Summary
As células-tronco mesenquimais da almofada de gordura infrapatelar (IFP-MSCs) podem ser facilmente isoladas da almofada de gordura infrapatelar da articulação do joelho. Eles proliferam bem in vitro, formam colônias de UFC-F e se diferenciam em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas. Aqui, a metodologia para o isolamento, expansão e diferenciação de IFP-MSCs da articulação de sufocamento de cabra é fornecida.
Abstract
O IFP, presente na articulação do joelho, serve como uma fonte promissora de CTMs. O IFP é um tecido de fácil acesso, pois é rotineiramente ressecado e descartado durante procedimentos artroscópicos e cirurgias de substituição do joelho. Além disso, sua remoção está associada a morbidade mínima do local doador. Estudos recentes demonstraram que as IFP-MSCs não perdem sua capacidade de proliferação durante a expansão in vitro e têm potencial de diferenciação osteogênica independente da idade. As IFP-MSCs possuem potencial de diferenciação condrogênica superior em comparação com as MSCs derivadas da medula óssea (BMSCs) e as células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs). Embora essas células sejam facilmente obtidas de pacientes idosos e doentes, sua eficácia é limitada. Assim, o uso de IFP-MSCs de doadores saudáveis é importante para determinar sua eficácia em aplicações biomédicas. Como o acesso a um doador humano saudável é um desafio, os modelos animais podem ser uma alternativa melhor para permitir a compreensão fundamental. Animais de grande porte, como cães, cavalos, ovelhas e cabras, desempenham um papel crucial na pesquisa translacional. Entre estes, a cabra pode ser um modelo preferido, uma vez que a articulação sufocante da cabra tem a anatomia mais próxima da articulação do joelho humano. Além disso, o IFP de cabra pode atender aos números mais altos de MSC necessários para aplicações de regeneração de tecidos. Além disso, o baixo custo, a disponibilidade e a conformidade com os princípios 3R para pesquisa com animais os tornam um modelo atraente. Este estudo demonstra um protocolo simples para o isolamento de IFP-MSCs da articulação sufocante de caprinos e condições de cultura in vitro para sua expansão e diferenciação. O IFP assepticamente isolado da cabra foi lavado, picado e digerido enzimaticamente. Após filtração e centrifugação, as células coletadas foram cultivadas. Essas células eram aderentes, tinham morfologia semelhante a MSCs e demonstraram notável capacidade clonogênica. Além disso, eles se diferenciaram em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas, demonstrando sua multipotência. Em conclusão, o estudo demonstra o isolamento e a expansão das CTMs, que mostram potencial em aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (CTMs) são um candidato atraente para terapias baseadas em células em medicina regenerativa 1,2. Eles podem ser colhidos de uma variedade de fontes de tecido, como medula óssea, cordão umbilical, placenta, polpa dentária e tecido adiposo subcutâneo3. No entanto, como a disponibilidade de células-tronco em adultos é limitada e seu procedimento de isolamento é frequentemente invasivo (resultando em morbidade no local doador), é desejável ter uma fonte alternativa de células-tronco que possa contornar esses desafios.
A articulação do joelho é um depósito de vários tipos de células, como CTMs derivadas de almofadas de gordura infrapatelar, MSCs derivadas de membrana sinovial, MSCs derivadas de líquido sinovial, fibroblastos ligamentares, condrócitos articulares, etc 4,5,6. Essas células têm o potencial de serem amplamente exploradas em pesquisas baseadas em engenharia de tecidos musculoesqueléticos. Portanto, a articulação do joelho pode ser uma fonte possível e confiável de vários tipos de MSCs. O depósito adiposo localizado na articulação do joelho, conhecido como almofada de gordura infrapatelar (IFP) ou almofada de gordura de Hoffa, é uma escolha promissora e alternativa do depósito de MSC. O IFP é uma fonte de CTMs relativamente acessível e clinicamente obtida, pois é rotineiramente ressecado e descartado como resíduo cirúrgico durante a artroscopia do joelho ou a cirurgia do joelho aberto. A remoção do IFP está associada a uma morbidade mínima do local doador, o que também o torna uma fonte de tecido atraente. Apesar de apresentarem um perfil fenotípico semelhante, as CTMs de IFP (IFP-MSCs) têm maior potencial clonogênico quando comparadas com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (BM-MSCs)6 e melhor capacidade proliferativa em comparação com células-tronco derivadas de tecido adiposo subcutâneo (ADSCs)7. Curiosamente, em comparação com as MSCs derivadas do líquido sinovial (SF-MSCs), as IFP-MSCs não perdem sua capacidade proliferativa em passagens tardias, nem o tempo de duplicação aumenta em passagens tardias. Isso sugere que, durante a expansão celular, as IFP-MSCs podem alcançar um número suficientemente grande de células para aplicações de engenharia de tecidos in vitro sem comprometer sua taxa de proliferação8. Estudos recentes também têm sugerido que as IFP-MSCs possuem potencial de diferenciação condrogênica superior em comparação com as MSCs derivadas da medula óssea (BMSCs) e as MSCs derivadas de tecido adiposo (ADSCs), provavelmente devido à sua proximidade anatômica com a cartilagem articular, indicando sua adequação para a engenharia do tecido cartilaginoso 6,7,9,10. Além disso, também possuem potencial de diferenciação osteogênica independente da idade11. A injeção intra-articular de IFP-MSCs demonstrou reduzir a dor e melhorar as funções articulares do joelho em pacientes com osteoartrite (OA)12,13. Além disso, fortes respostas imunossupressoras e propriedades imunomoduladoras melhoradas de IFP-MSCs na presença de citocinas inflamatórias durante condições patológicas também foram relatadas6.
IFP-MSCs são uma fonte promissora e alternativa de MSCs; no entanto, seu benefício terapêutico na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa é relativamente menos explorado. Os estudos existentes sobre IFP-MSCs utilizaram principalmente células de doadores humanos. Dentre estes, alguns estudos recentes investigaram IFP-MSCs de doadores humanos saudáveis (pacientes não artríticos, com idade entre 17 e 60 anos)6,14, enquanto a maioria dos estudos utilizou IFP-MSCs de pacientes idosos submetidos à cirurgia de substituição total do joelho (pacientes doentes, idade 70-80 anos). Como tanto a idade quanto a doença são conhecidas por alterar o funcionamento normal das células-tronco (número reduzido e perda de potencial funcional), isso poderia levar a inconsistências no desfecho dos estudos baseados em CTM 7,15,16,17. Além disso, o uso de IFP-MSCs de pacientes com condições fisiopatológicas (por exemplo, artrite e obesidade) também apresenta dificuldade para a compreensão das características básicas das células saudáveis in vitro, atuando como um fator limitante no desenvolvimento de terapias baseadas em CTMs. Para superar esses problemas, o uso de IFP-MSCs de doadores saudáveis é vital. Como o acesso a um doador humano saudável é um desafio, os modelos animais poderiam ser uma alternativa melhor. A esse respeito, existem alguns estudos em que o IFP foi isolado de camundongos18. No entanto, devido ao pequeno tamanho da almofada de gordura em camundongos normais, tecidos adiposos de vários animais têm sido combinados para obter tecido suficiente para executar procedimentos experimentais elaborados19. Assim, há a necessidade de um modelo animal de grande porte, que pudesse atender ao requisito de maior número de células e, simultaneamente, cumprir os princípios 3R (refinar, substituir e reduzir) em pesquisas com animais20. O uso de animais de grande porte tem implicações significativas na pesquisa translacional. Especificamente, na engenharia de tecidos musculoesqueléticos, uma variedade de animais de grande porte, como cães, porcos, ovelhas, cabras e cavalos, tem sido investigada21. A cabra (Capra aegagrus hircus) é uma excelente escolha de animal de grande porte, uma vez que sua articulação sufocante tem a anatomia mais próxima da articulação do joelho humano22,23,24. A estrutura trabecular do osso subcondral e a espessura óssea subcondral dos caprinos são semelhantes às dos seres humanos, e a proporção da cartilagem em relação ao osso também é relatada como próxima aos humanos21. Além disso, as cabras foram amplamente domesticadas em todo o mundo, tornando-as facilmente disponíveis quando estão esqueleticamente maduras. Além disso, os baixos custos de manutenção e o fácil manuseio os tornaram um modelo animal atraente para a pesquisa22.
No presente estudo, é demonstrado um protocolo simples para o isolamento de IFP-MSCs da articulação sufocante de Capra aegagrus hircus (caprino) e condições de cultura in vitro para sua expansão e diferenciação. As células isoladas são aderentes, têm morfologia semelhante à MSC, formam colônias CFU-F (unidade formadora de colônias-fibroblastos) e possuem potencial de diferenciação adipogênica, condrogênica e osteogênica. Portanto, os IFP-MSCs mostram potencial como uma fonte alternativa de MSCs para aplicações biomédicas.
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Protocol
O protocolo baseia-se no isolamento de IFP-MSCs de cabras. IFP de cabra e sangue foram coletados de um matadouro local. Uma vez que tais coleções de tecidos estão fora da alçada de um Comitê Institucional de Ética Animal, a aprovação ética não era necessária.
1. Isolamento de IFP-MSCs da articulação femorotibial do joelho caprino
- Coletar articulação femorotibial caprina (amostra) abrangendo ~15 cm cada uma das regiões femoral e tibial dos membros posteriores. Colocar imediatamente a amostra numa caixa de recolha de amostras esterilizada e armazená-la a 4 °C para transporte para o laboratório para posterior transformação. Processar as amostras assepticamente em um armário de biossegurança, utilizando ferramentas cirúrgicas esterilizadas durante todo o procedimento (Figura 1, Etapa 1).
- Coloque a amostra em uma placa de Petri de 150 mm e enxágue bem com solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS) suplementada com antibióticos (5 μg/mL de anfotericina B, 200 U/mL de penicilina-estreptomicina e 50 μg/mL de ciprofloxacina) para evitar a contaminação. Certifique-se sempre de que a amostra é mantida hidratada usando PBS.
- Examine cuidadosamente as regiões anatômicas da amostra. Para facilitar o acesso à cápsula articular, certifique-se de que os tecidos extras de ambos os ossos longos sejam completamente removidos (Figura 1, Etapa 2).
- Para conseguir isso, primeiro, segure a superfície final do osso do fêmur com uma mão e, com uma tesoura afiada, corte longitudinalmente em direção à articulação. Remova os músculos circundantes e o tecido adiposo do osso durante o processo. Tenha cuidado para que o tecido ao redor da cápsula articular imediata permaneça inalterado inicialmente.
- Da mesma forma, faça outra incisão na extremidade tibial da amostra e remova os músculos e o tecido adiposo do osso tibial. Certifique-se de que ambos os ossos longos estejam completamente expostos e que a cápsula articular esteja claramente visível após esta etapa (Figura 1, Etapa 3).
- Em seguida, faça uma incisão de ambos os lados da membrana da sinóvia para abrir a articulação articular (Figura 1, Passo 4). Corte a patela da membrana da sinóvia e dos ligamentos patelares usando um novo lote de tesouras e fórceps esterilizados. Mantenha imediatamente a patela separada em uma placa de Petri contendo PBS (Figura 1, Passo 5).
- Remova toda a almofada de gordura presente na superfície interna da patela usando tesoura e pinça e colete a almofada de gordura em outra placa de Petri fresca (Figura 1, Passo 6). Pique a almofada de gordura coletada usando um bisturi. Inclua outras ferramentas cirúrgicas (por exemplo, tesouras ou lâminas cirúrgicas), conforme necessário, para obter as menores peças/segmentos de gordura possíveis de ~2-3 mm.
NOTA: Uma boa picagem é fundamental para resultar em um bom rendimento de células. Mantenha sempre o tecido hidratado e não o deixe secar em nenhuma fase do procedimento de isolamento. - Transfira o tecido picado usando uma espátula para um tubo de centrífuga de 50 mL e lave-o com PBS suplementado com antibióticos à temperatura ambiente (RT) por 15 min em um misturador de tubo de ensaio. Repita o passo de lavagem 3x, 15 min cada.
- Para digestão enzimática, incubar o tecido picado (~5 g) em Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM low glucose) contendo 1,5 mg/mL de colagenase tipo II (20 mL) e suplementado com 2% de FBS a 37 °C por 12-16 h.
NOTA: Efectuar a digestão num misturador de tubo de ensaio a ~15 rotações por minuto (RPM). - Aspirar cuidadosamente o tecido digerido e filtrá-lo através de um filtro celular (70 μm) para remover qualquer tecido não digerido. Centrifugar o filtrado num tubo de centrifugação de 15 ml a 150 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e lave o pellet com DMEM de glicose baixa pelo menos 2x.
NOTA: Despeje o tecido digerido lentamente no coador para evitar o derramamento. Use um tubo de centrífuga de baixo volume (15 mL) para obter um bom pellet. - Ressuspender o pellet celular obtido em meio DMEM completo (DMEM de baixa glicose suplementada com FBS a 10% e antibióticos [2,5 μg/mL de anfotericina, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e 25 μg/mL de ciprofloxacina]), referidos como meios de expansão no protocolo nas etapas subsequentes.
- Semar as células em placas de Petri de 150 mm e cultivá-las no meio de expansão suplementado com 5 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básicos (bFGF) e 50 μg/mL de sal trissódico de ácido 2-fosfo-L-ascórbico. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% para permitir que as células adiram e proliferem. Monitore a fixação e o crescimento das células diariamente.
2. Manutenção e expansão de células isoladas
- Mude a mídia a cada 3 dias até que as células se tornem confluentes. Adicione 5 ng/mL bFGF frescos e 50 μg/mL de sal trissódico de ácido 2-fosfo-L-ascórbico diretamente à placa de Petri toda vez que o meio for trocado. Depois que as células se tornarem 80%-90% confluentes, subcultura as células.
Observação : remova as entidades não aderentes durante cada alteração de mídia. Caso as gotículas de óleo sejam vistas após 3 dias de incubação, lave as células com PBS 1x e, em seguida, adicione meios frescos à placa de Petri. Continue com a lavagem PBS antes de cada troca de meio até que as gotículas de óleo sejam completamente removidas. - Subcultura de células: Remova o meio de expansão da placa de Petri e lave as células 1x com PBS. Adicionar 4 mL de tripsina/EDTA a 0,25% ao prato e incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% por 4 min.
NOTA: A confluência (80%-90%) é alcançada dentro de 7 dias. Distribuir uniformemente a solução de tripsina/EDTA por toda a superfície da placa de Petri durante a tripsinização. - Desaloje as células batendo na placa do lado e observando sob um microscópio para confirmar que todas as células estão separadas. Neutralizar a tripsina após a adição de um volume igual (4 mL) de meios de expansão.
- Coletar as células dissociadas usando uma pipeta em um tubo fresco de polipropileno de 15 mL e centrífuga a 150 x g por 5 min no RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume desejado do meio de expansão.
- Contar as células utilizando o método padrão de contagem celular e subcultura em placas de Petri de 150 mm a uma densidade de semeadura de 1 x 104 células/cm2 para posterior expansão. Para todos os ensaios, use uma monocamada confluente de células de número de passagem P2-P5.
NOTA: Criopreservar o excesso de células.
3. Avaliação da capacidade clonogênica de IFP-MSCs utilizando ensaio formador de colônias (UFC-F)
- Para o ensaio de UFC-F, semear as células em meios de expansão em uma placa de cultura de tecido de 6 poços a uma densidade de semeadura de 50-100 células/cm2. Adicionar meio para obter um volume final de 3 mL.
NOTA: Otimizar a concentração celular para ensaios e tratamento. - Cultivar as células durante 12 dias a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% em condições de cultura padrão para permitir que as células formem colónias. Mude a mídia a cada 3 dias. Seja gentil ao mudar a mídia.
- Após 12 dias, enxaguar as colônias 1x com PBS e fixá-las usando metanol a 20% por 20 min no RT. Manchar as colônias com corante violeta cristal (0,5% [p/v] em metanol a 20%) por 20 min no RT. Conte as colônias individuais usando um microscópio invertido.
NOTA: Uma colônia é definida como um aglomerado de mais de 50 células.
4. Potencial de diferenciação dos IFP-MSC
- Induzindo diferenciação adipogênica de IFP-MSCs
- Para induzir a adipogênese, semeie as células a uma densidade de 25 x 103 células/cm2 em uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Adicionar meio para obter um volume final de 500 μL. Cultive as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%.
- Um dia após a confluência, substitua o meio de expansão por 500 μL de meio de diferenciação adipogênica. Requer aproximadamente 2 dias para que as células atinjam a confluência.
- Preparar o meio de diferenciação adipogênica suplementando o meio de expansão (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/mL de anfotericina, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e 25 μg/mL de ciprofloxacina) com 25 mM D (+)-glicose, 10 μg/mL de insulina, 1 μM de dexametasona e 100 μM de indometacina.
NOTA: O meio de diferenciação é instável a 4 °C após 1 mês; portanto, prepare a mídia como e quando necessário. - Considere as células cultivadas no meio de expansão suplementadas com glicose 25 mM D (+) como controles não induzidos. Mude a mídia a cada 3 dias durante 14 dias. No final dos 14 dias, lave as células 1x com PBS. Fixar as células utilizando formalina tamponada neutra (NBF; formaldeído a 4 % em PBS) durante 15 minutos a 4 °C.
- Após a fixação, lavar os poços 1x com água destilada e, em seguida, incubar as células com 60% de isopropanol por 5 min no RT. Após a remoção do isopropanol, core as gotículas lipídicas incubando as células com 500 μL da solução de trabalho do corante Oil Red O por 5 min no RT. Lave os poços 1x com água destilada para remover o corante não ligado e fotografe as células usando um microscópio invertido.
NOTA: Preparar a solução-mãe de Oil Red O (ORO) dissolvendo 300 mg de ORO em 100 ml de isopropanol a 99%. Para preparar a solução de trabalho, misture três partes de ORO de estoque e duas partes de água destilada e deixe misturar em RT por 10 min. Filtrar a mistura com papel de filtro de 0,2 μm. A solução de trabalho está pronta para uso. A solução-mãe pode ser preparada e armazenada no RT durante 1 mês no escuro, enquanto a solução de trabalho tem de ser preparada na hora antes de cada utilização/coloração.
- Indução da diferenciação condrogênica de MSCs IFP
- Isolamento do plasma de cabra:
- Preparar 3,4% (p/v) de citrato de sódio em água destilada. Adicionar 5 ml da solução preparada de citrato de sódio a um tubo de centrífuga de 50 ml.
- Recolher 45 ml de sangue de cabra recém-isolado no mesmo tubo. Incline imediatamente o tubo para misturar o sangue com citrato de sódio completamente para evitar a coagulação e transportá-lo para o laboratório a 4 °C.
- Centrifugar o sangue de cabra recolhido a 1000 x g durante 20 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante (plasma) para um tubo fresco dentro de um gabinete de biossegurança. Filtrar o plasma através de filtros de 0,2 μm, alíquota e conservar a -20 °C para posterior utilização.
NOTA: Manter a temperatura de 2-8 °C durante o manuseamento das amostras. É importante minimizar os ciclos de congelamento-descongelamento do plasma.
- Cultive as células expandidas para 80%-90% de confluência, dissociar as células usando solução de tripsina/EDTA e pellet para baixo as células a 150 x g por 5 min em um tubo de centrífuga de 15 mL. Ressuspender o pellet no plasma de cabra a uma densidade de 2 x 106 células por 50 μL de solução plasmática.
- Adicionar uma gota de células contendo plasma (50 μL) a uma placa de Petri esterilizada de 90 mm e, em seguida, adicionar cloreto de cálcio a uma concentração final de 0,3% (p/v). Misture bem para fabricar hidrogel de plasma reticulado.
- Incubar o hidrogel fabricado a 37 °C durante 40 min. Após a incubação, transfira os hidrogéis para placas de cultura de tecidos de 24 poços contendo meios condrogênicos.
- Preparar meios condrogénicos suplementando DMEM de glicose baixa com 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico (HEPES), 1,25 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA), 1 mM de prolina, 50 μg/ml de sal trissódico de ácido 2-fosfo-L-ascórbico, 100 nM de dexametasona, 1x insulina, transferrina, selenito de sódio + linoleico-BSA (ITS+1), antibióticos (2,5 μg/ml de anfotericina, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina e 25 μg/ml de ciprofloxacina), e fator transformador de crescimento de 10 ng/mL- β1 (TGF-β1).
- Os hidrogéis cultivados em meio DMEM completo (DMEM de baixa glicose com 10% de FBS e antibióticos [2,5 μg/mL de anfotericina, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e 25 μg/mL de ciprofloxacina]) sem TGF-β1 são considerados controles não induzidos. Mude a mídia a cada 3 dias durante 14 dias.
- Após 14 dias de diferenciação condrogênica das células em hidrogéis plasmáticos, lavar os hidrogéis com PBS 3x por 5 min cada e, em seguida, fixar as amostras em NBF por 3 h.
CUIDADO: O formaldeído é um potencial carcinógeno e pode causar irritação no nariz, garganta e pulmões após a inalação. Realizar todos os procedimentos relacionados ao formaldeído em um exaustor. - Remover o NBF, lavar os hidrogéis com PBS 3x durante 5 min cada e, em seguida, incubar em sacarose a 35% (p/v) no RT durante a noite para permitir que a solução seja completamente absorvida pelas amostras. Aclimatar os hidrogéis em composto de temperatura de corte ideal (OCT) por 3 h. Incorpore as amostras em composto OCT usando moldes de silicone sob nitrogênio líquido.
- Cortar as amostras a uma espessura de 10-12 μm em lâminas de vidro revestidas de gelatina utilizando um criótomo e armazená-las a -20 °C para utilização futura. Para examinar a presença ou deposição da matriz extracelular após diferenciação condrogênica, core as seções com corante Alcian Blue e Safranin-O, que se ligam a glicosaminoglicanos sulfatados.
NOTA: Para preparar o corante Alcian Blue, dissolver 1 g de corante Alcian Blue em 100 mL de HCl 0,1 N e misturar completamente em um misturador de tubo de ensaio durante a noite. A solução pode ser armazenada em RT por 1 mês no escuro. Para preparar o corante Safranin-O, dissolver 0,1 g de corante Safranin-O em 100 mL de água destilada e misturar completamente em um misturador de tubo de ensaio durante a noite. - Para a coloração Alcian Blue, lave as seções de hidrogel 1x com água destilada por 5 min. Para fixar as seções, adicione 4% de NBF às lâminas e incube por 30 min.
- Lave as seções 1x com água destilada por 5 min e depois 2x com HCl 0,1 N por 30 s cada. Retire o HCl e seque suavemente as lâminas com papel de seda. Adicionar a mancha Alcian Blue preparada às secções e incubar durante 30 minutos a 37 °C numa câmara humidificada.
- Lave o corante não ligado com HCl 0,1 N e, em seguida, distille água por 3 min. Desidrate as seções em etanol absoluto, limpe-as em xileno e, finalmente, monte as seções coradas em um meio resinoso para imagem.
- Para a coloração Safranin-O, lave as seções de hidrogel com água destilada 1x por 5 min. Para fixar as seções, adicione 4% de NBF às lâminas e incube por 30 min. Lave as seções 1x com água destilada por 5 min e, em seguida, mergulhe as lâminas em ácido acético a 1% por 10-15 s. Seque as lâminas suavemente com papel de seda.
- Adicionar o corante Safranin-O preparado às seções e incubar por 10 min no RT. Lave o corante não ligado com etanol a 100%. Mergulhe as lâminas em etanol a 100% por 5 min. Seque as lâminas ao ar, limpe-as em xileno e, finalmente, monte as seções coradas em um meio resinoso para imagens.
- Isolamento do plasma de cabra:
- Induzindo diferenciação osteogênica de MSCs IFP
- Para induzir a diferenciação osteogênica, tripsinize as células, como dito anteriormente (Etapa 2.2.). Semeia as células a uma densidade de 3 x 103 células/cm2 em uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Adicionar meio para obter um volume final de 500 μL. Cultive as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%. 1 dia após a semeadura, substitua o meio de expansão por um meio de diferenciação osteogênica de 500 μL.
- Preparar o meio osteogênico suplementando o meio de expansão (DMEM + 10% FBS +2,5 μg/mL de anfotericina, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e 25 μg/mL de ciprofloxacina) com 25 mM D (+)-glicose, 10 nM de dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL de sal trissódico ácido 2-fosfo-L-ascórbico e 10 nM de vitamina D3.
NOTA: As células cultivadas em meios de expansão suplementados com glicose 25 mM D (+) são consideradas controles não induzidos. - Mude o meio osteogênico a cada 3 dias por 14 dias ou 28 dias. Ao final de 14 dias, meça a extensão da osteogênese pela coloração da fosfatase alcalina (ALP).
NOTA: Para preparar o substrato para a coloração ALP, dissolver um comprimido de 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolyl Fosfato (BCIP)/Tetrazólio Nitroazul (NBT) em 10 mL de água destilada em um tubo de centrífuga de 15 mL. Deixe o comprimido dissolver-se completamente. A solução do substrato está pronta para uso. Como a solução de substrato não pode ser armazenada por um período mais longo, com base na necessidade, quebre o comprimido ao meio e dissolva-o em 5 mL de água destilada. Para preparar o tampão de permeabilização, adicione tampão Tris (100 mM) e cloreto de magnésio (5 mM) à água destilada. Adicione Triton X100 (0,1%) à solução e deixe-a dissolver. Ajuste o pH da solução para 9,25-9,75. - Para coloração ALP, após 14 dias de indução, remova o meio e lave as células com PBS. Corrija as células usando NBF (4%) por 1 min. Lave as células com PBS e permeie usando o tampão de lise preparado por 2-3 min.
- Adicionar 500 μL da solução de substrato preparada às células e deixar incubar durante 15 min a 1 h, dependendo do nível de expressão. Verifique o desenvolvimento da cor roxa / azul no meio.
- Retire a solução do substrato e lave com água destilada. Fotografe as células coradas usando um microscópio invertido.
- Ao final de 28 dias, medir a extensão da calcificação após indução osteogênica pela coloração Alizarin Red-S.
NOTA: Para preparar a solução de coloração Alizarin Red-S (40 mM), dissolver 2 g de Alizarin Red-S em 100 mL de água destilada e ajustar o pH para 4,1-4,3 com HCl ou NH4OH. Filtrar a solução através de uma membrana de 0,22 μm e conservar a 4 °C no escuro. O pH da solução é importante; portanto, recomenda-se fazer uma solução fresca ou remedir o pH da solução se ela tiver mais de 1 mês de idade. - Para a coloração Alizarin Red-S, após 28 dias de indução, remova o meio e lave as células 1x com PBS frio. Fixar as células utilizando etanol a 70% durante 1 h a 4 °C.
- Retire o fixador e lave as células 2x com água destilada. Retire completamente a água e adicione 1 mL de solução de Alizarin Red-S a cada poço.
- Incubar as células com a solução por 1 h no RT e visualizar as células usando um microscópio invertido.
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Representative Results
Isolamento de IFP-MSCs da articulação femorotibial de caprinos
As etapas envolvidas no isolamento das IFP-MSCs da articulação sufocante de uma cabra estão representadas na Figura 1. A almofada de gordura presente na superfície interna não articulada da patela foi removida, picada e digerida enzimaticamente. As IFP-MSCs foram isoladas e cultivadas in vitro com sucesso (Figura 2A).
Expansão e capacidade clonogênica de IFP-MSCs
As células isoladas foram cultivadas in vitro em meio de expansão. As células começaram a aderir à placa de cultura de tecidos dentro de 12 h após a semeadura e eram em sua maioria de forma redonda no dia 0. Eles foram homogeneamente aderentes à placa e atingiram morfologia alongada dentro de 24 h. Essa morfologia foi mantida durante toda a duração da cultura. As células proliferaram eficientemente em cultura e tornaram-se 80%-90% confluentes em 6 dias após a expansão (Figura 2A). Além disso, as células isoladas apresentaram capacidade clonogênica, avaliada pelo ensaio de fibroblasto unitário formador de colônias (UFC-F) (Figura 2B). Esses resultados indicam que as células isoladas possuem capacidades proliferativas e de auto-renovação eficientes in vitro.
Potencial de diferenciação dos IFP-MSCs
Para caracterizar se as células isoladas eram multipotentes e possuíam características das CTMs, elas foram induzidas a se diferenciar em múltiplas linhagens. As células isoladas, quando induzidas à linhagem adipogênica, produziram gotículas lipídicas, como pode ser observado a partir das imagens de campo brilhante (Figura 3A). Isso foi confirmado ainda mais pela coloração Oil Red O no dia 14 e no dia 21, sugerindo a capacidade dessas células de se diferenciarem em adipócitos. Por outro lado, não foram observadas gotículas de óleo visíveis nas células cultivadas na ausência de fatores indutores de adipogenia (Figura 3B,C).
Para determinar o potencial condrogênico das células isoladas, as células foram encapsuladas em hidrogel plasmático e foram autorizadas a se diferenciar na linhagem condrogênica. Conforme ilustrado a partir das imagens macroscópicas do hidrogel plasmático (Figura 4A), o neotecido formado após 14 dias no grupo induzido mostrou-se branco e brilhante (semelhante à cartilagem articular), enquanto no grupo não induzido, era branco pálido e observou-se brilho reduzido. Além disso, as células do grupo induzido foram capazes de secretar um dos principais componentes da matriz cartilaginosa (isto é, glicosaminoglicanos sulfatados), evidenciado pela coloração histológica positiva para Alcian Blue (Figura 4B) e Safranin O (Figura 4C). Em contraste, as seções de hidrogel dos grupos não induzidos foram negativas para as colorações Safranin O e Alcian Blue. Esses resultados indicam coletivamente o potencial de diferenciação condrogênica das CTMs apenas na presença de estímulos condrogênicos.
As células isoladas também demonstraram potencial de diferenciação osteogênica. Após 14 dias e 21 dias em cultura, não foi observada mineralização espontânea (grupo não induzido). Entretanto, quando induzida com meio osteogênico, a mineralização ficou evidente pela coloração positiva para fosfatase alcalina (ALP) ao final de 14 dias (Figura 5A). Além disso, após 28 dias de cultura em meio osteogênico, as deposições calcificadas foram visualizadas pela coloração positiva de Alizarin Red-S (Figura 5B). Esses resultados demonstram que as células isoladas da almofada de gordura infrapatelar de cabra, quando induzidas, têm o potencial de se diferenciar em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas.
Figura 1: Esquema para o isolamento do IFP-MSC da articulação sufocante do joelho caprino. Passo 1. Recolher a amostra de joelho de cabra do matadouro e proceder à dissecação num armário de biossegurança; Passo 2. Examine cuidadosamente a anatomia do tecido e remova os músculos circundantes e o tecido adiposo; Passo 3. Sem perturbar a cápsula articular, remova os músculos e os tecidos adiposos para expor completamente os ossos longos (fêmur e tíbia); Passo 4. Faça uma incisão na membrana da sinóvia e abra a articulação para expor a patela e a cartilagem troclear; Passo 5. Remova a patela da articulação articulada com cuidado, sem perturbar a almofada de gordura infrapatelar (IFP), e mantenha-a em uma placa de Petri contendo PBS; Passo 6. Retire lentamente toda a almofada de gordura da patela e mantenha-a em uma placa de Petri fresca para picar e digestão enzimática. (a. Fêmur, b. Tíbia, c. Patela, d. Cartilagem troclear, e. Almofada de gordura infrapatelar). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia e potencial clonogênico de IFP-MSCs . (A) As micrografias foram realizadas na passagem 3 usando um microscópio de campo brilhante invertido com ampliação de 10x. Imediatamente após a semeadura (dia 0), as células permaneceram em forma redonda, no dia 3 a maioria das células atingiu morfologia alongada, e no dia 6 as IFP-MSCs tornaram-se 80%-90% confluentes (Barra de escala = 100 μm). (B) Figuras representativas (n = 3) de colônias de UFC-F coradas com corante violeta cristal após 12 dias de semeadura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diferenciação adipogênica de IFP-MSCs. O painel superior indica micrografias de IFP-MSCs não induzidas, e o painel inferior representa IFP-MSCs induzidas na linhagem adipogênica. (A) Imagens representativas de campos brilhantes mostrando a formação de vacúolos lipídicos durante a adipogênese (Barra de escala = 100 μm). Imagens representativas da coloração Oil Red O de gotículas lipídicas no (B) dia 14 e (C) dia 21 de diferenciação (Scale bar = 20 μm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diferenciação condrogênica de IFP-MSCs. O painel superior indica construções/seções de hidrogel não induzido e o painel inferior representa hidrogel submetido à condrogênese. (A) Imagens macroscópicas de construções de hidrogel plasmático após 14 dias em cultura na ausência (não induzida) ou presença (induzida) de meio condrogênico suplementado com TGF-β1. Imagens representativas de seções de 10 μm de hidrogel coradas com corante de ligação sGAG (B) Azul Alciano (azul) e (C) Safranina O (vermelho) (Barra de escala = 100 μm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Diferenciação osteogênica de IFP-MSCs. O painel superior indica células não induzidas e o painel inferior indica células induzidas com meios osteogênicos. Micrografias e imagens representativas de IFP-MSCs coradas com (A) BCIP-NBT (fosfatase alcalina) após 14 dias e (B) Alizarina Red-S (deposição de cálcio) após 28 dias de diferenciação (Barra de escala = 100 μm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No presente protocolo, um método simples, confiável e reprodutível para o isolamento de CTMs do IFP caprino foi fornecido. Células isoladas usando este método foram usadas com sucesso em nossos estudos anteriores para regeneração tecidual in vitro. Observou-se que as células isoladas eram proliferativas, respondiam a diversos fatores de crescimento e mantinham sua atividade biológica quando semeadas em fibras eletrofiadas e andaimes25,26. Além disso, observou-se que um grande número de CTMs de alta qualidade pode ser obtido e co-cultivado com condrócitos em hidrogéis injetáveis para engenharia de cartilagem articular in vitro27,28,29. Embora o procedimento para a dissecção e isolamento de células seja simples, existem algumas etapas que precisam ser cuidadosamente seguidas para o isolamento e expansão bem-sucedidos das MSCs do IFP. Em primeiro lugar, uma vez que não é possível manter condições verdadeiramente assépticas ao trazer a amostra do matadouro, é aconselhável limpar o tecido externo com etanol a 70% para esterilizar o tecido antes de iniciar o procedimento de isolamento. O próximo passo importante é dissecar a almofada de gordura da articulação do joelho. O IFP está localizado abaixo da patela na articulação do joelho. A extremidade proximal do FIP está ligada à extremidade distal da patela30,31. Assim, torna-se muito importante identificar a localização correta da patela durante a realização do procedimento de isolamento. Em seguida, como a IFP se articula com a cartilagem troclear no fêmur e é coberta com a membrana da sinóvia30,31, é necessária uma incisão na membrana da sinóvia para abrir a articulação do joelho. Também é crucial observar a saúde geral da almofada de gordura infrapatelar coletada. Como o IFP é composto por adipócitos (células) e tecido adiposo conjuntivo, como colágeno e glicosaminoglicanos, o tecido é picado e digerido utilizando a enzima colagenase para liberar as células 9,32. Os adipócitos flutuantes são separados por centrifugação a uma velocidade lenta para ter uma cultura homogênea de CTMs. Os adipócitos restantes na fração vascular estromal devem ser removidos da placa de cultura de tecidos a cada troca de meio, lavando a monocamada celular com PBS antes de adicionar novos meios. Esta etapa precisa ser continuada até que todos os adipócitos visíveis sejam removidos. Sugere-se replantar as células em uma nova placa depois que as células P0 atingirem a confluência para se livrar dos adipócitos restantes, que podem ter aderido à parede da placa e são difíceis de remover. Finalmente, como as amostras de cabra são obtidas principalmente de um matadouro, é difícil rastrear a idade exata da cabra e, portanto, ao isolar as células, a variação entre as amostras precisa ser cuidadosamente observada e documentada. Sugere-se caracterizar as células para auto-renovação (UFC-F), proliferação e potencial de diferenciação após cada isolamento antes de serem utilizadas para diversas aplicações e estudos mecanicistas. Devido à necessidade de um grande número de células em aplicações de engenharia de tecidos baseadas em células, as condições de cultura que facilitam a proliferação, retardam a senescência e mantêm a estaminidade das células tornam-se de importância central. Observou-se que as CTMs cultivadas em sal trissódico de ácido 2-Fosfo-L-ascórbico (PAA) e fator de crescimento de fibroblastos básicos (bFGF) mostraram um aumento de ~42 vezes em seus números em comparação com as CTMs cultivadas apenas em bFGF. Além disso, o co-tratamento de PAA e bFGF reduziu a produção de espécies reativas de oxigênio (devido às suas propriedades antioxidantes) e a senescência em células-tronco. Portanto, o uso de PAA durante a expansão in vitro de CTMs é desejável33.
Embora a digestão enzimática dos tecidos seja universalmente empregada e seja um método eficiente para isolar CTMs, o uso de enzimas como as colagenases é demorado e caro34. No presente estudo, a digestão completa do tecido utilizando colagenase levou de 12 a 16 h (durante a noite), o que pode levar a uma diminuição da viabilidade ou alteração do fenótipo superficial das células35. Assim, o método pode ainda ser otimizado para reduzir a duração do tratamento com colagenase para a digestão dos tecidos. Alternativamente, um método de cultura de explante livre de enzimas que é usado para o isolamento de MSCs derivadas de tecido adiposo de lipoaspirados ou almofadas de gordura inguinal também pode ser explorado para o isolamento de IFP-MSCs34,36,37.
IFP-MSCs, devido à sua capacidade de se diferenciar em linhagens condrogênicas, adipogênicas e osteogênicas, possuem amplo potencial terapêutico. Relatos prévios demonstraram que as IFP-MSCs apresentam melhor potencial condrogênico do que outras células-tronco 6,7,9,10. Assim, as IFP-MSCs ganharam interesse e são consideradas um melhor candidato para a terapia baseada em células para o reparo de defeitos da cartilagem e aliviar a degradação da cartilagem na osteoartrite. Em um estudo pré-clínico, a coadministração de IFP-MSCs com componentes da matriz extracelular cartilaginosa por injeção intra-articular resultou em maior regeneração da cartilagem em defeitos osteocondrais38. Da mesma forma, a injeção intra-articular de IFP-MSCs no modelo de osteoartrite (OA) de coelho levou a uma diminuição nos seguintes parâmetros da doença: degradação da cartilagem, formação de osteófitos, espessamento ósseo subcondral e sinovite39. Além disso, os resultados de um ensaio clínico randomizado previamente relatado13 e de um ensaio clínico de fase 1 de nível aberto40 recentemente publicado demonstraram que as injeções intra-articulares de IFP-MSCs em pacientes com osteoartrite do joelho são seguras e resultam na redução da dor e melhora da função articular, indicando seu promissor potencial terapêutico na melhoria das complicações relacionadas à OA do joelho. IFP-MSCs também demonstraram desenvolver propriedades imunomoduladoras aumentadas na presença de pistas pró-inflamatórias, facilitando a degradação de um regulador inflamatório, a Substância P (SP), levando a uma redução nas moléculas pró-inflamatórias e catabólicas e, como consequência, melhor tratamento da inflamação e fibrose da sinóvia e IFP6 . Mais importante ainda, as IFP-MSCs processadas em condições de conformidade regulatória apresentaram melhor proliferação, capacidade de diferenciação e propriedades imunomoduladoras em comparação com as condições padrão de cultura in vitro, o que demonstra seu potencial de sucesso clínico quando usadas para terapia baseada em células-tronco mesenquimais (CTM)41.
Em conclusão, o presente protocolo descreve o isolamento de células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas da almofada de gordura infrapatelar (IFP) da articulação sufocante de caprinos por digestão enzimática e sua manutenção em cultura. As células isoladas têm potencial proliferativo e de auto-renovação e podem se diferenciar em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. As IFP-MSCs são uma fonte promissora de MSCs e têm potencial translacional para aplicações de medicina regenerativa.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
A SH reconhece o apoio da Bolsa de Pós-Doutorado do Instituto do IIT Kanpur e a bolsa SYST da DST (Divisão SEED) (SP/YO/618/2018). A AM reconhece o Instituto Indiano de Tecnologia-Kanpur (IIT-Kanpur) por uma bolsa do Instituto. A DSK reconhece a cátedra Gireesh Jankinath e o Departamento de Biotecnologia, Índia, para financiamento (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH e DSK agradecem ao Mehta Family Centre for Engineering in Medicine no IIT-Kanpur por seu generoso apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
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