Summary
膝下脂肪パッド間葉系幹細胞(IFP-MSC)は、膝関節の膝蓋下脂肪パッドから容易に単離することができる。それらは in vitroでよく増殖し、CFU-Fコロニーを形成し、脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系統に分化します。本明細書では、IFP-MSCsをヤギ窒息関節から単離、拡大、および分化するための方法論が提供される。
Abstract
膝関節に存在するIFPは、MSCの有望な供給源として機能します。IFPは、関節鏡手術や膝関節置換術中に日常的に切除および廃棄されるため、簡単にアクセスできる組織です。さらに、その除去は、最小限のドナー部位の罹患率に関連しています。最近の研究では、IFP-MSCは in vitro 拡張中に増殖能力を失わず、年齢に依存しない骨形成分化の可能性を有することが実証されています。IFP-MSCは、骨髄由来MSC(BMSC)や脂肪由来幹細胞(ADSC)と比較して、優れた軟骨形成分化能を有する。これらの細胞は高齢患者や罹患患者から容易に入手できるが、その有効性は限られている。したがって、健康なドナーからのIFP-MSCを使用することは、生物医学的用途におけるそれらの有効性を決定するために重要です。健康な人間のドナーへのアクセスは困難であるため、動物モデルは基本的な理解を可能にするためのより良い代替手段になる可能性があります。犬、馬、羊、山羊などの大型動物は、トランスレーショナルリサーチにおいて重要な役割を果たします。これらの中で、ヤギの窒息関節は人間の膝関節に最も近い解剖学的構造を持っているので、ヤギが好ましいモデルである可能性があります。さらに、ヤギIFPは、組織再生アプリケーションに必要なより高いMSC数を満たすことができます。さらに、低コスト、入手可能性、および動物研究の3R原則への準拠により、魅力的なモデルになっています。この研究は、IFP-MSCをヤギの窒息関節から分離するための簡単なプロトコルと、それらの増殖と分化のための in vitro 培養条件を示しています。ヤギから無菌的に単離されたIFPを洗浄し、ミンチし、酵素的に消化した。濾過及び遠心分離後、回収した菌体を培養した。これらの細胞は接着性であり、MSCs様形態を有し、顕著なクローン形成能を示した。さらに、それらは脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系の系統に分化し、それらの多能性を示しました。結論として、この研究は、組織工学および再生医療の応用に可能性を示すMSCの分離と拡大を示しています。
Introduction
間葉系幹細胞(MSC)は、再生医療における細胞ベースの治療の魅力的な候補です1,2。それらは、骨髄、臍帯、胎盤、歯髄、皮下脂肪組織などのさまざまな組織源から採取できます3。ただし、成人における幹細胞の利用可能性は限られており、それらの単離手順はしばしば侵襲的である(ドナー部位の罹患率をもたらす)ため、これらの課題を回避できる代替幹細胞源を有することが望ましい。
膝関節は、乳膝下脂肪パッド由来MSC、滑膜由来MSC、滑液由来MSC、靭帯線維芽細胞、関節軟骨細胞など、様々な細胞型のデポーである4,5,6。これらの細胞は、筋骨格系組織工学に基づく研究で広く探求される可能性があります。したがって、膝関節は、複数のタイプのMSCの可能で信頼できる供給源になる可能性があります。 膝関節にある脂肪デポは、膝蓋下脂肪パッド(IFP)またはホファ脂肪パッドとして知られており、MSCデポの有望で代替的な選択肢です。IFPは、膝関節鏡検査または膝関節手術中に外科的廃棄物として日常的に切除および廃棄されるため、比較的簡単にアクセスでき、臨床的に入手可能なMSCの供給源です。IFPの除去は、ドナー部位の罹患率が最小限に抑えられることと関連しており、これも魅力的な組織源となる。IFP由来のMSC(IFP-MSC)は、同様の表現型プロファイルを持ちながら、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)6と比較してクローン形成能を高め、皮下脂肪由来幹細胞(ADSC)と比較して増殖能が優れています7。興味深いことに、滑液由来MSC(SF-MSC)と比較して、IFP-MSCは継代が遅くても増殖能力を失うことはなく、継代が遅くなっても倍増時間が長くなることはありません。これは、IFP-MSCが細胞増殖中に、増殖速度を損なうことなく、in vitro組織工学アプリケーションのために十分に多数の細胞を達成できることを示唆しています8。最近の研究では、IFP-MSCは骨髄由来MSC(BMSC)や脂肪由来MSC(ADSC)と比較して優れた軟骨分化能を有することが示唆されており、おそらく解剖学的に関節軟骨に近接しているためであり、軟骨組織工学への適合性を示しています6,7,9,10。さらに、それらは年齢に依存しない骨形成分化能も持っています11。IFP-MSCの関節内注射は、変形性関節症(OA)患者の疼痛を軽減し、膝関節機能を改善することが示されています12,13。さらに、病的状態における炎症性サイトカインの存在下でのIFP-MSCの強力な免疫抑制応答および改善された免疫調節特性も報告されています6。
IFP-MSCは、MSCの有望で代替的な供給源です。しかし、組織工学や再生医療におけるそれらの治療上の利点は比較的探求されていません。IFP-MSCに関する既存の研究では、主にヒトドナーからの細胞が利用されています。これらのうち、最近のいくつかの研究では、健康なヒトドナー(非関節炎患者、17〜60歳)からのIFP-MSCを調査していますが6,14、ほとんどの研究では、人工膝関節全置換術を受けている高齢患者(罹患患者、70〜80歳)のIFP-MSCを使用しています。年齢と疾患の両方が幹細胞の正常な機能を変化させることが知られているため(数の減少と機能電位の喪失)、これはMSCベースの研究の結果に矛盾をもたらす可能性があります7,15,16,17。それに加えて、病態生理学的状態(関節炎や肥満など)の患者からのIFP-MSCの使用は、in vitroで健康な細胞の基本的な特性を理解することも困難であり、それによってMSCベースの治療法の開発における制限因子として機能します。これらの問題を克服するためには、健康なドナーからのIFP-MSCの使用が不可欠です。健康な人間のドナーへのアクセスは困難であるため、動物モデルはより良い代替手段になる可能性があります。これに関して、IFPがマウスから単離されたいくつかの研究がある18。しかし、通常のマウスでは脂肪パッドのサイズが小さいため、複数の動物の脂肪組織が組み合わされて、精巧な実験手順を実行するのに十分な組織が得られています19。したがって、より多くの細胞の要件を満たすと同時に、動物研究における3Rの原則(精製、置換、および削減)に準拠することができる大型動物モデルが必要です20。大型動物の使用は、トランスレーショナルリサーチにおいて重要な意味を持ちます。具体的には、筋骨格組織工学において、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの様々な大型動物が調査されている21。ヤギ(Capra aegagrus hircus)は、その窒息関節が人間の膝関節に最も近い解剖学的構造を持っているため、大型動物の優れた選択肢です22,23,24。ヤギの軟骨下骨梁構造と軟骨下骨の厚さはヒトと類似しており、骨に対する軟骨の割合もヒトに近いと報告されています21。さらに、ヤギは世界中で広く家畜化されており、骨格的に成熟しているときに簡単に入手できるようになりました。さらに、メンテナンスコストが低く、取り扱いが容易なため、研究にとって魅力的な動物モデルとなっています22。
本研究では、IFP-MSCを Capra aegagrus hircus (ヤギ)の窒息関節から単離するための簡単なプロトコルと、それらの増殖と分化のための in vitro 培養条件が実証されています。単離された細胞は接着性であり、MSC様形態を有し、CFU-F(コロニー形成単位-線維芽細胞)コロニーを形成し、脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成分化能を有する。したがって、IFP-MSCは、生物医学的用途のためのMSCの代替供給源としての可能性を示しています。
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Protocol
このプロトコルは、ヤギからのIFP-MSCの分離に基づいています。ヤギのIFPと血液は地元の食肉処理場から採取されました。このような組織採取は施設動物倫理委員会の範囲外であるため、倫理的承認は必要ありませんでした。
1.ヤギ膝の大腿脛関節からのIFP-MSCの分離
- 後肢の大腿骨領域と脛骨領域のそれぞれ~15 cmを含むヤギの大腿脛関節(サンプル)を収集します。すぐにサンプルを滅菌したサンプル収集ボックスに入れ、4°Cで保管して、さらなる処理のために実験室に輸送します。バイオセーフティキャビネットでサンプルを無菌的に処理し、手順全体を通して滅菌された手術器具を使用します(図1、ステップ1)。
- サンプルを150 mmのペトリ皿に置き、汚染を避けるために抗生物質(5 μg/mLアムホテリシンB、200 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン、および50 μg/mLシプロフロキサシン)を添加したオートクレーブ滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で十分にすすいでください。サンプルがPBSを使用して水和されていることを常に確認してください。
- サンプルの解剖学的領域を注意深く調べます。関節包へのアクセスを容易にするために、両方の長骨から余分な組織が完全に除去されていることを確認してください(図1、ステップ2)。
- これを達成するには、まず大腿骨の端面を片手で持ち、鋭いハサミで関節に向かって縦方向に切断します。プロセス中に骨から周囲の筋肉と脂肪組織を取り除きます。即時関節包の周囲の組織が最初は乱されないままであることに注意してください。
- 同様に、サンプルの脛骨端に別の切開を行い、脛骨から筋肉と脂肪組織を取り除きます。この手順の後、両方の長骨が完全に露出し、関節包がはっきりと見えることを確認します(図1、手順3)。
- 次に、滑膜の両側から切開を行い、関節関節を切り開きます(図1、ステップ4)。滅菌したはさみと鉗子の新しいバッチを使用して、滑膜と膝蓋骨靭帯の両方から膝蓋骨を切り取ります。分離した膝蓋骨をPBSの入ったペトリ皿にすぐに保管します(図1、ステップ5)。
- はさみと鉗子を使用して膝蓋骨の内面に存在する脂肪パッド全体を取り除き、別の新鮮なシャーレに脂肪パッドを収集します(図1、ステップ6)。メスを使って集めた脂肪パッドをひきます。必要に応じて他の手術器具(はさみや手術用ブレードなど)を含めて、~2〜3 mmの可能な限り最小の脂肪片/セグメントを取得します。
注:良好なミンチは、細胞の良好な収量をもたらすために重要です。常に組織を水和させ、隔離手順のどの段階でも乾燥させないでください。 - スパチュラを使用してミンチ組織を50 mL遠沈管に移し、抗生物質を添加したPBSで室温(RT)で試験管ミキサーで15分間洗浄します。洗浄ステップを3回、それぞれ15分繰り返します。
- 酵素消化のために、ミンチ組織(~5 g)を1.5 mg/mL II型コラゲナーゼ(20 mL)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM低グルコース)でインキュベートし、2%FBSを37°Cで12〜16時間補給します。
注意: 試験管ミキサーで毎分~15回転(RPM)で消化を実行します。 - 消化された組織を注意深く吸引し、セルストレーナー(70 μm)でろ過して未消化の組織を取り除きます。ろ液を15 mL遠沈管で150 x g で5分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットをDMEM低グルコースで少なくとも2倍洗浄する。
注意: こぼれないように、消化した組織をゆっくりとストレーナーに注ぎます。少量の遠沈管(15 mL)を使用して、良好なペレットを取得します。 - 得られた細胞ペレットを完全なDMEM培地(10%FBSおよび抗生物質[2.5 μg/mLアムホテリシン、100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン、および25 μg/mLシプロフロキサシン]を添加したDMEM低グルコース)に再懸濁し、後続のステップでプロトコルで拡張培地と呼びます。
- 細胞を150 mmのペトリ皿に播種し、5 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)と50 μg/mLの2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩を添加した増殖培地で培養します。5%CO2 インキュベーター内で細胞を37°Cでインキュベートし、細胞を接着および増殖させます。細胞の付着と成長を毎日監視します。
2. 単離細胞の維持と増殖
- 細胞がコンフルエントになるまで3日ごとに培地を交換してください。培地を交換するたびに、新鮮な5 ng / mL bFGFと50 μg/mLの2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩をペトリ皿に直接加えます。細胞が80%〜90%コンフルエントになった後、細胞を継代培養する。
メモ: メディアを交換するたびに、非粘着性のあるエンティティを削除します。3日間のインキュベーション後に油滴が見られる場合は、細胞をPBS 1xで洗浄してから、新鮮な培地をペトリ皿に加えます。油滴が完全に除去されるまで、各メディアを交換する前にPBS洗浄を続けます。 - 細胞の継代培養:ペトリ皿から増殖培地を取り出し、PBSで細胞を1回洗浄します。4 mLの0.25%トリプシン/EDTAをディッシュに加え、細胞を5%CO2 インキュベーターで37°Cで4分間インキュベートします。
注:コンフルエンシー(80%-90%)は7日以内に達成されます。トリプシン処理中に、トリプシン/EDTA溶液をペトリ皿の表面全体に均一に分配します。 - 側面のプレートを軽くたたき、顕微鏡で観察して細胞を取り除き、すべての細胞が剥離していることを確認します。等容量(4 mL)の膨張培地を加えた後、トリプシンを中和します。
- 新しい15 mLポリプロピレンチューブのピペットを使用して解離した細胞を収集し、150 x g でRTで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを所望の量の膨張培地に再懸濁します。
- 標準的な細胞計数法と150 mmペトリ皿で1 x 104 細胞/cm2 の播種密度で継代培養して細胞をカウントし、さらに増殖させます。全てのアッセイについて、継代数P2〜P5の細胞のコンフルエント単層を使用する。
注:余分な細胞を凍結保存します。
3. コロニー形成アッセイ(CFU-F)を用いたIFP-MSCのクローン形成能の評価
- CFU-Fアッセイの場合、播種密度50-100細胞/cm2で6ウェル組織培養プレートの増殖培地に細胞を播種します。培地を加えて、最終容量3 mLを得ます。
注:アッセイと治療のために細胞濃度を最適化します。 - 細胞を標準的な培養条件下で5%CO2インキュベーター内で37°Cで12 日間培養し、細胞がコロニーを形成できるようにした。メディアは 3 日ごとに交換してください。メディアを変えるときは優しくしてください。
- 12日後、コロニーをPBSで1回すすぎ、20%メタノールを使用してRTで20分間固定します。 コロニーをクリスタルバイオレット染料(20%メタノール中の0.5%[w / v])でRTで20分間染色します。 倒立顕微鏡を使用して個々のコロニーをカウントします。
注:コロニーは、50を超える細胞のクラスターとして定義されます。
4. IFP-MSCの分化の可能性
- IFP-MSCの脂肪分化誘導
- 脂肪生成を誘導するには、24ウェル組織培養プレートに25 x 103 細胞/cm2 の密度で細胞を播種します。培地を添加し、最終容量500 μLを得た。 細胞を5%CO2 インキュベーター内で37°Cで培養する。
- コンフルエントの1日後に、増殖培地を500 μLの脂肪分化培地と交換します。細胞がコンフルエントに達するまでに約2日かかります。
- 拡張培地(DMEM + 10% FBS + 2.5 μg/mLアムホテリシン、100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン、および25 μg/mLシプロフロキサシン)に25 mM D(+)-グルコース、10 μg/mLインスリン、1 μMデキサメタゾン、および100 μMインドメタシンを添加して、脂肪分化培地を調製します。
注:分化培地は1ヶ月後に4°Cで不安定です。したがって、必要に応じてメディアを準備します。 - 25 mM D(+)グルコースを添加した増殖培地で培養した細胞を非誘導対照として考えてください。メディアを 3 日ごとに 14 日間交換します。14日の終わりに、細胞をPBSで1回洗浄する。中性緩衝ホルマリン(NBF;PBS中の4%ホルムアルデヒド)を使用して、4°Cで15分間細胞を固定します。
- 固定後、ウェルを蒸留水で1回洗浄し、細胞を60%イソプロパノールでRTで5分間インキュベートします。イソプロパノールを除去した後、細胞を500 μLのOil Red O色素の作業溶液とRTで5分間インキュベートすることにより、脂肪滴を染色します。 ウェルを蒸留水で1x洗浄して、結合していない色素を除去し、倒立顕微鏡を使用して細胞を画像化します。
注:300 mgのOROを100 mLの99%イソプロパノールに溶解して、オイルレッドO(ORO)のストック溶液を調製します。作業溶液を調製するには、ストックORO3部と蒸留水2部を混合し、RTで10分間混合します。0.2μmのろ紙を使用して混合物をろ過します。実用的なソリューションを使用する準備が整いました。ストック溶液は、暗所で1ヶ月間RTで調製および保存できますが、作業溶液は、各使用/染色の前に新たに調製する必要があります。
- IFP 間葉系幹細胞の軟骨形成分化誘導
- ヤギ血漿の単離:
- 蒸留水中で3.4%(w / v)クエン酸ナトリウムを準備します。調製したクエン酸ナトリウム溶液5 mLを50 mL遠沈管に加えます。
- 新たに単離したヤギの血液45 mLを同じチューブに集めます。すぐにチューブを傾けて血液をクエン酸ナトリウムと完全に混合し、凝固を防ぎ、4°Cで実験室に輸送します。
- 採取したヤギの血液を1000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清(血漿)をバイオセーフティキャビネット内の新しいチューブに移します。血漿を0.2 μmフィルターでろ過し、分注し、さらに使用するために-20°Cで保存します。
注意: サンプルを取り扱うときは、2〜8°Cの温度を維持してください。プラズマの凍結融解サイクルを最小限に抑えることが重要です。
- 増殖した細胞を80%〜90%コンフルエントに培養し、トリプシン/ EDTA溶液を使用して細胞を解離し、15 mLの遠沈管で150 x g で5分間細胞をペレットダウンします。ペレットを、血漿溶液50μLあたり2 x 106 細胞の密度でヤギ血漿中に再懸濁します。
- 滅菌した90 mmペトリ皿に血漿含有細胞(50 μL)を一滴加え、最終濃度0.3%(w / v)で塩化カルシウムを加えます。よく混合して架橋プラズマヒドロゲルを作製する。
- 作製したヒドロゲルを37°Cで40分間インキュベートします。インキュベーション後、ヒドロゲルを軟骨形成培地を含む24ウェル組織培養プレートに移します。
- DMEM低グルコースに10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1.25 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、1 mMプロリン、50 μg/mL 2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩、100 nMデキサメタゾン、1xインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム+リノール酸-BSA(ITS + 1)、抗生物質(2.5 μg/mLアムホテリシン、100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシンおよび25 μg/mLシプロフロキサシン)を補給することにより、軟骨原性培地を調製します。 および10 ng / mLの形質転換成長因子-β1(TGF-β1)。
- TGF-β1を含まない完全なDMEM培地(10%FBSおよび抗生物質[2.5 μg/mLアムホテリシン、100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン、および25 μg/mLシプロフロキサシン]を含むDMEM低グルコース)で培養されたヒドロゲルは、誘導されていない対照と見なされます。メディアを 3 日ごとに 14 日間交換します。
- 血漿ヒドロゲル中の細胞の軟骨形成分化の14日後、ヒドロゲルをPBS 3xでそれぞれ5分間洗浄し、次いでサンプルをNBFに3時間固定する。
注意: ホルムアルデヒドは発がん性の可能性があり、吸入すると鼻、喉、肺を刺激する可能性があります。ドラフト内のホルムアルデヒドに関連するすべての手順を実行します。 - NBFを除去し、ヒドロゲルをPBS 3xでそれぞれ5分間洗浄し、次にRTで35%(w / v)スクロースで一晩インキュベートして、溶液をサンプルに完全に吸収させます。ヒドロゲルを最適な切断温度(OCT)コンパウンドで3時間順応させます。液体窒素下でシリコーンモールドを使用して、サンプルをOCTコンパウンドに埋め込みます。
- クライオトームを使用してゼラチンコーティングされたスライドガラス上でサンプルを10〜12μmの厚さで切断し、将来の使用のために-20°Cで保存します。軟骨形成分化後の細胞外マトリックスの存在または沈着を調べるには、硫酸化グリコサミノグリカンに結合するアルシアンブルーおよびサフラニン-O色素で切片を染色します。
注意: アルシアンブルー染料を調製するには、1 gのアルシアンブルー染料を100 mLの0.1 N HClに溶解し、試験管ミキサーで一晩完全に混合します。溶液は暗所で1ヶ月間RTで保存することができます。サフラニン-O色素を調製するには、0.1 gのサフラニン-O色素を100 mLの蒸留水に溶解し、試験管ミキサーで一晩完全に混合します。 - アルシアンブルー染色の場合は、ヒドロゲル切片を蒸留水で1回5分間洗浄します。切片を修正するには、スライドに4%NBFを加え、30分間インキュベートします。
- 切片を蒸留水で1回5分間洗浄し、次に0.1 N HClで2回、それぞれ30秒間洗浄します。HClを取り外し、ティッシュペーパーでスライドをそっと乾かします。調製したアルシアンブルー染色剤を切片に加え、加湿チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。
- 結合していない染料を0.1 N HClで洗浄し、蒸留水で3分間洗浄します。切片を無水エタノールで脱水し、キシレンで除去し、最後に染色した切片をイメージング用の樹脂媒体にマウントします。
- サフラニン-O染色の場合は、ヒドロゲル切片を蒸留水で1回5分間洗浄します。切片を修正するには、スライドに4%NBFを加え、30分間インキュベートします。切片を蒸留水で1x5分間洗浄し、次にスライドを1%酢酸に10〜15秒間浸します。ティッシュペーパーでスライドをやさしく乾かします。
- 調製したサフラニン-O染料を切片に加え、RTで10分間インキュベートします。 結合していない染料を100%エタノールで洗浄します。スライドを100%エタノールに5分間浸します。スライドを風乾し、キシレンで透明にし、最後に染色した切片をイメージング用の樹脂媒体に取り付けます。
- ヤギ血漿の単離:
- IFP 間葉系幹細胞の骨形成分化誘導
- 骨形成分化を誘導するには、前述のように細胞をトリプシン処理します(ステップ2.2)。細胞を3 x 103 細胞/cm2 の密度で24ウェル組織培養プレートに播種します。培地を添加し、最終容量500 μLを得た。 細胞を5%CO2 インキュベーター内で37°Cで培養する。播種後1日目に、増殖培地を500 μL骨形成分化培地と交換します。
- 拡張培地(DMEM + 10% FBS +2.5 μg/mLアムホテリシン、100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン、および25 μg/mLシプロフロキサシン)に25 mM D(+)-グルコース、10 nMデキサメタゾン、10 mM β-グリセロリン酸、50 μg/mL 2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩、および10 nMビタミンD3を添加して骨形成培地を準備します。
注:25 mM D(+)グルコースを添加した増殖培地で培養した細胞は、誘導されていない対照と見なされます。 - 骨形成培地を3日ごとに14日間または28日間交換します。14日の終わりに、アルカリホスファターゼ(ALP)染色により骨形成の程度を測定する。
注:ALP染色用の基質を準備するには、1つの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(BCIP)/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)タブレットを15 mLの遠沈管内の10 mLの蒸留水に溶解します。タブレットを完全に溶かします。基質溶液はすぐに使用できます。基質溶液は必要に応じて長期間保存できないため、錠剤を半分に分割し、5mLの蒸留水に溶解します。透過処理バッファーを調製するには、蒸留水にトリスバッファー(100 mM)と塩化マグネシウム(5 mM)を加えます。Triton X100(0.1%)を溶液に加え、溶解させます。溶液のpHを9.25〜9.75に調整します。 - ALP染色の場合、誘導の14日後に培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄します。NBF(4%)を使用して細胞を1分間固定します。細胞をPBSで洗浄し、調製した溶解バッファーを使用して2〜3分間浸透させます。
- 調製した基質溶液500 μLを細胞に加え、発現レベルに応じて15分から1時間インキュベートします。その間の紫/青の色の変化を確認してください。
- 基質溶液を取り出し、蒸留水で洗浄する。倒立顕微鏡を使用して染色細胞を画像化します。
- 28日の終わりに、アリザリンRed-S染色により骨形成誘導後の石灰化の程度を測定する。
注:アリザリンRed-S染色液(40 mM)を調製するには、2 gのアリザリンRed-Sを100 mLの蒸留水に溶解し、HClまたはNH4OHでpHを4.1〜4.3に調整します。溶液を0.22 μmメンブレンでろ過し、暗所で4°Cで保存します。溶液のpHは重要です。したがって、新鮮な溶液を作るか、1ヶ月以上経過している場合は溶液のpHを再測定することをお勧めします。 - アリザリンRed-S染色の場合、誘導から28日後に培地を取り出し、細胞を冷たいPBSで1回洗浄します。70%エタノールを使用して細胞を4°Cで1時間固定します。
- 固定液を取り出し、蒸留水で細胞を2回洗浄します。水を完全に除去し、各ウェルに1 mLのアリザリンRed-S溶液を加えます。
- 細胞を溶液とともにRTで1時間インキュベートし、倒立顕微鏡を使用して細胞を画像化します。
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Representative Results
ヤギの大腿脛骨関節からのIFP-MSCの分離
ヤギの窒息関節からのIFP-MSCの分離に関連するステップを 図1に示します。膝蓋骨の内側の非関節表面に存在する脂肪パッドを取り外し、細かく刻み、酵素的に消化した。IFP-MSCは、 インビトロで 単離および培養に成功しました(図2A)。
IFP-MSCの増殖とクローン形成能
単離した細胞をイン ビトロ で増殖培地で培養した。細胞は播種後12時間以内に組織培養プレートに接着し始め、0日目にはほとんど丸い形になりました。それらはプレートに均一に付着し、24時間以内に細長い形態を達成しました。この形態は、培養期間中維持された。細胞は培養中に効率的に増殖し、増殖後6日以内に80%〜90%コンフルエントになりました(図2A)。さらに、単離された細胞は、コロニー形成単位線維芽細胞(CFU-F)アッセイによって評価されたクローン形成能を示した(図2B)。これらの結果は、単離された細胞が in vitroで効率的な増殖および自己複製能力を有することを示している。
IFP-MSCの分化の可能性
単離された細胞が多能性であり、MSCの特徴的な特徴を持っているかどうかを特徴付けるために、それらは複数の系統に分化するように誘導されました。単離された細胞は、脂肪生成系統に向かって誘導されると、明視野画像から観察できるように脂肪滴を産生した(図3A)。これは、14日目および21日目のOil Red O染色によってさらに確認され、これらの細胞が脂肪細胞に分化する能力を示唆した。一方、脂肪生成誘導因子の非存在下で培養した細胞では、目に見える油滴は観察されませんでした(図3B、C)。
単離された細胞の軟骨形成能を決定するために、細胞を血漿ヒドロゲルに封入し、軟骨形成系統に分化させた。血漿ハイドロゲルの肉眼像(図4A)からわかるように、誘導群では14日後に形成された新組織は白く光沢があり(関節軟骨と同様)、非誘導群では淡い白色であり、光沢の低下が見られました。さらに、誘導群の細胞は、軟骨基質の主要成分の1つ(すなわち、硫酸化グリコサミノグリカン)を分泌することができ、これはアルシアンブルー(図4B)およびサフラニンO(図4C)の陽性組織学的染色によって証明されました。対照的に、非誘導群からのヒドロゲル切片は、サフラニンOおよびアルシアンブルー染色に対して陰性であった。これらの結果は、軟骨形成刺激のみの存在下でのMSCの軟骨形成分化能をまとめて示しています。
単離された細胞はまた、骨形成分化能を示した。培養14日および21日後、自発的な石灰化は認められなかった(非誘導群)。しかし、骨形成培地で誘導した場合、石灰化は14日の終わりにアルカリホスファターゼ(ALP)の陽性染色によって明らかでした(図5A)。さらに、骨形成培地中での28日間の培養後、石灰化沈着物を陽性のアリザリンRed−S染色により可視化した(図5B)。これらの結果は、ヤギの膝蓋骨下脂肪パッドから単離された細胞が誘導されると、脂肪生成、軟骨形成、および骨形成系統に分化する可能性があることを示しています。
図1:ヤギの膝の窒息関節からのIFP-MSCの分離の概略図。 ステップ1.食肉処理場からヤギの膝のサンプルを収集し、バイオセーフティキャビネットで解剖を進めます。ステップ2.組織の解剖学的構造を注意深く調べ、周囲の筋肉と脂肪組織を取り除きます。ステップ3.関節包を乱すことなく、筋肉と脂肪組織を取り除き、長骨(大腿骨と脛骨)の両方を完全に露出させます。ステップ4.滑膜を切開し、関節関節を切り開いて膝蓋骨と滑車軟骨を露出させます。ステップ5.膝蓋骨下脂肪パッド(IFP)を乱すことなく、関節関節から膝蓋骨を慎重に取り外し、PBSを含むペトリ皿の上に置きます。ステップ6。脂肪パッド全体を膝蓋骨からゆっくりと取り除き、ミンチと酵素消化のために新鮮なペトリ皿に入れます。(a.大腿骨、b.脛骨、c.膝蓋骨、d.滑車軟骨、e.膝蓋骨下脂肪パッド)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:IFP-MSCの形態とクローン形成ポテンシャル 。 (A)顕微鏡写真は、10倍の倍率で倒立明視野顕微鏡を使用して継代3で撮影されました。播種直後(0日目)の細胞は丸いままで、3日目にはほとんどの細胞が細長い形態になり、6日目にはIFP-MSCが80%〜90%コンフルエントになりました(スケールバー= 100 μm)。(B)播種後12日後にクリスタルバイオレット色素で染色したCFU-Fコロニーの代表的な写真(n=3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:IFP-MSCの脂肪生成分化。 上のパネルは未誘導のIFP-MSCの顕微鏡写真を示し、下のパネルは脂肪生成系統に誘導されたIFP-MSCを示しています。(A)脂肪生成中の脂質液胞の形成を示す代表的な明視野画像(スケールバー=100μm)。分化の(B)14日目および(C)21日目における脂肪滴のオイルレッドO染色の代表的な画像(スケールバー=20μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:IFP-MSCの軟骨形成分化。 上のパネルは、誘導されていないヒドロゲルからのヒドロゲル構築物/切片を示し、下のパネルは、軟骨形成を受けるヒドロゲルを表します。(A)TGF-β1を添加した軟骨形成培地の非存在下(非誘導)または存在下(誘導)での培養14日後の血漿ヒドロゲル構築物の肉像。sGAG結合色素(B)アルシアンブルー(青)および(C)サフラニンO(赤)で染色されたヒドロゲルの10μm切片の代表的な画像(スケールバー= 100μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:IFP-MSCの骨形成分化。 上のパネルは未誘導の細胞を示し、下のパネルは骨形成培地で誘導された細胞を示します。分化14日後に(A)BCIP-NBT(アルカリホスファターゼ)で染色されたIFP-MSCの顕微鏡写真および代表的な画像(B)アリザリンRed-S(カルシウム沈着)(スケールバー= 100μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本プロトコルでは、ヤギIFPからMSCを単離するための簡単で信頼性が高く、再現性のある方法が提供されています。この方法を使用して単離された細胞は、in vitro組織再生のための以前の研究で成功裏に使用されています。単離された細胞は増殖性であり、様々な成長因子に応答し、電界紡糸繊維および足場に播種したときにそれらの生物学的活性を保持することが観察された25,26。さらに、多数の高品質のMSCを取得し、注射可能なヒドロゲルで軟骨細胞と共培養して、in vitroで関節軟骨を操作できることが観察されました27,28,29。細胞の解剖と単離の手順は簡単ですが、IFPからのMSCの単離と増殖を成功させるには、慎重に従う必要のあるいくつかの手順があります。第一に、食肉処理場からサンプルを持ち込む間、真に無菌状態を維持することは不可能であるため、分離手順を開始する前に、70%エタノールで外側組織を拭いて組織を滅菌することをお勧めします。次の重要なステップは、膝関節から脂肪パッドを解剖することです。IFPは膝関節の膝蓋骨の下にあります。IFPの近位端は、膝蓋骨30、31の遠位端に取り付けられている。したがって、隔離手順を実行する際に膝蓋骨の正しい位置を特定することが非常に重要になります。次に、IFPは大腿骨の滑車軟骨と関節し、滑膜30,31で覆われているため、滑膜を切開して膝関節を切断する必要があります。収集された膝蓋下脂肪パッドの全体的な健康状態を観察することも重要です。IFPは脂肪細胞(細胞)とコラーゲンやグリコサミノグリカンなどの脂肪結合組織で構成されているため、組織はコラゲナーゼ酵素を使用して細かく刻まれて消化され、細胞を放出します9,32。浮遊脂肪細胞は、MSCの均質な培養を有するために、低速での遠心分離によって分離される。間質血管画分中の残りの脂肪細胞は、新鮮な培地を添加する前に、細胞単層をPBSで洗浄することにより、培地交換のたびに組織培養プレートから除去する必要があります。このステップは、目に見える脂肪細胞がすべて除去されるまで続ける必要があります。P0細胞がコンフルエントに達した後、プレート壁に付着している可能性があり、除去が困難な残りの脂肪細胞を取り除くために、細胞を新しいプレートに再播種することが提案されています。最後に、ヤギのサンプルは主に食肉処理場から得られるため、ヤギの正確な年齢を追跡することは困難であり、したがって、細胞を分離する際に、サンプル間の変動を注意深く観察し、文書化する必要があります。細胞をさまざまなアプリケーションや機構研究に使用する前に、各単離後の自己複製(CFU-F)、増殖、および分化の可能性について細胞の特性評価を行うことが提案されています。細胞ベースの組織工学アプリケーションでは多数の細胞が必要となるため、増殖を促進し、老化を遅らせ、細胞の幹細胞性を維持する培養条件が中心的に重要になります。2-ホスホ-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩(PAA)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)で培養したMSCは、bFGFのみで培養したMSCと比較して、その数が~42倍増加したことが観察されました。さらに、PAAとbFGFの共処理により、幹細胞における活性酸素種の産生(抗酸化特性による)と老化が減少しました。したがって、MSCのインビトロ増殖中のPAAの使用が望ましい33。
組織の酵素消化は普遍的に採用されており、間葉系幹細胞を単離するための効率的な方法ですが、コラゲナーゼなどの酵素の使用は時間と費用がかかります34。本研究では、コラゲナーゼを用いた組織の完全な消化には12〜16時間(一晩)かかり、これは細胞の生存率の低下または表面表現型の変化につながる可能性がある35。したがって、この方法は、組織消化のためのコラゲナーゼ処理の期間を短縮するようにさらに最適化することができる。あるいは、脂肪吸引液または鼠径部脂肪パッドからの脂肪由来MSCの単離に使用される酵素を含まない外植片培養法も、IFP-MSCの単離のために探索することができる34,36,37。
IFP-MSCは、軟骨形成、脂肪原性、および骨形成系統に分化する能力があるため、幅広い治療の可能性を秘めています。以前の報告では、IFP-MSCが他の幹細胞よりも優れた軟骨形成能を示すことが実証されています6,7,9,10。したがって、IFP-MSCは関心を集めており、変形性関節症の軟骨欠損の修復および軟骨分解の緩和のための細胞ベースの治療のより良い候補と見なされています。前臨床試験では、関節内注射によるIFP-MSCと軟骨細胞外マトリックス成分との同時送達は、骨軟骨欠損における軟骨再生の増強をもたらした38。同様に、ウサギの変形性関節症(OA)モデルにおけるIFP-MSCの関節内注射は、以下の疾患パラメータの減少をもたらした:軟骨分解、骨棘形成、軟骨下骨肥厚、および滑膜炎39。さらに、以前に報告された無作為化臨床試験13および最近発表されたオープンレベル第1相臨床試験40の結果は、変形性膝関節症患者におけるIFP-MSCの関節内注射が安全であり、痛みの軽減と関節機能の改善をもたらすことを示しており、膝OA関連合併症の改善における有望な治療の可能性を示しています。IFP-MSCはまた、炎症調節因子であるサブスタンスP(SP)の分解を促進することにより、炎症誘発性の手がかりの存在下で免疫調節特性を増強し、炎症誘発性および異化分子の減少をもたらし、その結果、滑膜およびIFPの炎症および線維症の治療を改善することが示されています6.さらに重要なことに、規制に準拠した条件で処理されたIFP-MSCは、標準的なin vitro培養条件と比較して、より優れた増殖、分化能力、および免疫調節特性を示し、間葉系幹細胞(MSC)ベースの治療に使用した場合に臨床的成功の可能性を示しています41。
結論として、本プロトコルは、酵素消化によるヤギ窒息関節からの膝蓋骨下脂肪パッド(IFP)由来間葉系幹細胞(MSC)の単離と培養中のそれらの維持について説明しています。単離された細胞は増殖性および自己複製性を有し、脂肪原性、骨形成性、および軟骨形成系の系統に分化することができる。IFP-MSCはMSCの有望な供給源であり、再生医療への応用にトランスレーショナルな可能性を秘めています。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
SHは、IITカンプールの研究所ポスドクフェローシップおよびDST(SEED部門)からのSYST助成金(SP / YO / 618/2018)からの支援を認めています。AMは、インド工科大学カンプール校(IIT-カンプール)のフェローシップを認めています。DSKは、インドのギリーシュ・ジャンキナス議長教授職およびバイオテクノロジー学科の資金提供を認めています(BT/PR22445/MED/32/571/2016)。AM、SH、およびDSKは、IIT-KanpurのMehtaファミリー医学工学センターの寛大な支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
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