Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering, utvidelse og differensiering av mesenkymale stamceller fra Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Published: August 2, 2022 doi: 10.3791/63617
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2
1Department of Biological Sciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Kanpur, 2The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine, Indian Institute of Technology-Kanpur, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

Infrapatellar fettpute mesenkymale stamceller (IFP-MSCs) kan enkelt isoleres fra kneleddets infrapatellar fettpute. De sprer seg godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og skiller seg ut i adipogene, kondrogene og osteogene linjer. Her er metodikken for isolering, utvidelse og differensiering av IFP-MSCs fra geitkvelerfeste gitt.

Abstract

IFP, som finnes i kneleddet, fungerer som en lovende kilde til MSCs. IFP er et lett tilgjengelig vev som det rutinemessig resekteres og kastes under artroskopiske prosedyrer og kneproteseoperasjoner. I tillegg er fjerningen forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige studier har vist at IFP-MSCs ikke mister sin proliferasjonskapasitet under in vitro-ekspansjon og har aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial. IFP-MSCs har overlegent kondrogent differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede stamceller (ADSC). Selv om disse cellene er lett oppnåelige fra eldre og syke pasienter, er deres effektivitet begrenset. Derfor er bruk av IFP-MSCs fra friske givere viktig for å bestemme effekten i biomedisinske applikasjoner. Ettersom tilgang til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ for å muliggjøre grunnleggende forståelse. Store dyr som hunder, hester, sauer og geiter spiller en avgjørende rolle i translasjonsforskning. Blant disse kan geiten være en foretrukket modell siden geitens kvelerledd har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet. Videre kan geit-IFP oppfylle de høyere MSC-tallene som trengs for vevregenereringsapplikasjoner. Videre gjør lave kostnader, tilgjengelighet og overholdelse av 3R-prinsippene for dyreforsøk dem til en attraktiv modell. Denne studien demonstrerer en enkel protokoll for å isolere IFP-MSCs fra kvelningsleddet til geiter og in vitro-kulturforhold for utvidelse og differensiering. Den aseptisk isolerte IFP fra geiten ble vasket, hakket og fordøyd enzymatisk. Etter filtrering og sentrifugering ble de oppsamlede cellene dyrket. Disse cellene var vedvarende, hadde MSCs-lignende morfologi og demonstrerte bemerkelsesverdig klonogen evne. Videre differensierte de seg i adipogene, kondrogene og osteogene linjer, og demonstrerte deres multipotens. Avslutningsvis demonstrerer studien isolering og utvidelse av MSCs, som viser potensial i vevsteknikk og regenerative medisinapplikasjoner.

Introduction

Mesenkymale stamceller (MSCs) er en attraktiv kandidat for cellebaserte terapier i regenerativ medisin 1,2. De kan høstes fra en rekke vevskilder som benmarg, navlestreng, morkake, tannmasse og subkutant fettvev3. Men da tilgjengeligheten av stamceller hos voksne er begrenset og deres isolasjonsprosedyre ofte er invasiv (noe som resulterer i morbiditet på donorstedet), er det ønskelig å ha en alternativ stamcellekilde som kan omgå disse utfordringene.

Kneleddet er et depot av forskjellige celletyper, for eksempel infrapatellar fettpute-avledede MSCer, synovialmembran-avledede MSCer, synovialvæskeavledede MSCer, ligamentfibroblaster, leddkondrocytter, etc 4,5,6. Disse cellene har potensial til å bli mye utforsket i muskuloskeletale vev engineering-basert forskning. Derfor kan kneleddet være en mulig og pålitelig kilde til flere typer MSCs. Fettdepot som ligger i kneleddet, kjent som infrapatellar fettpute (IFP) eller Hoffas fettpute, er et lovende og alternativt valg av MSC depot. IFP er en relativt lett tilgjengelig og klinisk oppnåelig kilde til MSCs, da den rutinemessig resekteres og kastes som kirurgisk avfall under knelektroskopi eller åpen knekirurgi. Fjerning av IFP er forbundet med minimal donor-site morbiditet, noe som også gjør det til en attraktiv vevskilde. Selv om de har en lignende fenotypisk profil, har MSCer fra IFP (IFP-MSCs) forbedret klonogent potensial sammenlignet med benmargsavledede mesenkymale stamceller (BM-MSCs)6 og bedre proliferativ kapasitet sammenlignet med subkutane fettavledede stamceller (ADSC)7. Interessant nok, sammenlignet med synovialvæskeavledede MSCer (SF-MSCs), mister IFP-MSCs ikke sin proliferative kapasitet ved sene passasjer, og doblingstiden øker heller ikke ved sene passasjer. Dette antyder at IFP-MSC-er under celleutvidelse kan oppnå et tilstrekkelig stort antall celler for in vitro vevstekniske applikasjoner uten at det går ut over spredningshastigheten8. Nylige studier har også antydet at IFP-MSCs har overlegen kondrogen differensieringspotensial sammenlignet med benmargsavledede MSCs (BMSCs) og fettavledede MSCs (ADSCs), sannsynligvis på grunn av deres anatomiske nærhet til leddbrusk, noe som indikerer deres egnethet for bruskvevsteknikk 6,7,9,10. Videre har de også aldersuavhengig osteogen differensieringspotensial11. Intraartikulær injeksjon av IFP-MSCs har vist seg å redusere smerte og forbedre kneleddfunksjoner hos pasienter med slitasjegikt (OA) 12,13. Videre erdet også rapportert sterke immunsuppressive responser og forbedrede immunmodulerende egenskaper til IFP-MSCs i nærvær av inflammatoriske cytokiner under patologiske forhold 6.

IFP-MSCs er en lovende og alternativ kilde til MSCs; Imidlertid er deres terapeutiske fordel i vevsteknikk og regenerativ medisin relativt mindre utforsket. De eksisterende studiene på IFP-MSCs har i stor grad benyttet celler fra humane givere. Blant disse har noen få nyere studier undersøkt IFP-MSCs fra friske humane donorer (ikke-artrittiske pasienter, i alderen 17-60 år) 6,14, mens de fleste studiene har brukt IFP-MSCs fra eldre pasienter som gjennomgår total kneprotesekirurgi (syke pasienter, alder 70-80 år). Siden både alder og sykdom er kjent for å endre stamcellers normale funksjon (redusert antall og tap av funksjonelt potensial), kan dette potensielt føre til uoverensstemmelser i utfallet av de MSC-baserte studiene 7,15,16,17. I tillegg til dette utgjør bruken av IFP-MSCs fra pasienter med patofysiologiske tilstander (f.eks. leddgikt og fedme) også vanskeligheter med å forstå de grunnleggende egenskapene til friske celler in vitro, og fungerer dermed som en begrensende faktor i utviklingen av MSCs-baserte terapier. For å overvinne disse problemene er bruk av IFP-MSCs fra friske givere avgjørende. Ettersom tilgangen til en sunn menneskelig donor er utfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne forbindelse er det noen få studier der IFP har blitt isolert fra mus18. På grunn av den lille størrelsen på fettputen i normale mus, har fettvev fra flere dyr blitt kombinert for å få nok vev til å utføre forseggjorte eksperimentelle prosedyrer19. Derfor er det behov for en stor dyremodell, som kan oppfylle kravet til det høyere antall celler og samtidig overholde 3R-prinsippene (forfine, erstatte og redusere) i dyreforsøk20. Bruken av store dyr har betydelige implikasjoner i translasjonsforskning. Spesielt i muskel- og skjelettvevsteknikk har en rekke store dyr som hunder, griser, sauer, geiter og hester blitt undersøkt21. Geit (Capra aegagrus hircus) er et utmerket valg av stort dyr siden kvelerleddet har den nærmeste anatomien til det menneskelige kneleddet22,23,24. Den subchondrale beintrabekulære strukturen og subchondral beintykkelse av geiter ligner på mennesker, og andelen av brusk til bein er også rapportert å være nær mennesker21. I tillegg har geiter blitt mye tammet over hele verden, noe som gjør dem lett tilgjengelige når de er skjelettmodne. Videre har lave vedlikeholdskostnader og enkel håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodell for forskning22.

I denne studien er det vist en enkel protokoll for isolering av IFP-MSCs fra kvelerleddet til Capra aegagrus hircus (geit) og in vitro-kulturbetingelser for utvidelse og differensiering. De isolerte cellene er vedheftige, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhetsfibroblast) kolonier, og har adipogent, kondrogent og osteogent differensieringspotensial. Derfor viser IFP-MSCs potensial som en alternativ kilde til MSCs for biomedisinske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen er basert på isolering av IFP-MSCs fra geiter. Geit IFP og blod ble samlet inn fra et lokalt slakteri. Siden slike vevssamlinger er utenfor ansvarsområdet til en institusjonell dyreetisk komité, var det ikke nødvendig med etisk godkjenning.

1. Isolering av IFP-MSCs fra femorotibial ledd av geit kne

  1. Samle geit femorotibial ledd (prøve) som omfatter ~ 15 cm hver av lårbenet og tibial regioner av bakre lemmer. Plasser prøven umiddelbart i en sterilisert prøveinnsamlingsboks og oppbevar den ved 4 °C for transport til laboratoriet for videre behandling. Behandle prøvene aseptisk i et biosikkerhetsskap, ved hjelp av steriliserte kirurgiske verktøy gjennom hele prosedyren (figur 1, trinn 1).
  2. Plasser prøven på en 150 mm petriskål og skyll den grundig med autoklaveres fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med antibiotika (5 μg / ml amfotericin B, 200 U / ml penicillin-streptomycin og 50 μg / ml ciprofloxacin) for å unngå forurensning. Sørg alltid for at prøven holdes hydrert ved hjelp av PBS.
  3. Undersøk nøye de anatomiske områdene i prøven. For enkel tilgang til leddkapselen må du sørge for at det ekstra vevet fra begge de lange beinene fjernes helt (figur 1, trinn 2).
  4. For å oppnå dette, hold først endeflaten av lårbenet med en hånd og, med skarp saks, kutt i lengderetningen mot leddet. Fjern de omkringliggende musklene og fettvevet fra beinet under prosessen. Vær forsiktig med at vevet rundt den umiddelbare leddkapselen forblir uforstyrret i utgangspunktet.
  5. På samme måte gjør du et nytt snitt i tibialenden av prøven og fjerner musklene og fettvevet fra tibialbenet. Sørg for at begge de lange knoklene er helt eksponert og at leddkapselen er godt synlig etter dette trinnet (figur 1, trinn 3).
  6. Deretter gjør du et snitt fra hver side av synoviummembranen for å kutte opp leddleddet (figur 1, trinn 4). Klipp fri patellaen fra både synoviummembranen og patellarbåndene ved hjelp av en ny gruppe sterilisert saks og tang. Oppbevar umiddelbart den separerte patellaen i en petriskål som inneholder PBS (figur 1, trinn 5).
  7. Fjern hele fettputen på patellaens indre overflate med saks og tang, og samle fettputen i en annen fersk petriskål (figur 1, trinn 6). Hakk den oppsamlede fettputen ved hjelp av en skalpell. Inkluder andre kirurgiske verktøy (f.eks. saks eller kirurgiske kniver) etter behov for å oppnå minst mulig fettbiter/segmenter på ~2-3 mm.
    MERK: God hakking er avgjørende for å resultere i et godt utbytte av celler. Hold alltid vevet hydrert og ikke la det tørke på noe stadium av isolasjonsprosedyren.
  8. Overfør hakket vev ved hjelp av en slikkepott til et 50 ml sentrifugerør og vask det med PBS supplert med antibiotika ved romtemperatur (RT) i 15 minutter i en reagensrørblander. Gjenta vasketrinnet 3x, 15 min hver.
  9. For enzymatisk fordøyelse, inkuber det hakkede vevet (~ 5 g) i Dulbeccos Modified Eagle's Media (DMEM lav glukose) som inneholder 1,5 mg / ml type II kollagenase (20 ml) og supplert med 2% FBS ved 37 ° C i 12-16 timer.
    MERK: Utfør fordøyelsen i en reagensrørblander ved ~ 15 rotasjoner per minutt (RPM).
  10. Aspirer forsiktig det fordøyede vevet og filtrer det gjennom en cellesil (70 μm) for å fjerne ufordøyd vev. Sentrifuger filtratet i et 15 ml sentrifugerør ved 150 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten og vask pelleten med DMEM lav glukose minst 2x.
    MERK: Hell det fordøyede vevet sakte inn i silen for å unngå søl. Bruk et sentrifugerør med lavt volum (15 ml) for å få en god pellet.
  11. Resuspend den oppnådde cellepelleten i komplette DMEM-medier (DMEM lav glukose supplert med 10% FBS og antibiotika [2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin]), referert til som ekspansjonsmedier i protokollen i de påfølgende trinnene.
  12. Frø cellene på 150 mm petriskåler og dyrk dem i ekspansjonsmediet supplert med 5 ng / ml basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) og 50 μg / ml 2-fosfo-L-askorbinsyre trinatriumsalt. Inkuber cellene ved 37 °C i en 5% CO 2-inkubator slik at cellene kan feste seg og spre seg. Overvåk vedlegget og veksten av cellene på daglig basis.

2. Vedlikehold og utvidelse av isolerte celler

  1. Bytt media hver 3. dag til cellene blir sammenflytende. Tilsett ferskt 5 ng/ml bFGF og 50 μg/ml 2-fosfo-L-askorbinsyre trinatriumsalt direkte i petriskålen hver gang mediet skiftes. Etter at cellene blir 80% -90% sammenflytende, subkultur cellene.
    MERK: Fjern enhetene som ikke er tilhenger under hver medieendring. Hvis oljedråper ses etter 3 dagers inkubasjon, vask cellene med PBS 1x og tilsett deretter friske medier til petriskålen. Fortsett med PBS-vask før hvert medieskift til oljedråpene er helt fjernet.
  2. Underdyrking av celler: Fjern ekspansjonsmediet fra petriskålen og vask cellene 1x med PBS. Tilsett 4 ml 0,25 % trypsin/EDTA i retten og inkuber cellene ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator i 4 minutter.
    MERK: Confluency (80% -90%) oppnås innen 7 dager. Fordel trypsin/EDTA-oppløsningen jevnt over hele overflaten av petriskålen under trypsinisering.
  3. Løsne cellene ved å tappe platen på siden og observere under et mikroskop for å bekrefte at alle cellene er løsrevet. Nøytraliser trypsinet etter tilsetning av et likt volum (4 ml) ekspansjonsmedier.
  4. Samle de dissosierte cellene ved hjelp av en pipette i et friskt 15 ml polypropylenrør og sentrifuge ved 150 x g i 5 minutter ved RT. Kast supernatanten og resuspender pelleten i ønsket volum ekspansjonsmedier.
  5. Tell cellene ved hjelp av standard celletellingsmetode og subkultur i 150 mm petriskåler ved en sådensitet på 1 x 104 celler/cm2 for videre ekspansjon. For alle analyser, bruk et sammenflytende monolag av celler med passasjenummer P2-P5.
    MERK: Cryopreserve overflødige celler.

3. Evaluering av den klonogene evnen til IFP-MSCs ved bruk av kolonidannende analyse (CFU-F)

  1. For CFU-F-analyse, frø cellene i ekspansjonsmedier i en 6-brønns vevskulturplate ved en sådensitet på 50-100 celler / cm2. Legg til medier for å få et endelig volum på 3 ml.
    MERK: Optimaliser cellekonsentrasjonen for analyser og behandling.
  2. Dyrk cellene i 12 dager ved 37 °C i en 5% CO 2-inkubator under standard dyrkningsbetingelser for å la cellene danne kolonier. Bytt media hver 3. Vær forsiktig når du skifter media.
  3. Etter 12 dager, skyll koloniene 1x med PBS og fest dem med 20% metanol i 20 minutter ved RT. Flekk koloniene med krystallfiolett fargestoff (0,5% [w / v] i 20% metanol) i 20 minutter ved RT. Tell de enkelte koloniene ved hjelp av et omvendt mikroskop.
    MERK: En koloni er definert som en klynge på mer enn 50 celler.

4. Differensieringspotensialet til IFP-MSCs

  1. Indusere adipogen differensiering av IFP-MSCs
    1. For å indusere adipogenese, frø cellene med en tetthet på 25 x 103 celler / cm2 i en 24-brønns vevskulturplate. Tilsett medier for å oppnå et sluttvolum på 500 μL. Dyrk cellene ved 37 °C i en 5% CO 2-inkubator.
    2. En dag etter sammenløp, erstatt ekspansjonsmediet med 500 μL adipogene differensieringsmedier. Det tar omtrent 2 dager for cellene å nå sammenløp.
    3. Forbered adipogenic differensieringsmedier ved å supplere ekspansjonsmedier (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin) med 25 mM D (+) -glukose, 10 μg / ml insulin, 1 μM dexametason og 100 μM indometacin.
      MERK: Differensieringsmediet er ustabilt ved 4 °C etter 1 måned; Forbered derfor media etter behov.
    4. Tenk på cellene som dyrkes i ekspansjonsmediet supplert med 25 mM D (+) glukose som induserte kontroller. Bytt media hver 3. dag i 14 dager. På slutten av de 14 dagene, vask cellene 1x med PBS. Fest cellene med nøytral bufret formalin (NBF; 4 % formaldehyd i PBS) i 15 minutter ved 4 °C.
    5. Etter fiksering, vask brønnene 1x med destillert vann og inkuber deretter cellene med 60% isopropanol i 5 minutter ved RT. Etter å ha fjernet isopropanol, flekker lipiddråpene ved å inkubere cellene med 500 μL av arbeidsløsningen av oljerød O-fargestoff i 5 minutter ved RT. Vask brønnene 1x med destillert vann for å fjerne det ubundne fargestoffet og avbilde cellene ved hjelp av et omvendt mikroskop.
      MERK: Forbered stamløsningen av Oil Red O (ORO) ved å oppløse 300 mg ORO i 100 ml 99% isopropanol. For å klargjøre arbeidsløsningen, bland tre deler av lager ORO og to deler destillert vann og la det blande ved RT i 10 minutter. Filtrer blandingen med 0,2 μm filterpapir. Arbeidsløsningen er klar til bruk. Stamløsningen kan klargjøres og oppbevares på RT i 1 måned i mørket, mens arbeidsløsningen må tilberedes på nytt før hver bruk/farging.
  2. Indusere kondrogen differensiering av IFP MSCs
    1. Isolering av geitplasma:
      1. Forbered 3,4% (w / v) natrium-citrat i destillert vann. Tilsett 5 ml av den tilberedte natriumcitratoppløsningen til et 50 ml sentrifugerør.
      2. Samle 45 ml av det nyisolerte geiteblodet i samme rør. Vipp røret umiddelbart for å blande blodet med natriumsitrat grundig for å forhindre koagulering og transportere det til laboratoriet ved 4 °C.
      3. Sentrifuge det oppsamlede geiteblodet ved 1000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten (plasma) til et nytt rør inne i et biosikkerhetsskap. Filtrer plasmaet gjennom 0,2 μm filtre, aliquot, og lagre ved -20 ° C for videre bruk.
        MERK: Hold temperaturen på 2-8 °C under håndtering av prøvene. Det er viktig å minimere fryse-tine sykluser av plasma.
    2. Dyrk de utvidede cellene til 80% -90% sammenløp, dissosiere cellene ved hjelp av trypsin / EDTA-løsning, og pellet ned cellene ved 150 x g i 5 minutter i et 15 ml sentrifugerør. Resuspend pelleten i geitplasma ved en tetthet på 2 x 106 celler per 50 μL plasmaoppløsning.
    3. Tilsett en dråpe plasmaholdige celler (50 μL) på en sterilisert 90 mm petriskål og tilsett deretter kalsiumklorid ved en endelig konsentrasjon på 0,3 % (w/v). Bland godt for å fremstille tverrbundet plasmahydrogel.
    4. Inkuber den fremstilte hydrogelen ved 37 °C i 40 minutter. Etter inkubering, overfør hydrogelene til 24-brønns vevskulturplater som inneholder kondrogene medier.
    5. Forbered kondrogene medier ved å supplere DMEM lav glukose med 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), 1,25 mg / ml bovint serumalbumin (BSA), 1 mM prolin, 50 μg / ml 2-fosfo-L-askorbinsyre trinatriumsalt, 100 nM dexametason, 1x insulin, transferrin, natriumselenitt + linolsyre-BSA (ITS + 1), antibiotika (2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin), og 10 ng/ml transformerende vekstfaktor- β1 (TGF-β1).
    6. Hydrogelene dyrkes i komplette DMEM-medier (DMEM lav glukose med 10% FBS og antibiotika [2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin]) uten TGF-β1 betraktes som induserte kontroller. Bytt media hver 3. dag i 14 dager.
    7. Etter 14 dager med kondrogen differensiering av celler i plasmahydrogeler, vask hydrogelene med PBS 3x i 5 minutter hver og fest deretter prøvene i NBF i 3 timer.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er et potensielt kreftfremkallende stoff og kan forårsake irritasjon i nese, hals og lunger ved innånding. Utfør alle prosedyrer knyttet til formaldehyd i en avtrekkshette.
    8. Fjern NBF, vask hydrogelene med PBS 3x i 5 minutter hver, og inkuber deretter i 35% (w / v) sukrose ved RT over natten for å tillate at løsningen absorberes fullstendig i prøvene. Akklimatiser hydrogelene i optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse i 3 timer. Legg inn prøvene i OCT-forbindelsen ved hjelp av silikonformer under flytende nitrogen.
    9. Klipp prøvene med en tykkelse på 10-12 μm på gelatinbelagte glassglass ved hjelp av et kryotomi og oppbevar dem ved -20 ° C for fremtidig bruk. For å undersøke tilstedeværelsen eller avsetningen av den ekstracellulære matrisen etter kondrogen differensiering, flekker seksjonene med Alcian Blue og Safranin-O fargestoff, som binder seg til sulfaterte glykosaminoglykaner.
      NOTAT: For å forberede Alcian Blue fargestoff, oppløs 1 g Alcian Blue fargestoff i 100 ml 0,1 N HCl og bland grundig i en reagensrørblander over natten. Løsningen kan lagres på RT i 1 måned i mørket. For å forberede Safranin-O fargestoff, oppløs 0,1 g Safranin-O fargestoff i 100 ml destillert vann og bland grundig i en reagensrørblander over natten.
    10. For Alcian Blue-farging, vask hydrogelseksjonene 1x med destillert vann i 5 minutter. For å fikse seksjonene, legg til 4% NBF i lysbildene og inkuber i 30 minutter.
    11. Vask seksjonene 1x med destillert vann i 5 minutter og deretter 2x med 0,1 N HCl i 30 s hver. Fjern HCl og tørk lysbildene forsiktig med silkepapir. Tilsett den tilberedte Alcian Blue-flekken i seksjonene og inkuber i 30 minutter ved 37 °C i et fuktet kammer.
    12. Vask det ubundne fargestoffet med 0,1 N HCl og destillert vann i 3 minutter. Dehydrer seksjonene i absolutt etanol, fjern dem i xylen, og monter til slutt de flekkete seksjonene i et harpiksholdig medium for avbildning.
    13. For Safranin-O-farging, vask hydrogelseksjonene med destillert vann 1x i 5 minutter. For å fikse seksjonene, legg til 4% NBF i lysbildene og inkuber i 30 minutter. Vask seksjonene 1x med destillert vann i 5 minutter, og dypp deretter lysbildene i 1% eddiksyre i 10-15 s. Tørk lysbildene forsiktig med silkepapir.
    14. Tilsett tilberedt Safranin-O fargestoff til seksjonene og inkuber i 10 minutter ved RT. Vask det ubundne fargestoffet med 100% etanol. Dypp lysbildene i 100% etanol i 5 min. Lufttørk lysbildene, fjern dem i xylen, og monter til slutt de flekkete seksjonene i et harpiksholdig medium for avbildning.
  3. Indusere osteogen differensiering av IFP MSCs
    1. For å indusere osteogen differensiering, trypsinisere cellene, som nevnt tidligere (trinn 2.2.). Frø cellene med en tetthet på 3 x 103 celler / cm2 i en 24-brønns vevskulturplate. Tilsett medier for å oppnå et sluttvolum på 500 μL. Dyrk cellene ved 37 °C i en 5% CO 2-inkubator. 1 dag etter såing, erstatt ekspansjonsmediet med 500 μL osteogene differensieringsmedier.
    2. Forbered osteogene medier ved å supplere ekspansjonsmedier (DMEM + 10% FBS +2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin og 25 μg / ml ciprofloxacin) med 25 mM D (+) -glukose, 10 nM dexametason, 10 mM β-glycerofosfat, 50 μg / ml 2-fosfo-L-askorbinsyre trinatriumsalt og 10 nM vitamin D3.
      MERK: Cellene dyrket i ekspansjonsmedier supplert med 25 mM D (+) glukose regnes som uinduserte kontroller.
    3. Bytt osteogene medier hver 3. dag i 14 dager eller 28 dager. På slutten av 14 dager, måle omfanget av osteogenese ved alkalisk fosfatase (ALP) farging.
      MERK: For å forberede substratet for ALP-farging, oppløs en 5-Bromo-4- Chloro-3-Indolyl Phosphate (BCIP) / Nitroblue Tetrazolium (NBT) tablett i 10 ml destillert vann i et 15 ml sentrifugerør. La tabletten oppløses helt. Substratløsningen er klar til bruk. Siden substratoppløsningen ikke kan lagres i lengre tid, basert på behov, del tabletten i to og oppløs den i 5 ml destillert vann. For å forberede permeabiliseringsbufferen, tilsett Tris-buffer (100 mM) og magnesiumklorid (5 mM) til destillert vann. Tilsett Triton X100 (0,1 %) i oppløsningen og la den løse seg opp. Juster pH i løsningen til 9,25-9,75.
    4. For ALP-farging, etter 14 dagers induksjon, fjern mediet og vask cellene med PBS. Fest cellene ved hjelp av NBF (4%) i 1 min. Vask cellene med PBS og gjennomsyre ved hjelp av den tilberedte lysisbufferen i 2-3 minutter.
    5. Tilsett 500 μL av den tilberedte substratoppløsningen til cellene og la den inkubere i 15 minutter til 1 time, avhengig av ekspresjonsnivået. Sjekk utviklingen av lilla / blå farge i mellom.
    6. Fjern underlagsløsningen og vask med destillert vann. Bilde de fargede cellene ved hjelp av et omvendt mikroskop.
    7. På slutten av 28 dager måler du omfanget av forkalkning etter osteogen induksjon ved hjelp av Alizarin Red-S-farging.
      MERK: For å klargjøre Alizarin Red-S fargeløsning (40 mM), oppløs 2 g Alizarin Red-S i 100 ml destillert vann og juster pH til 4,1-4,3 med HCl eller NH4OH. Filtrer løsningen gjennom en 0,22 μm membran og oppbevar ved 4 °C i mørket. Løsningens pH er viktig; Derfor anbefales det enten å lage en ny løsning eller å måle pH-verdien i løsningen på nytt hvis den er mer enn 1 måned gammel.
    8. For Alizarin Red-S-farging, etter 28 dagers induksjon, fjern mediet og vask cellene 1x med kald PBS. Fest cellene med 70% etanol i 1 time ved 4 °C.
    9. Fjern fikseringsmiddelet og vask cellene 2x med destillert vann. Fjern vannet helt og tilsett 1 ml Alizarin Red-S-løsning til hver brønn.
    10. Inkuber cellene med løsningen i 1 time ved RT og avbilde cellene ved hjelp av et omvendt mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av IFP-MSCs fra femorotibial ledd av geit
Trinnene som er involvert i isoleringen av IFP-MSCs fra kvelningsleddet til en geit, er avbildet i figur 1. Fettputen som var tilstede i patellens indre, ikke-artikulerende overflate, ble fjernet, hakket og enzymatisk fordøyd. IFP-MSCene ble vellykket isolert og dyrket in vitro (figur 2A).

Utvidelse og klonogen evne til IFP-MSCs
De isolerte cellene ble dyrket in vitro i ekspansjonsmedier. Cellene begynte å feste seg til vevskulturplaten innen 12 timer etter såing og var for det meste runde i form på dag 0. De var homogent festet til platen og oppnådde langstrakt morfologi innen 24 timer. Denne morfologien ble opprettholdt gjennom hele kulturens varighet. Cellene spredte seg effektivt i kultur og ble 80% -90% sammenflytende innen 6 dager etter utvidelse (figur 2A). I tillegg viste de isolerte cellene klonogen kapasitet, vurdert ved kolonidannende enhetsfibroblast (CFU-F) analyse (figur 2B). Disse resultatene indikerer at de isolerte cellene har effektive proliferative og selvfornyelsesevner in vitro.

Differensieringspotensialet til IFP-MSCs
For å karakterisere om de isolerte cellene var multipotente og hadde karakteristiske trekk ved MSCs, ble de indusert til å differensiere i flere linjer. De isolerte cellene, når de ble indusert mot adipogen avstamning, produserte lipiddråper, som det kan observeres fra lysfeltbildene (figur 3A). Dette ble videre bekreftet av oljerød O-farging på dag 14 og dag 21, noe som tyder på disse cellenes evne til å differensiere til adipocytter. På den annen side ble det ikke observert synlige oljedråper i cellene dyrket i fravær av adipogeninduserende faktorer (figur 3B,C).

For å bestemme det kondrogene potensialet til de isolerte cellene, ble cellene innkapslet i plasmahydrogel og fikk lov til å differensiere i den kondrogene linjen. Som avbildet fra bruttobildene av plasmahydrogelen (figur 4A), virket neotissue dannet etter 14 dager i den induserte gruppen hvit og blank (ligner artikulær brusk), mens den i den uinduserte gruppen var blek hvit, og redusert glans ble observert. I tillegg var cellene i den induserte gruppen i stand til å utskille en av hovedkomponentene i bruskmatrisen (dvs. sulfaterte glykosaminoglykaner), påvist ved positiv histologisk farging for Alcian Blue (figur 4B) og Safranin O (figur 4C). I motsetning til dette var hydrogelseksjonene fra de induserte gruppene negative for Safranin O og Alcian Blue-farging. Disse resultatene indikerer samlet det kondrogene differensieringspotensialet til MSC-ene kun i nærvær av kondrogene stimuli.

De isolerte cellene viste også osteogent differensieringspotensial. Etter 14 dager og 21 dager i kultur ble det ikke observert spontan mineralisering (indusert gruppe). Når mineralisering ble indusert med osteogene medier, ble mineralisering imidlertid tydelig ved positiv farging for alkalisk fosfatase (ALP) ved slutten av 14 dager (figur 5A). Etter 28 dagers dyrkning i osteogene medier ble dessuten forkalkede avsetninger visualisert ved positiv Alizarin Red-S-farging (figur 5B). Disse resultatene viser at de isolerte cellene fra geitens infrapatellar fettpute, når de induseres, har potensial til å differensiere til adipogene, kondrogene og osteogene linjer.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for isolering av IFP-MSC fra kvelningsleddet i geitekneet. Trinn 1. Samle geitekneprøven fra slakteriet og fortsett med disseksjonen i et biosikkerhetsskap; Trinn 2. Undersøk nøye vevets anatomi og fjern de omkringliggende musklene og fettvevet; Trinn 3. Uten å forstyrre leddkapselen, fjern muskler og fettvev for å fullstendig utsette både de lange beinene (lårben og tibia); Trinn 4. Lag et snitt i synoviummembranen og kutt opp bevegelegget for å eksponere patella- og trochleabrusk; Trinn 5. Fjern patellaen forsiktig fra leddleddet uten å forstyrre den infrapatellar fettputen (IFP), og hold den på en petriskål som inneholder PBS; Trinn 6. Fjern sakte hele fettputen fra patellaen og hold den i en fersk petriskål for hakking og enzymatisk fordøyelse. (a. Femur, b. Tibia, c. Patella, d. Trochlear brusk, e. Infrapatellar fettpute). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Morfologi og klonogent potensiale av IFP-MSCs . (A) Mikrografer ble tatt ved passering 3 ved hjelp av et omvendt lysfeltmikroskop ved 10x forstørrelse. Umiddelbart etter såing (dag 0) forble cellene runde i form, på dag 3 oppnådde de fleste cellene langstrakt morfologi, og på dag 6 ble IFP-MSCene 80% -90% sammenflytende (skalabar = 100 μm). (B) Representative bilder (n = 3) av CFU-F-kolonier farget med krystallfiolett fargestoff etter 12 dagers såing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Adipogen differensiering av IFP-MSCs. Det øvre panelet indikerer mikrografer av ikke-induserte IFP-MSCer, og det nedre panelet representerer IFP-MSCs indusert i den adipogene linjen. (A) Representative brightfield-bilder som viser dannelsen av lipidvakuoler under adipogenese (skalabar = 100 μm). Representative bilder av oljerød O-farging av lipiddråper på (B) dag 14 og (C) dag 21 av differensiering (skalabar = 20 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kondrogen differensiering av IFP-MSCs. Det øvre panelet indikerer hydrogelkonstruksjoner/seksjoner fra indusert hydrogel, og bunnpanelet representerer hydrogel utsatt for kondrogenese. (A) Grove bilder av plasmahydrogelkonstruksjoner etter 14 dager i kultur i fravær (ikke indusert) eller tilstedeværelse (indusert) av kondrogene medier supplert med TGF-β1. Representative bilder av 10 μm seksjoner av hydrogel farget med sGAG bindende fargestoff (B) Alcian Blue (blå) og (C) Safranin O (rød) (Scale bar = 100 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Osteogen differensiering av IFP-MSCs. Det øvre panelet indikerer uinduserte celler, og bunnpanelet indikerer celler indusert med osteogene medier. Mikrografer og representative bilder av IFP-MSCs farget med (A) BCIP-NBT (alkalisk fosfatase) etter 14 dager og (B) Alizarin Red-S (kalsiumavsetning) etter 28 dagers differensiering (skalabar = 100 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen er det gitt en enkel, pålitelig og reproduserbar metode for isolering av MSCs fra geit IFP. Celler isolert ved hjelp av denne metoden har blitt brukt med hell i våre tidligere studier for in vitro vevregenerering. Det ble observert at de isolerte cellene var proliferative, reagerte på ulike vekstfaktorer, og beholdt sin biologiske aktivitet når de ble sådd på elektrospunfibre og stillaser25,26. Videre ble det observert at et stort antall høykvalitets MSCs kan oppnås og co-dyrkes med kondrocytter i injiserbare hydrogeler for å konstruere leddbrusk in vitro27,28,29. Mens prosedyren for disseksjon og isolering av celler er enkel, er det noen få trinn som må følges nøye for vellykket isolering og utvidelse av MSCs fra IFP. For det første, siden det ikke er mulig å opprettholde virkelig aseptiske forhold mens du tar prøven fra slakteriet, anbefales det å tørke det ytre vevet med 70% etanol for å sterilisere vevet før du starter isolasjonsprosedyren. Det neste viktige trinnet er å dissekere fettputen fra kneleddet. IFP ligger under patellaen i kneleddet. Den proksimale enden av IFP er festet til den distale enden av patella30,31. Derfor blir det svært viktig å identifisere riktig plassering av patellaen mens du utfører isolasjonsprosedyren. Deretter, som IFP artikulerer med trochleabrusk i lårbenet og er dekket med synoviummembranen30,31, er det nødvendig å lage et snitt til synoviummembranen for å kutte opp kneleddet. Det er også viktig å observere den generelle helsen til den oppsamlede infrapatellar fettputen. Siden IFP består av adipocytter (celler) og fettbindevev, som kollagen og glykosaminoglykaner, blir vevet hakket og fordøyd ved hjelp av kollagenaseenzym for å frigjøre cellene 9,32. De flytende adipocyttene separeres ved sentrifugering med lav hastighet for å få en homogen kultur av MSCs. De resterende adipocytter i stromal vaskulær fraksjon må fjernes fra vevskulturplaten ved hver medieendring ved vasking av cellemonolaget med PBS før tilsetning av friske medier. Dette trinnet må fortsette til alle synlige adipocytter er fjernet. Det foreslås å reseed cellene i en ny plate etter at P0-celler når sammenløp for å kvitte seg med de resterende adipocytter, som kan ha festet seg til plateveggen og er vanskelige å fjerne. Til slutt, da geitprøvene for det meste er hentet fra et slakteri, er det vanskelig å spore geitens eksakte alder, og derfor, mens du isolerer cellene, må variasjon mellom prøver nøye observeres og dokumenteres. Det foreslås å karakterisere cellene for selvfornyelse (CFU-F), proliferasjon og differensieringspotensial etter hver isolasjon før de brukes til ulike applikasjoner og mekanistiske studier. På grunn av kravet om et stort antall celler i cellebaserte vevstekniske applikasjoner, blir kulturforholdene som letter spredning, forsinker senescens og opprettholder cellens stemthet sentralt viktig. Det ble observert at MSCs dyrket i 2-fosfo-L-askorbinsyre trinatriumsalt (PAA) og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) viste en ~ 42 ganger økning i antall sammenlignet med MSCs dyrket i bFGF alene. I tillegg reduserte sambehandling av PAA og bFGF produksjonen av reaktive oksygenarter (på grunn av deres antioksidantegenskaper) og senescens i stamceller. Bruk av PAA under in vitro-utvidelse av MSC er derfor ønskelig33.

Mens enzymatisk fordøyelse av vev er universelt ansatt og er en effektiv metode for å isolere MSCs, er bruken av enzymer som kollagenaser tidkrevende og dyrt34. I denne studien tok fullstendig fordøyelse av vevet ved hjelp av kollagenase 12-16 timer (over natten), noe som kan føre til redusert levedyktighet eller endret overflatefenotype av celler35. Derfor kan metoden videre optimaliseres for å redusere varigheten av kollagenasebehandling for vevsfordøyelse. Alternativt kan en enzymfri eksplantkulturmetode som brukes til isolering av fettavledede MSCer fra lipoaspirater eller inguinalfettputer også utforskes for isolering av IFP-MSCs34,36,37.

IFP-MSCs, på grunn av deres evne til å differensiere i kondrogene, adipogene og osteogene linjer, har bredt terapeutisk potensial. Tidligere rapporter har vist at IFP-MSCs utviser bedre kondrogent potensial enn andre stamceller 6,7,9,10. Derfor har IFP-MSCs fått interesse og anses som en bedre kandidat for cellebasert terapi for reparasjon av bruskdefekter og lindring av brusknedbrytning ved slitasjegikt. I en preklinisk studie resulterte samtidig levering av IFP-MSCs med brusk ekstracellulære matrikskomponenter gjennom intraartikulær injeksjon i økt bruskregenerering i osteokondrale defekter38. På samme måte førte intraartikulær injeksjon av IFP-MSCs i kaninartrose (OA) -modellen til en reduksjon i følgende sykdomsparametere: nedbrytning av brusk, osteofyttdannelse, subchondral beinfortykkelse og synovitt39. Videre har resultater fra en tidligere rapportert randomisert klinisk studie13 og en nylig publisert åpen fase 1 klinisk studie40 vist at intraartikulære injeksjoner av IFP-MSCs hos pasienter med kneartrose er trygge og resulterer i reduksjon av smerte og forbedring av leddfunksjon, noe som indikerer deres lovende terapeutiske potensial for å forbedre kne OA-relaterte komplikasjoner. IFP-MSCs har også vist seg å utvikle forsterkede immunmodulerende egenskaper i nærvær av proinflammatoriske signaler ved å lette nedbrytningen av en inflammatorisk regulator, Substance P (SP), noe som fører til en reduksjon i proinflammatoriske og katabolske molekyler og som en konsekvens forbedret behandling av betennelse og fibrose av synovium og IFP6 . Enda viktigere, IFP-MSCs behandlet under regulatoriske forhold viste bedre spredning, differensieringskapasitet og immunmodulerende egenskaper sammenlignet med standard in vitro-kulturforhold, noe som viser potensialet for klinisk suksess når de brukes til mesenkymal stamcelle (MSC) -basert terapi41.

Avslutningsvis beskriver denne protokollen isoleringen av infrapatellar fettpute (IFP)-avledede mesenkymale stamceller (MSCs) fra geitestifle-ledd ved enzymatisk fordøyelse og vedlikehold av dem i kultur. De isolerte cellene har proliferativt og selvfornyelsespotensial og kan differensiere til adipogene, osteogene og kondrogene linjer. IFP-MSCs er en lovende kilde til MSCs og har translasjonspotensial for regenerative medisinapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

SH anerkjenner støtte fra instituttets postdoktorstipend av IIT Kanpur og SYST-stipend fra DST (SEED Division) (SP / YO / 618/2018). AM anerkjenner Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) for et instituttstipend. DSK anerkjenner Gireesh Jankinath Chair Professorship og Institutt for bioteknologi, India, for finansiering (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). AM, SH og DSK takker Mehta Family Centre for Engineering in Medicine ved IIT-Kanpur for deres sjenerøse støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422-10G 10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA Hi-Media TCL049
15-mL centrifuge tube Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G 50 µg/mL
2-Propanol Sigma-Aldrich I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) HiMedia TCL021-50ml 10 mM
50-mL centrifuge tube Corning
Alcian Blue Hi-Media RM471 For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S S D Fine-Chem Limited 26048-25G For calcium deposition
Amphotericin B HiMedia A011 2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Sino Biologicals 10014-HNAE 5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate Sigma B5655-5TAB For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA HiMedia MB-083 Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer HiMedia TCP-182 70 µm
Centrifuge REMI
Ciprofloxacin RANBAXY LAB. Limited B17407T1 2.5 µg/mL
Crystal Violet S D Fine-Chem Limited 42555
D(+)-glucose Merck 1.94925.0521 25 mM
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915 1 µM
DMEM LG SIGMA D5523 Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol Merck 100983
FBS Gibco 10270 Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41% Merck 61780805001730
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378 100 µM
Insulin Sigma-Aldrich I9278 10 µg/mL
Inverted microscope Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1 Sigma-Aldrich I2521-5mL Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline HiMedia TO-109-25G 1 mM
Magnesium chloride Merck 61751605001730 For lysis buffer
Methanol Meck 1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) Thermoscientific
MUSE Cell analyser Merck Millipore For cell counting
OCT compound Tissue-Tek 4583 Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye S D Fine-Chem Limited 54304 For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin HiMedia A007 100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm) NEST
Safranin O S D Fine-Chem Limited 50240 For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate Sigma-Aldrich C3434 3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels For isolation of IFP-MSC
Sucrose Merck 1.94953.0521 35 % (w/v)
TGF-β1 Sino Biologicals Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 Thermoscientific
Tris buffer Merck 61771405001730 For lysis buffer
Triton X100 S D Fine-Chem Limited 40632 For lysis buffer
Type II collagenase Gibco 17101015 1.5 mg/mL
Vitamin D3 Sigma C9756-1G 10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP) NEST

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  2. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
  3. Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
  4. Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
  5. Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
  6. Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
  7. Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
  8. Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
  9. Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
  10. Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
  11. Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
  12. Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
  13. Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
  14. Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
  15. Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
  16. Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
  17. Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
  18. Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
  19. Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
  20. Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
  21. Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
  22. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
  23. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  24. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  25. Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
  26. Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
  27. Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
  28. Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
  29. Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
  30. Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
  31. Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
  32. Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
  33. Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
  34. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  35. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  36. Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
  37. Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
  38. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  39. Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
  40. Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
  41. Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).

Tags

Bioteknologi utgave 186 Geit infrapatellar fettpute (IFP) mesenkymale stamceller (MSCs) celleisolasjon cellekultur flerlinjepotensial regenerativ medisin vevsteknikk
Isolering, utvidelse og differensiering av mesenkymale stamceller fra Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahajan, A., Hazra, S., Arora, A.,… More

Mahajan, A., Hazra, S., Arora, A., Katti, D. S. Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint. J. Vis. Exp. (186), e63617, doi:10.3791/63617 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter