好的软骨生成潜力6，7，9，10。因此，IFP-MSCs引起了人们的兴趣，并被认为是基于细胞的治疗的更好候选者，用于修复骨关节炎的软骨缺陷和缓解软骨降解。在一项临床前研究中，IFP-MSCs与软骨细胞外基质成分通过关节内注射共同递送，导致骨软骨缺陷的软骨再生增强38。同样，在兔骨关节炎（OA）模型中关节内注射IFP-MSC导致以下疾病参数的减少：软骨退化，骨赘形成，软骨下骨增厚和滑膜炎39。此外，先前报道的随机临床试验13和最近发表的开放水平1期临床试验40的结果表明，膝关节骨关节炎患者关节内注射IFP-MSCs是安全的，可减轻疼痛并改善关节功能，表明其在改善膝关节OA相关并发症方面的治疗潜力。IFP-MSCs还被证明在存在促炎线索的情况下通过促进炎症调节因子P物质（SP）的降解而发展增强的免疫调节特性，从而减少促炎和分解代谢分子，从而改善滑膜和IFP6的炎症和纤维化的治疗.更重要的是，与标准体外培养条件相比，在符合法规的条件下处理的IFP-MSCs显示出更好的增殖，分化能力和免疫调节特性，这表明它们在用于基于间充质干细胞（MSC）的治疗时具有临床成功的潜力41。
总之，本协议描述了通过酶消化及其在培养中的维持从山羊扼杀关节中分离髌骨下脂肪垫（IFP）衍生的间充质干细胞（MSCs）。分离的细胞具有增殖和自我更新的潜力，可以分化为成脂肪、成骨和软骨谱系。IFP-MSCs是MSCs的一个有前途的来源，在再生医学应用中具有转化潜力。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
SH感谢IIT Kanpur研究所博士后奖学金和DST（SEED部门）的SYST资助（SP / YO / 618 / 2018）的支持。AM承认印度理工学院坎普尔分校（IIT-Kanpur）的研究所奖学金。DSK感谢印度Gireesh Jankinath讲座教授和生物技术系的资助（BT / PR22445 / MED/32 / 571 / 2016）。AM，SH和DSK感谢IIT-Kanpur的Mehta家庭医学工程中心的慷慨支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
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