Summary
Las células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar (IFP-MSC) se pueden aislar fácilmente de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación de la rodilla. Proliferan bien in vitro, forman colonias de UFC-F y se diferencian en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos. En este documento, se proporciona la metodología para el aislamiento, expansión y diferenciación de IFP-MSC de la articulación sofocante de cabra.
Abstract
El IFP, presente en la articulación de la rodilla, sirve como una fuente prometedora de MSC. El IFP es un tejido de fácil acceso, ya que se reseca y descarta rutinariamente durante los procedimientos artroscópicos y las cirugías de reemplazo de rodilla. Además, su eliminación se asocia con una morbilidad mínima en el sitio donante. Estudios recientes han demostrado que los IFP-MSC no pierden su capacidad de proliferación durante la expansión in vitro y tienen un potencial de diferenciación osteogénica independiente de la edad. Las IFP-MSC poseen un potencial de diferenciación condrogénica superior en comparación con las MSC derivadas de la médula ósea (BMSC) y las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC). Aunque estas células se pueden obtener fácilmente de pacientes ancianos y enfermos, su efectividad es limitada. Por lo tanto, el uso de IFP-MSC de donantes sanos es importante para determinar su eficacia en aplicaciones biomédicas. Como el acceso a un donante humano sano es un desafío, los modelos animales podrían ser una mejor alternativa para permitir la comprensión fundamental. Los animales grandes como perros, caballos, ovejas y cabras juegan un papel crucial en la investigación traslacional. Entre estos, la cabra podría ser un modelo preferido ya que la articulación sofocante de la cabra tiene la anatomía más cercana a la articulación de la rodilla humana. Además, el IFP de cabra puede cumplir con los números más altos de MSC necesarios para aplicaciones de regeneración de tejidos. Además, el bajo costo, la disponibilidad y el cumplimiento de los principios de las 3R para la investigación con animales los convierten en un modelo atractivo. Este estudio demuestra un protocolo simple para aislar IFP-MSC de la articulación sofocante de cabras y condiciones de cultivo in vitro para su expansión y diferenciación. El IFP asépticamente aislado de la cabra fue lavado, picado y digerido enzimáticamente. Después de la filtración y centrifugación, las células recolectadas fueron cultivadas. Estas células eran adherentes, tenían una morfología similar a las MSC y demostraron una notable capacidad clonogénica. Además, se diferenciaron en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos, lo que demuestra su multipotencia. En conclusión, el estudio demuestra el aislamiento y la expansión de las MSC, que muestran potencial en aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.
Introduction
Las células madre mesenquimales (CMM) son un candidato atractivo para las terapias basadas en células en medicina regenerativa 1,2. Se pueden recolectar de una variedad de fuentes de tejidos como médula ósea, cordón umbilical, placenta, pulpa dental y tejido adiposo subcutáneo3. Sin embargo, como la disponibilidad de células madre en adultos es limitada y su procedimiento de aislamiento es a menudo invasivo (lo que resulta en morbilidad en el sitio donante), es deseable tener una fuente alternativa de células madre que pueda eludir estos desafíos.
La articulación de la rodilla es un depósito de varios tipos de células, como las MSC derivadas de almohadillas de grasa infrapatelar, las MSC derivadas de la membrana sinovial, las MSC derivadas del líquido sinovial, los fibroblastos de ligamentos, los condrocitos articulares, etc. 4,5,6. Estas células tienen el potencial de ser ampliamente exploradas en la investigación basada en la ingeniería de tejidos musculoesqueléticos. Por lo tanto, la articulación de la rodilla podría ser una fuente posible y confiable de múltiples tipos de MSC. El depósito adiposo ubicado en la articulación de la rodilla, conocido como almohadilla de grasa infrapatelar (IFP) o almohadilla de grasa de Hoffa, es una opción prometedora y alternativa de depósito de MSC. El IFP es una fuente de MSC de acceso relativamente fácil y clínicamente obtenible, ya que se reseca y descarta rutinariamente como desechos quirúrgicos durante la artroscopia de rodilla o la cirugía abierta de rodilla. La eliminación del IFP se asocia con una morbilidad mínima en el sitio donante, lo que también lo convierte en una fuente de tejido atractiva. A pesar de tener un perfil fenotípico similar, las MSC de IFP (IFP-MSCs) tienen un mayor potencial clonogénico en comparación con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BM-MSCs)6 y una mejor capacidad proliferativa en comparación con las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (ADSC)7. Curiosamente, en comparación con las MSC derivadas del líquido sinovial (SF-MSC), las IFP-MSC no pierden su capacidad proliferativa en los pasajes tardíos, ni el tiempo de duplicación aumenta en los pasajes tardíos. Esto sugiere que, durante la expansión celular, las IFP-MSC pueden lograr un número suficientemente grande de células para aplicaciones de ingeniería de tejidos in vitro sin comprometer su tasa de proliferación8. Estudios recientes también han sugerido que las IFP-MSCs poseen un potencial de diferenciación condrogénica superior en comparación con las MSCs derivadas de médula ósea (BMSC) y las MSCs derivadas de tejido adiposo (ADSC), probablemente debido a su proximidad anatómica al cartílago articular, indicando su idoneidad para la ingeniería tisular del cartílago 6,7,9,10. Además, también poseen un potencial de diferenciación osteogénica independiente de la edad11. Se ha demostrado que la inyección intraarticular de IFP-MSCs reduce el dolor y mejora las funciones articulares de la rodilla en pacientes con osteoartritis (OA)12,13. Además, también se han descrito fuertes respuestas inmunosupresoras y mejores propiedades inmunomoduladoras de IFP-MSCs en presencia de citoquinas inflamatorias durante condiciones patológicas6.
Los IFP-MSC son una fuente prometedora y alternativa de MSC; Sin embargo, su beneficio terapéutico en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa es relativamente menos explorado. Los estudios existentes sobre IFP-MSC han utilizado principalmente células de donantes humanos. Entre estos, algunos estudios recientes han investigado IFP-MSC de donantes humanos sanos (pacientes no artríticos, de 17 a 60 años)6,14, mientras que la mayoría de los estudios han utilizado IFP-MSC de pacientes de edad avanzada sometidos a cirugía de reemplazo total de rodilla (pacientes enfermos, de 70 a 80 años). Como se sabe que tanto la edad como la enfermedad alteran el funcionamiento normal de las células madre (número reducido y pérdida de potencial funcional), esto podría conducir a inconsistencias en el resultado de los estudios basados en MSC 7,15,16,17. Además de eso, el uso de IFP-MSC de pacientes con condiciones fisiopatológicas (por ejemplo, artritis y obesidad) también plantea dificultades para comprender las características básicas de las células sanas in vitro, actuando así como un factor limitante en el desarrollo de terapias basadas en MSC. Para superar estos problemas, el uso de IFP-MSC de donantes sanos es vital. Como el acceso a un donante humano sano es un desafío, los modelos animales podrían ser una mejor alternativa. En este sentido, hay algunos estudios en los que se ha aislado IFP de ratones18. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la almohadilla de grasa en ratones normales, los tejidos grasos de múltiples animales se han combinado para obtener suficiente tejido para ejecutar procedimientos experimentales elaborados19. Por lo tanto, existe la necesidad de un modelo animal grande, que podría cumplir con el requisito de mayor número de células y simultáneamente cumplir con los principios de las 3R (refinar, reemplazar y reducir) en la investigación con animales20. El uso de animales grandes tiene implicaciones significativas en la investigación traslacional. Específicamente, en la ingeniería de tejidos musculoesqueléticos, se ha investigado una variedad de animales grandes como perros, cerdos, ovejas, cabras y caballos21. La cabra (Capra aegagrus hircus) es una excelente opción de animal grande ya que su articulación sofocante tiene la anatomía más cercana a la articulación de la rodilla humana22,23,24. La estructura trabecular del hueso subcondral y el grosor del hueso subcondral de las cabras son similares a los humanos, y la proporción del cartílago al hueso también se informa que es cercana a la de los humanos21. Además, las cabras han sido ampliamente domesticadas en todo el mundo, haciéndolas fácilmente disponibles cuando están esqueléticamente maduras. Además, los bajos costos de mantenimiento y el fácil manejo los han convertido en un modelo animal atractivo para la investigación22.
En el presente estudio, se demuestra un protocolo simple para el aislamiento de IFP-MSCs de la articulación sofocante de Capra aegagrus hircus (cabra) y condiciones de cultivo in vitro para su expansión y diferenciación. Las células aisladas son adherentes, tienen morfología similar a MSC, forman colonias de CFU-F (unidad formadora de colonias-fibroblastos) y poseen potencial de diferenciación adipogénica, condrogénica y osteogénica. Por lo tanto, los IFP-MSC muestran potencial como una fuente alternativa de MSC para aplicaciones biomédicas.
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Protocol
El protocolo se basa en el aislamiento de IFP-MSCs de cabras. Se recogieron IFP de cabra y sangre de un matadero local. Dado que tales colecciones de tejidos están fuera del ámbito de un Comité Institucional de Ética Animal, no se requería aprobación ética.
1. Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de la rodilla de cabra
- Recolectar la articulación femorotibial de cabra (muestra) que abarca ~ 15 cm cada una de las regiones femoral y tibial de las extremidades posteriores. Coloque inmediatamente la muestra en una caja de recogida de muestras esterilizada y guárdela a 4 °C para transportarla al laboratorio para su posterior procesamiento. Procesar las muestras asépticamente en un gabinete de bioseguridad, utilizando herramientas quirúrgicas esterilizadas durante todo el procedimiento (Figura 1, Paso 1).
- Coloque la muestra en una placa de Petri de 150 mm y enjuáguela bien con solución salina tamponada con fosfato (PBS) esterilizada en autoclave suplementada con antibióticos (5 μg/ml de anfotericina B, 200 U/ml de penicilina-estreptomicina y 50 μg/ml de ciprofloxacina) para evitar la contaminación. Asegúrese siempre de que la muestra se mantenga hidratada usando PBS.
- Examine cuidadosamente las regiones anatómicas de la muestra. Para facilitar el acceso a la cápsula articular, asegúrese de que los tejidos adicionales de ambos huesos largos se eliminen por completo (Figura 1, Paso 2).
- Para lograr esto, primero, sostenga la superficie final del hueso del fémur con una mano y, con tijeras afiladas, corte longitudinalmente hacia la articulación. Retire los músculos circundantes y el tejido adiposo del hueso durante el proceso. Tenga cuidado de que el tejido que rodea la cápsula articular inmediata permanezca intacto inicialmente.
- Del mismo modo, haga otra incisión en el extremo tibial de la muestra y retire los músculos y el tejido adiposo del hueso tibial. Asegúrese de que ambos huesos largos estén completamente expuestos y que la cápsula articular sea claramente visible después de este paso (Figura 1, Paso 3).
- Luego, haga una incisión desde cada lado de la membrana sinovial para abrir la articulación articulada (Figura 1, Paso 4). Libere la rótula tanto de la membrana sinovial como de los ligamentos rotulianos con un nuevo lote de tijeras y fórceps esterilizados. Mantenga inmediatamente la rótula separada en una placa de Petri que contenga PBS (Figura 1, Paso 5).
- Retire toda la almohadilla de grasa presente en la superficie interna de la rótula con tijeras y fórceps y recoja la almohadilla de grasa en otra placa de Petri fresca (Figura 1, Paso 6). Picar la almohadilla de grasa recolectada con un bisturí. Incluya otras herramientas quirúrgicas (por ejemplo, tijeras o cuchillas quirúrgicas) según sea necesario para obtener las piezas / segmentos de grasa más pequeños posibles de ~ 2-3 mm.
NOTA: Una buena picadura es fundamental para dar como resultado un buen rendimiento de las células. Siempre mantenga el tejido hidratado y no lo deje secar en ninguna etapa del procedimiento de aislamiento. - Transfiera el tejido picado usando una espátula a un tubo de centrífuga de 50 ml y lávelo con PBS suplementado con antibióticos a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos en un mezclador de tubos de ensayo. Repita el paso de lavado 3x, 15 min cada uno.
- Para la digestión enzimática, incubar el tejido picado (~ 5 g) en Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM baja glucosa) que contiene 1,5 mg / ml de colagenasa tipo II (20 ml) y suplementado con 2% de FBS a 37 ° C durante 12-16 h.
NOTA: Realice la digestión en un mezclador de tubos de ensayo a ~15 rotaciones por minuto (RPM). - Aspirar cuidadosamente el tejido digerido y filtrarlo a través de un colador celular (70 μm) para eliminar cualquier tejido no digerido. Centrifugar el filtrado en un tubo de centrífuga de 15 ml a 150 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y lave el pellet con DMEM de glucosa baja al menos 2x.
NOTA: Vierta el tejido digerido lentamente en el colador para evitar derrames. Use un tubo de centrífuga de bajo volumen (15 ml) para obtener un buen pellet. - Resuspender el pellet celular obtenido en un medio DMEM completo (DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% de FBS y antibióticos [2,5 μg/ml de anfotericina, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y 25 μg/ml de ciprofloxacino]), denominado medio de expansión en el protocolo en los pasos posteriores.
- Sembrar las células en placas de Petri de 150 mm y cultivarlas en los medios de expansión suplementados con 5 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y 50 μg/ml de sal trisódica de ácido 2-fosfo-L-ascórbico. Incubar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5% para permitir que las células se adhieran y proliferen. Controle la unión y el crecimiento de las células diariamente.
2. Mantenimiento y expansión de células aisladas
- Cambie los medios cada 3 días hasta que las células se vuelvan confluentes. Agregue 5 ng/ml de bFGF fresco y sal trisódica de ácido 2-fosfo-L-ascórbico de 50 μg/ml directamente a la placa de Petri cada vez que se cambie el medio. Después de que las células se conviertan en 80% -90% confluentes, subcultive las células.
NOTA: Quite las entidades no adherentes durante cada cambio de medios. En caso de que se vean gotas de aceite después de 3 días de incubación, lave las células con PBS 1x y luego agregue medios frescos a la placa de Petri. Continúe con el lavado PBS antes de cada cambio de medio hasta que las gotas de aceite se eliminen por completo. - Subcultivo de células: Retire los medios de expansión de la placa de Petri y lave las células 1x con PBS. Añadir 4 ml de tripsina/EDTA al 0,25% al plato e incubar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5% durante 4 min.
NOTA: La confluencia (80%-90%) se logra dentro de los 7 días. Distribuir uniformemente la solución de tripsina/EDTA sobre toda la superficie de la placa de Petri durante la tripsinización. - Desaloje las células golpeando la placa en el costado y observando bajo un microscopio para confirmar que todas las células están separadas. Neutralizar la tripsina después de añadir un volumen igual (4 ml) de medios de expansión.
- Recoger las células disociadas con una pipeta en un tubo de polipropileno fresco de 15 ml y centrifugar a 150 x g durante 5 min a RT. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el volumen deseado de medios de expansión.
- Contar las células utilizando el método estándar de recuento de células y subcultivo en placas de Petri de 150 mm a una densidad de siembra de 1 x 104 células/cm2 para una mayor expansión. Para todos los ensayos, utilice una monocapa confluente de células del número de paso P2-P5.
NOTA: Criopreservar el exceso de células.
3. Evaluación de la capacidad clonogénica de IFP-MSCs mediante ensayo de formación de colonias (UFC-F)
- Para el ensayo CFU-F, siembre las células en medios de expansión en una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos a una densidad de siembra de 50-100 células/cm2. Agregue medios para obtener un volumen final de 3 ml.
NOTA: Optimice la concentración celular para ensayos y tratamiento. - Cultivar las células durante 12 días a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5% en condiciones de cultivo estándar para permitir que las células formen colonias. Cambie los medios cada 3 días. Sea amable al cambiar los medios.
- Después de 12 días, enjuague las colonias 1x con PBS y fíjelas usando metanol al 20% durante 20 minutos en RT. Tiñe las colonias con colorante violeta cristal (0.5% [p/v] en 20% de metanol) durante 20 min en RT. Cuente las colonias individuales usando un microscopio invertido.
NOTA: Una colonia se define como un grupo de más de 50 células.
4. Potencial de diferenciación de IFP-MSCs
- Inducir la diferenciación adipogénica de IFP-MSCs
- Para inducir la adipogénesis, sembrar las células a una densidad de 25 x 103 células/cm2 en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Añadir medios para obtener un volumen final de 500 μL. Cultivar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Un día después de la confluencia, reemplazar el medio de expansión con 500 μL de medios de diferenciación adipogénica. Se requieren aproximadamente 2 días para que las células alcancen la confluencia.
- Preparar los medios de diferenciación adipogénica complementando los medios de expansión (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/ml de anfotericina, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y 25 μg/ml de ciprofloxacino) con 25 mM de D(+)-glucosa, 10 μg/ml de insulina, 1 μM de dexametasona y 100 μM de indometacina.
NOTA: Los medios de diferenciación son inestables a 4 °C después de 1 mes; Por lo tanto, prepare los medios cuando sea necesario. - Considerar las células cultivadas en los medios de expansión suplementados con 25 mM D (+) glucosa como controles no inducidos. Cambie los medios cada 3 días durante 14 días. Al final de los 14 días, lave las células 1 veces con PBS. Fijar las células con formalina tamponada neutra (NBF; formaldehído al 4 % en PBS) durante 15 min a 4 °C.
- Después de la fijación, lavar los pocillos 1x con agua destilada y luego incubar las células con isopropanol al 60% durante 5 minutos en RT. Después de eliminar el isopropanol, tiñe las gotas de lípidos incubando las células con 500 μL de la solución de trabajo del colorante Oil Red O durante 5 min en RT. Lave los pocillos 1x con agua destilada para eliminar el tinte no unido y obtenga imágenes de las células con un microscopio invertido.
NOTA: Prepare la solución madre de Oil Red O (ORO) disolviendo 300 mg de ORO en 100 ml de isopropanol al 99%. Para preparar la solución de trabajo, mezcle tres partes de ORO caldo y dos partes de agua destilada y deje que se mezcle a RT durante 10 minutos. Filtrar la mezcla con papel de filtro de 0,2 μm. La solución de trabajo está lista para usar. La solución madre se puede preparar y almacenar en RT durante 1 mes en la oscuridad, mientras que la solución de trabajo debe estar recién preparada antes de cada uso / tinción.
- Inducir la diferenciación condrogénica de las MSC IFP
- Aislamiento de plasma caprino:
- Prepare citrato de sodio al 3,4% (p/v) en agua destilada. Agregue 5 ml de la solución de citrato de sodio preparada a un tubo de centrífuga de 50 ml.
- Recoja 45 ml de sangre de cabra recién aislada en el mismo tubo. Incline inmediatamente el tubo para mezclar bien la sangre con citrato de sodio para evitar la coagulación y transportarla al laboratorio a 4 °C.
- Centrifugar la sangre de cabra recogida a 1000 x g durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante (plasma) a un tubo nuevo dentro de un gabinete de bioseguridad. Filtrar el plasma a través de filtros de 0,2 μm, alícuota y almacenar a -20 °C para su uso posterior.
NOTA: Mantenga la temperatura de 2-8 °C mientras manipula las muestras. Es importante minimizar los ciclos de congelación-descongelación del plasma.
- Cultive las células expandidas al 80% -90% de confluencia, disocie las células usando solución de tripsina/EDTA y granule las células a 150 x g durante 5 min en un tubo de centrífuga de 15 ml. Resuspender el pellet en plasma de cabra a una densidad de 2 x 106 células por 50 μL de solución plasmática.
- Añadir una gota de células que contienen plasma (50 μL) sobre una placa de Petri esterilizada de 90 mm y, a continuación, añadir cloruro de calcio a una concentración final del 0,3% (p/v). Mezclar bien para fabricar hidrogel de plasma reticulado.
- Incubar el hidrogel fabricado a 37 °C durante 40 min. Después de la incubación, transfiera los hidrogeles a placas de cultivo de tejido de 24 pocillos que contengan medios condrogénicos.
- Preparar medios condrogénicos complementando DMEM bajo nivel de glucosa con 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 1,25 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), 1 mM de prolina, 50 μg/ml de sal trisódica de ácido fosfo-L-ascórbico, 100 nM de dexametasona, 1x insulina, transferrina, selenito de sodio + linoleico-BSA (ITS+1), antibióticos (2,5 μg/ml de anfotericina, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y 25 μg/ml de ciprofloxacino), y factor de crecimiento transformante de 10 ng/mL- β1 (TGF-β1).
- Los hidrogeles cultivados en medios DMEM completos (DMEM bajo en glucosa con 10% de FBS y antibióticos [2,5 μg/ml de anfotericina, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y 25 μg/ml de ciprofloxacino]) sin TGF-β1 se consideran controles no inducidos. Cambie los medios cada 3 días durante 14 días.
- Después de 14 días de diferenciación condrogénica de células en hidrogeles plasmáticos, lavar los hidrogeles con PBS 3x durante 5 min cada uno y luego fijar las muestras en NBF durante 3 h.
PRECAUCIÓN: El formaldehído es un carcinógeno potencial y puede causar irritación en la nariz, garganta y pulmones al inhalar. Realice todos los procedimientos relacionados con el formaldehído en una campana extractora. - Retire el NBF, lave los hidrogeles con PBS 3x durante 5 minutos cada uno y luego incube en sacarosa al 35% (p/v) a RT durante la noche para permitir que la solución se absorba completamente en las muestras. Aclimatar los hidrogeles en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) durante 3 h. Incrustar las muestras en OCT compuesto utilizando moldes de silicona bajo nitrógeno líquido.
- Cortar las muestras a un espesor de 10-12 μm en portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina utilizando un criotomo y almacenarlos a -20 °C para su uso futuro. Para examinar la presencia o deposición de la matriz extracelular después de la diferenciación condrogénica, tiñe las secciones con azul de Alcian y colorante Safranin-O, que se unen a glicosaminoglicanos sulfatados.
NOTA: Para preparar el colorante Alcian Blue, disuelva 1 g de Alcian Blue colorante en 100 ml de HCl 0.1 N y mezcle bien en un mezclador de tubo de ensayo durante la noche. La solución se puede almacenar en RT durante 1 mes en la oscuridad. Para preparar el colorante Safranin-O, disuelva 0,1 g de colorante Safranin-O en 100 ml de agua destilada y mezcle bien en un mezclador de tubo de ensayo durante la noche. - Para la tinción de Alcian Blue, lave las secciones de hidrogel 1x con agua destilada durante 5 min. Para arreglar las secciones, agregue 4% NBF a las diapositivas e incube durante 30 minutos.
- Lave las secciones 1x con agua destilada durante 5 min y luego 2x con HCl 0.1 N durante 30 s cada una. Retire el HCl y seque suavemente los portaobjetos con papel de seda. Añadir la tinción Alcian Blue preparada a las secciones e incubar durante 30 min a 37 °C en una cámara humidificada.
- Lave el tinte sin unir con HCl 0.1 N y luego agua destilada durante 3 min. Deshidrate las secciones en etanol absoluto, límpielas en xileno y, finalmente, monte las secciones teñidas en un medio resinoso para obtener imágenes.
- Para la tinción de Safranin-O, lave las secciones de hidrogel con agua destilada 1 veces durante 5 min. Para arreglar las secciones, agregue 4% NBF a las diapositivas e incube durante 30 minutos. Lave las secciones 1x con agua destilada durante 5 minutos, y luego sumerja los portaobjetos en ácido acético al 1% durante 10-15 s. Seque las diapositivas suavemente con papel de seda.
- Agregue el colorante Safranin-O preparado a las secciones e incube durante 10 minutos en RT. Lave el tinte no unido con etanol al 100%. Sumerja los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min. Seque al aire los portaobjetos, límpielos en xileno y, finalmente, monte las secciones teñidas en un medio resinoso para obtener imágenes.
- Aislamiento de plasma caprino:
- Inducir la diferenciación osteogénica de IFP MSCs
- Para inducir la diferenciación osteogénica, tripsinizar las células, como se indicó anteriormente (Paso 2.2.). Sembrar las células a una densidad de 3 x 103 células/cm2 en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Añadir medios para obtener un volumen final de 500 μL. Cultivar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%. 1 día después de la siembra, reemplace el medio de expansión con medios de diferenciación osteogénica de 500 μL.
- Preparar los medios osteogénicos complementando los medios de expansión (DMEM + 10% FBS +2.5 μg/mL anfotericina, 100 U/mL penicilina-estreptomicina y 25 μg/mL ciprofloxacino) con 25 mM D(+)-glucosa, 10 nM dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL 2-Fosfo-L-sal trisódica de ácido ascórbico y 10 nM vitamina D3.
NOTA: Las células cultivadas en medios de expansión suplementados con 25 mM D (+) de glucosa se consideran controles no inducidos. - Cambie los medios osteogénicos cada 3 días durante 14 días o 28 días. Al final de 14 días, medir el grado de osteogénesis mediante la tinción de fosfatasa alcalina (ALP).
NOTA: Para preparar el sustrato para la tinción de ALP, disuelva una tableta de 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)/nitroazul tetrazolio (NBT) en 10 ml de agua destilada en un tubo de centrífuga de 15 ml. Deje que la tableta se disuelva completamente. La solución de sustrato está lista para usar. Dado que la solución de sustrato no se puede almacenar durante más tiempo, según la necesidad, parta la tableta por la mitad y disuélvala en 5 ml de agua destilada. Para preparar el tampón de permeabilización, agregue el tampón Tris (100 mM) y el cloruro de magnesio (5 mM) al agua destilada. Añadir Triton X100 (0,1%) a la solución y dejar que se disuelva. Ajuste el pH de la solución a 9.25-9.75. - Para la tinción de ALP, después de 14 días de inducción, retire los medios y lave las células con PBS. Fijar las celdas usando NBF (4%) durante 1 min. Lave las celdas con PBS y penetre usando el tampón de lisis preparado durante 2-3 min.
- Añadir 500 μL de la solución de sustrato preparada a las células y dejar incubar durante 15 min a 1 h, dependiendo del nivel de expresión. Compruebe el desarrollo del color púrpura / azul en el medio.
- Retire la solución de sustrato y lave con agua destilada. Imagen de las células teñidas usando un microscopio invertido.
- Al final de 28 días, medir el grado de calcificación después de la inducción osteogénica mediante tinción de Alizarin Red-S.
NOTA: Para preparar la solución de tinción Alizarin Red-S (40 mM), disuelva 2 g de Alizarin Red-S en 100 ml de agua destilada y ajuste el pH a 4.1-4.3 con HCl o NH4OH. Filtrar la solución a través de una membrana de 0,22 μm y almacenar a 4 °C en la oscuridad. El pH de la solución es importante; por lo tanto, se recomienda hacer una solución nueva o volver a medir el pH de la solución si tiene más de 1 mes de edad. - Para la tinción de Alizarin Red-S, después de 28 días de inducción, retire el medio y lave las células 1 veces con PBS frío. Fijar las células con etanol al 70% durante 1 h a 4 °C.
- Retire el fijador y lave las células 2 veces con agua destilada. Retire el agua por completo y agregue 1 ml de solución de Alizarin Red-S a cada pocillo.
- Incubar las células con la solución durante 1 h en RT y obtener imágenes de las células con un microscopio invertido.
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Representative Results
Aislamiento de IFP-MSCs de la articulación femorotibial de cabra
Los pasos involucrados en el aislamiento de IFP-MSC de la articulación sofocante de una cabra se representan en la Figura 1. La almohadilla de grasa presente en la superficie interna no articulada de la rótula se eliminó, se picó y se digirió enzimáticamente. Los IFP-MSCs fueron aislados con éxito y cultivados in vitro (Figura 2A).
Expansión y capacidad clonogénica de IFP-MSCs
Las células aisladas se cultivaron in vitro en medios de expansión. Las células comenzaron a adherirse a la placa de cultivo de tejidos dentro de las 12 h posteriores a la siembra y en su mayoría tenían forma redonda en el día 0. Fueron homogéneamente adherentes a la placa y alcanzaron una morfología alargada en 24 h. Esta morfología se mantuvo durante toda la duración del cultivo. Las células proliferaron eficientemente en cultivo y se convirtieron en 80%-90% confluentes dentro de los 6 días de expansión (Figura 2A). Además, las células aisladas mostraron capacidad clonogénica, evaluada mediante el ensayo de fibroblastos unitarios formadores de colonias (UFC-F) (Figura 2B). Estos resultados indican que las células aisladas tienen capacidades proliferativas y de auto-renovación eficientes in vitro.
Potencial de diferenciación de IFP-MSCs
Para caracterizar si las células aisladas eran multipotentes y poseían rasgos característicos de las MSC, se les indujo a diferenciarse en múltiples linajes. Las células aisladas, cuando fueron inducidas hacia el linaje adipogénico, produjeron gotas de lípidos, como se puede observar en las imágenes de campo claro (Figura 3A). Esto se confirmó aún más por la tinción de Oil Red O en el día 14 y el día 21, lo que sugiere la capacidad de estas células para diferenciarse en adipocitos. Por otro lado, no se observaron gotas de aceite visibles en las células cultivadas en ausencia de factores inductores adipogénicos (Figura 3B, C).
Para determinar el potencial condrogénico de las células aisladas, las células se encapsularon en hidrogel plasmático y se les permitió diferenciarse en el linaje condrogénico. Como se muestra en las imágenes macroscópicas del hidrogel plasmático (Figura 4A), el neotejido formado después de 14 días en el grupo inducido apareció blanco y brillante (similar al cartílago articular), mientras que en el grupo no inducido, fue blanco pálido y se observó brillo reducido. Además, las células del grupo inducido fueron capaces de secretar uno de los principales componentes de la matriz del cartílago (es decir, glicosaminoglicanos sulfatados), evidenciado por tinción histológica positiva para el azul de Alcian (Figura 4B) y Safranin O (Figura 4C). En contraste, las secciones de hidrogel de los grupos no inducidos fueron negativas para la tinción de Safranin O y Alcian Blue. Estos resultados indican colectivamente el potencial de diferenciación condrogénica de las MSC en presencia de estímulos condrogénicos solamente.
Las células aisladas también demostraron potencial de diferenciación osteogénica. Después de 14 días y 21 días en cultivo, no se observó mineralización espontánea (grupo no inducido). Sin embargo, cuando se indujo con medios osteogénicos, la mineralización fue evidente por la tinción positiva para fosfatasa alcalina (ALP) al final de 14 días (Figura 5A). Además, después de 28 días de cultivo en medios osteogénicos, se visualizaron depósitos calcificados mediante tinción positiva de Alizarin Red-S (Figura 5B). Estos resultados demuestran que las células aisladas de la almohadilla de grasa infrapatelar de cabra, cuando se inducen, tienen el potencial de diferenciarse en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos.
Figura 1: Esquema para el aislamiento de IFP-MSC de la articulación sofocante de la rodilla de cabra. Paso 1. Recoja la muestra de rodilla de cabra del matadero y proceda con la disección en un gabinete de bioseguridad; Paso 2. Examine cuidadosamente la anatomía del tejido y elimine los músculos circundantes y el tejido adiposo; Paso 3. Sin alterar la cápsula articular, retire los músculos y los tejidos adiposos para exponer completamente ambos huesos largos (fémur y tibia); Paso 4. Haga una incisión en la membrana sinovial y abra la articulación articulada para exponer la rótula y el cartílago troclear; Paso 5. Retire la rótula de la articulación con cuidado, sin alterar la almohadilla de grasa infrapatelar (IFP), y manténgala en una placa de Petri que contenga PBS; Paso 6. Retire lentamente toda la almohadilla de grasa de la rótula y manténgala en una placa de Petri fresca para picar y la digestión enzimática. (a. Fémur, b. Tibia, c. Rótula, d. Cartílago troclear, e. Almohadilla de grasa infrarotuliana). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología y potencial clonogénico de IFP-MSCs . (A) Las micrografías se tomaron en el pasaje 3 utilizando un microscopio de campo claro invertido con un aumento de 10x. Inmediatamente después de la siembra (día 0), las células permanecieron en forma redonda, en el día 3 la mayoría de las células alcanzaron una morfología alargada, y en el día 6 los IFP-MSC se volvieron 80% -90% confluentes (barra de escala = 100 μm). (B) Imágenes representativas (n = 3) de colonias de UFC-F teñidas con colorante violeta cristalino después de 12 días de siembra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferenciación adipogénica de IFP-MSCs. El panel superior indica micrografías de IFP-MSC no inducidas, y el panel inferior representa IFP-MSC inducidas en el linaje adipogénico. (A) Imágenes representativas de campo claro que muestran la formación de vacuolas lipídicas durante la adipogénesis (barra de escala = 100 μm). Imágenes representativas de tinción Oil Red O de gotas lipídicas en (B) día 14 y (C) día 21 de diferenciación (barra de escala = 20 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diferenciación condrogénica de IFP-MSCs. El panel superior indica construcciones / secciones de hidrogel a partir de hidrogel no inducido, y el panel inferior representa el hidrogel sometido a condrogénesis. (A) Imágenes macroscópicas de construcciones de hidrogel plasmático después de 14 días en cultivo en ausencia (no inducida) o presencia (inducida) de medios condrogénicos suplementados con TGF-β1. Imágenes representativas de secciones de 10 μm de hidrogel teñidas con colorante de unión sGAG (B) Azul Alciano (azul) y (C) Safranina O (rojo) (Barra de escala = 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diferenciación osteogénica de IFP-MSCs. El panel superior indica células no inducidas, y el panel inferior indica células inducidas con medios osteogénicos. Micrografías e imágenes representativas de IFP-MSCs teñidas con (A) BCIP-NBT (fosfatasa alcalina) después de 14 días y (B) Alizarin Red-S (depósito de calcio) después de 28 días de diferenciación (barra de escala = 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el presente protocolo, se ha proporcionado un método simple, confiable y reproducible para el aislamiento de MSC de IFP de cabra. Las células aisladas utilizando este método se han utilizado con éxito en nuestros estudios previos para la regeneración de tejidos in vitro. Se observó que las células aisladas eran proliferativas, respondían a diversos factores de crecimiento y conservaban su actividad biológica cuando se sembraban en fibras electrohiladas y andamios25,26. Además, se observó que un gran número de MSCs de alta calidad pueden ser obtenidas y co-cultivadas con condrocitos en hidrogeles inyectables para diseñar cartílago articular in vitro27,28,29. Si bien el procedimiento para la disección y el aislamiento de células es simple, hay algunos pasos que deben seguirse cuidadosamente para el aislamiento y la expansión exitosos de las MSC de IFP. En primer lugar, dado que no es posible mantener condiciones verdaderamente asépticas mientras se trae la muestra del matadero, se recomienda limpiar el tejido externo con etanol al 70% para esterilizar el tejido antes de comenzar el procedimiento de aislamiento. El siguiente paso importante es diseccionar la almohadilla de grasa de la articulación de la rodilla. El IFP se encuentra debajo de la rótula en la articulación de la rodilla. El extremo proximal del IFP está unido al extremo distal de la rótula30,31. Por lo tanto, se vuelve muy importante identificar la ubicación correcta de la rótula mientras se realiza el procedimiento de aislamiento. A continuación, como el IFP se articula con el cartílago troclear en el fémur y se cubre con la membrana sinovial30,31, es necesario hacer una incisión en la membrana sinovial para abrir la articulación de la rodilla. También es crucial observar la salud general de la almohadilla de grasa infrapatelar recolectada. Como el IFP está compuesto de adipocitos (células) y tejido conectivo adiposo, como colágeno y glicosaminoglicanos, el tejido es picado y digerido usando la enzima colagenasa para liberar las células 9,32. Los adipocitos flotantes se separan por centrifugación a una velocidad lenta para tener un cultivo homogéneo de MSC. Los adipocitos restantes en la fracción vascular estromal deben eliminarse de la placa de cultivo de tejidos en cada cambio de medio lavando la monocapa celular con PBS antes de agregar medios nuevos. Este paso debe continuarse hasta que se eliminen todos los adipocitos visibles. Se sugiere volver a sembrar las células en una nueva placa después de que las células P0 alcancen la confluencia para deshacerse de los adipocitos restantes, que podrían haberse adherido a la pared de la placa y son difíciles de eliminar. Finalmente, como las muestras de cabra se obtienen principalmente de un matadero, es difícil rastrear la edad exacta de la cabra y, por lo tanto, al aislar las células, la variación entre las muestras debe observarse y documentarse cuidadosamente. Se sugiere caracterizar las células para la auto-renovación (UFC-F), la proliferación y el potencial de diferenciación después de cada aislamiento antes de que se utilicen para diversas aplicaciones y estudios mecanicistas. Debido al requisito de un gran número de células en aplicaciones de ingeniería de tejidos basados en células, las condiciones de cultivo que facilitan la proliferación, retrasan la senescencia y mantienen el tallo de las células se vuelven centralmente importantes. Se observó que las MSC cultivadas en sal trisódica (PAA) de ácido 2-fosfo-L-ascórbico y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) mostraron un aumento de ~ 42 veces en su número en comparación con las MSC cultivadas en bFGF solo. Además, el cotratamiento de PAA y bFGF redujo la producción de especies reactivas de oxígeno (debido a sus propiedades antioxidantes) y la senescencia en las células madre. Por lo tanto, el uso de PAA durante la expansión in vitro de las MSC es deseable33.
Mientras que la digestión enzimática de los tejidos se emplea universalmente y es un método eficiente para aislar las MSC, el uso de enzimas como las colagenasas requiere mucho tiempo y es costoso34. En el presente estudio, la digestión completa del tejido utilizando colagenasa tomó 12-16 h (durante la noche), lo que podría conducir a una disminución de la viabilidad o alteración del fenotipo superficial de las células35. Por lo tanto, el método se puede optimizar aún más para reducir la duración del tratamiento con colagenasa para la digestión de tejidos. Alternativamente, también se puede explorar un método de cultivo de explante libre de enzimas que se utiliza para el aislamiento de MSC derivadas de tejido adiposo de lipoaspirados o almohadillas de grasa inguinal para el aislamiento de IFP-MSC34,36,37.
Los IFP-MSC, debido a su capacidad para diferenciarse en linajes condrogénicos, adipogénicos y osteogénicos, poseen un amplio potencial terapéutico. Informes anteriores han demostrado que las IFP-MSC exhiben un mejor potencial condrogénico que otras células madre 6,7,9,10. Por lo tanto, los IFP-MSC han ganado interés y se consideran un mejor candidato para la terapia basada en células para la reparación de defectos del cartílago y el alivio de la degradación del cartílago en la osteoartritis. En un estudio preclínico, la administración conjunta de IFP-MSCs con componentes de la matriz extracelular del cartílago a través de inyección intraarticular resultó en una mayor regeneración del cartílago en defectos osteocondrales38. Del mismo modo, la inyección intraarticular de IFP-MSCs en el modelo de osteoartritis (OA) de conejo condujo a una disminución en los siguientes parámetros de la enfermedad: degradación del cartílago, formación de osteofitos, engrosamiento del hueso subcondral y sinovitis39. Además, los resultados de un ensayo clínico aleatorizado previamente reportado13 y un ensayo clínico de fase 1 de nivel abierto recientemente publicado40 han demostrado que las inyecciones intraarticulares de IFP-MSC en pacientes con osteoartritis de rodilla son seguras y resultan en la reducción del dolor y la mejora de la función articular, lo que indica su prometedor potencial terapéutico para mejorar las complicaciones relacionadas con la OA de rodilla. También se ha demostrado que los IFP-MSC desarrollan propiedades inmunomoduladoras aumentadas en presencia de señales proinflamatorias al facilitar la degradación de un regulador inflamatorio, la sustancia P (SP), lo que lleva a una reducción de las moléculas proinflamatorias y catabólicas y, como consecuencia, mejora el tratamiento de la inflamación y la fibrosis de la membrana sinovial y el IFP6. . Más importante aún, las IFP-MSC procesadas en condiciones que cumplen con la normativa mostraron mejor proliferación, capacidad de diferenciación y propiedades inmunomoduladoras en comparación con las condiciones estándar de cultivo in vitro, lo que demuestra su potencial de éxito clínico cuando se utilizan para la terapia basada en células madre mesenquimales (MSC)41.
En conclusión, el presente protocolo describe el aislamiento de células madre mesenquimales (MSC) derivadas de la almohadilla de grasa infrapatelar (IFP) de la articulación sofocante de cabra mediante digestión enzimática y su mantenimiento en cultivo. Las células aisladas tienen potencial proliferativo y de autorrenovación y pueden diferenciarse en linajes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos. Los IFP-MSC son una fuente prometedora de MSC y tienen potencial traslacional para aplicaciones de medicina regenerativa.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
SH agradece el apoyo de la beca postdoctoral del Instituto de IIT Kanpur y la subvención SYST de DST (División SEED) (SP/YO/618/2018). AM reconoce al Instituto Indio de Tecnología-Kanpur (IIT-Kanpur) por una beca del Instituto. DSK reconoce a Gireesh Jankinath Chair Professorship y Department of Biotechnology, India, por su financiación (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH y DSK agradecen al Centro Familiar Mehta de Ingeniería en Medicina en IIT-Kanpur por su generoso apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
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