Summary
Denne protokol beskriver isoleringen af dobbelt-negative thymocytter fra musethymus efterfulgt af retroviral transduktion og co-kultur på det deltalignende 4-ekspressive knoglemarvstromale cellelinje-cokultursystem (OP9-DL4) til yderligere funktionel analyse.
Abstract
Transduced mus umodne thymocytter kan differentieres til T-celler in vitro ved hjælp af det delta-lignende 4-udtrykker knoglemarv stromale cellelinje co-kultur system (OP9-DL4). Da retroviral transduktion kræver opdeling af celler til transgenintegration, giver OP9-DL4 et passende in vitro-miljø til dyrkning af hæmatopoietiske stamceller. Dette er især fordelagtigt, når man studerer virkningerne af ekspressionen af et specifikt gen under normal T-celleudvikling og leukenese, da det giver forskere mulighed for at omgå den tidskrævende proces med at generere transgene mus. For at opnå vellykkede resultater skal en række koordinerede trin, der involverer samtidig manipulation af forskellige typer celler, udføres omhyggeligt. Selvom disse er meget veletablerede procedurer, betyder manglen på en fælles kilde i litteraturen ofte, at der kræves en række optimeringer, hvilket kan være tidskrævende. Denne protokol har vist sig at være effektiv til transducering af primære thymocytter efterfulgt af differentiering på OP9-DL4-celler. Detaljeret her er en protokol, der kan tjene som en hurtig og optimeret vejledning til co-kultur af retroviralt transducerede thymocytter på OP9-DL4 stromale celler.
Introduction
OP9 knoglemarv stromal cellelinje giver et nyttigt in vitro system til induktion af lymfopoiesis fra flere kilder til forfædre1. De første undersøgelser, der brugte OP9-celler, viste, at manglen på makrofagkolonistimulerende faktor (MCSF) ekspression bidrog til OP9-cellelinjens evne til at understøtte hæmatopoiesis og B-celledifferentiering fra knoglemarvsafledte hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), som senere også blev vist for embryonale stamceller (ESC'er)2,3,4,5 . I tidligere undersøgelser muliggjorde genereringen af delta-lignende 1/4-ekspressive OP9-celler (OP9-DL1 / OP9-DL4) induktion af T-celleafstamningsforpligtelse6 og demonstrerede evnen til med succes at rekapitulere thymisk modning 7,8. Kort fortalt er T-celleudvikling blevet beskrevet ved sekventiel ekspression af CD4- og CD8-molekyler. Umodne thymocytter er "dobbeltnegative" (DN, CD4− CD8−) og kan yderligere opdeles i henhold til overfladeekspressionen af CD44 og CD25. DN-thymocytter differentierer gennem det umodne enkeltpositive (ISP) stadium, karakteriseret ved CD8-ekspression hos mus og CD4 hos mennesker, efterfulgt af det dobbeltpositive (DP) stadium, karakteriseret ved co-ekspression af CD4 og CD8, og endelig det modne enkeltpositive stadium, karakteriseret ved ekspressionen af CD4 eller CD89. HSC'er udtrykker Notch1-receptoren, som normalt interagerer med den deltalignende 4 (DL4) udtrykt på thymiske epitelceller for at inducere T-afstamningsdifferentiering10. Derfor er interessen for OP9-DL1/4-modellen gradvist steget, hvilket har ført til den omfattende anvendelse af denne tilgang i en lang række applikationer i de sidste to årtier 8,11,12,13. Selvom DL1 og DL4 begge er i stand til at understøtte T-celledifferentiering in vitro, viser de differentielle krav in vivo, og nogle få undersøgelser har antydet, at OP9_DL4 er mere effektivt end OP9_DL1 til at rekapitulere musethymisk miljø 7,14.
Blandt de potentielle anvendelser af OP9-DL1/4-systemet er der særlig interesse for kombinationen af dette system med transduktion af DN-celler eller HSC'er med retrovirale vektorer. Denne kombination er en effektiv måde at manipulere genekspression under normal T-celleudvikling og leukenese og har vist sig at være en effektiv metode til at inducere eller hæmme funktionen af et gen af interesse15,16,17. Denne model er især blevet brugt med succes til at studere samarbejdet mellem onkogener, der driver leukæmi15, da den er fleksibel og muliggør undersøgelse af virkningerne af flere genkombinationer inden for en rimelig tid i modsætning til at generere transgene mus. Desuden er lignende modeller tidligere blevet brugt til at vurdere virkningerne af at indføre onkogener i normale celler15,16,17. Derudover kræver retroviral transduktion opdeling af celler til transgenintegration18, og mens lentiviral transduktion ville overvinde denne begrænsning ved at eliminere behovet for at dele celler til transgenintegration, har vi ikke været i stand til at opnå en vellykket transduktion af DN-thymocytter ved hjælp af lentivirale vektorer. OP9-DL1 / DL4 er således et egnet værktøj til dyrkning af hæmatopoietiske stamceller.
Standardprotokollen for lymfopoiesis af transducerede thymocytter på OP9-DL4 involverer en række koordinerede trin, der skal udføres omhyggeligt for at opnå et vellykket resultat. Selvom dette er teknikker, der har tjent samfundet godt i mange år, er de protokoller, der er tilgængelige i litteraturen, ofte fragmenterede. Som følge heraf er hvert laboratorium tvunget til at tilpasse og optimere forskellige faser af proceduren, hvilket kan være tidskrævende. Her beskriver denne protokol isoleringen af DN-thymocytter fra musethymus efterfulgt af retroviral transduktion og co-kultur på OP9-DL4 stromale celler til yderligere funktionel analyse. Denne etablerede protokol har vist sig at være effektiv og reproducerbar til transducering af primære thymocytter efterfulgt af differentiering på OP9-DL4-celler eller induktion af T-celle akut lymfoblastær leukæmi15.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af NIH Institutional Biosafety Committee (IBC) og Animal Care and Use Committee (ACUC). Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle de reagenser og materialer, der anvendes i denne protokol. Se offentliggjort vejledning19 for yderligere oplysninger om retrovirusproducerende cellekultur og vedligeholdelsesprocedurer. Se figur 1 for en oversigt over protokollen.
1. Start af kulturen af OP9-DL4-celler (dag 1)
- OP9-DL4-cellerne tøs hurtigt op ved at holde hætteglasset og omrystes forsigtigt i vandbad ved 37 °C. Cellerne overføres straks til et centrifugeglas indeholdende 5 ml OP9-substrat (MEM-alfa-medium, 10% FBS, 50 E/ml penicillin/streptomycin, 55 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin) for at fjerne kryoprotektormidlerne.
- Der centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 1 ml OP9-medium.
- 5 ml OP9-substrat anbringes i en T25-kolbe, og de opslæmmede celler tilsættes kolben. Kultur ved 37 °C og 5% CO2.
- Efter 2-3 dage subkultureres cellerne ved hjælp af en 1:3 opdeling (passage af cellerne hver mandag, onsdag og fredag).
BEMÆRK: Opdel OP9-DL4-cellerne, før de når sammenløb. OP9-DL4-kolben skal være 80%-90% sammenflydende på dag 6-7 og på dag 8-9+ for samkultur med thymocytter. Derfor er det vigtigt at planlægge, hvor mange OP9-DL4-celler der kræves på disse dage, mens OP9-DL4-cellerne opdeles.- Mediet kasseres fra kolben, og monolaget vaskes med 1x PBS. PBS kasseres, tilsættes 1 ml 0,25% trypsin, og der inkuberes i 1-5 minutter ved 37 °C, eller indtil cellerne har løsnet sig fra kolben. Tæmp kolben for at løsne cellerne.
BEMÆRK: (Valgfrit) Forløbet af celledissociation kan kontrolleres ved mikroskopi. - Tilsæt 5 ml OP9-medium for at inaktivere trypsinet, og resuspender cellerne ved at skylle kolbens celledækkede overflade under resuspension.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 × g i 5 minutter ved stuetemperatur og resuspender i 3 ml OP9-medium (i en 1:3-fordeling).
- 1 ml af cellesuspensionen anbringes i en T25-kolbe, der allerede indeholder 5 ml frisk OP9-substrat. Frys/kassér de resterende celler.
- For at fryse OP9-DL4-cellerne skal cellerne resuspenderes i 90% FBS/10% DMSO i et forhold på 1 ml frysemedium til et hætteglas med celler.
- Fryses i 1 ml kryoialer ved -80 °C eller i flydende nitrogen, afhængigt af de fremtidige krav. Opbevares i flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
- Mediet kasseres fra kolben, og monolaget vaskes med 1x PBS. PBS kasseres, tilsættes 1 ml 0,25% trypsin, og der inkuberes i 1-5 minutter ved 37 °C, eller indtil cellerne har løsnet sig fra kolben. Tæmp kolben for at løsne cellerne.
2. Start af kulturen af retrovirusproducentcellelinjen (dag 1)
- Retrovirusproducercellelinjen optøs hurtigt ved at holde hætteglasset og omrystes forsigtigt i vandbad ved 37 °C. Overfør straks cellerne til et centrifugerør indeholdende 5 ml retrovirusproducerende cellemedium (RPC: DMEM, 10% FBS) for at fjerne det kryoprotektive middel.
- Der centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 1 ml RPC-medium.
- 5 ml RPC-substrat anbringes i en T25-kolbe, og de opslæmmede celler tilsættes kolben. Kultur ved 37 °C og 5% CO2.
- Passage cellerne hver 2-3 dage ved en 1: 5 til 1: 8 split.
- Kolben dunkes for at løsne cellerne, og cellerne suspenderes igen ved at pipettere aggressivt.
BEMÆRK: Disse celler kan fjernes fra kolbens overflade ved aggressiv pipettering uden trypsin. Alternativt trypsinize (0,05% trypsin / 0,53 mM EDTA), indtil cellerne let løsner sig og let kan pipetteres til en enkeltcelle suspension.
- Kolben dunkes for at løsne cellerne, og cellerne suspenderes igen ved at pipettere aggressivt.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 × g i 5 minutter, og resuspender den i 5 ml RPC-medium (i 1:5 split).
- 1 ml af cellesuspensionen anbringes i en T25-kolbe, der allerede indeholder 5 ml frisk RPC-medium. Frys/kassér de resterende celler. Retrovirusproducentcellerne fryses på samme måde som beskrevet for OP9-DL4-celler (trin 1.4.4.1–1.4.4.2).
3. Begyndende dyrkning af retrovirusproducentcellerne i 6-brøndsplader (dag 4-5)
- Retrovirusproducentcellerne frøes 18-24 timer før transfektion ved 70-90 % sammenløb i hver brønd i en 6-brønds vævskulturplade i 2 ml RPC-medium, og der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: Transfekt to brønde af retrovirusproducentcellerne for hver 2-5 × 105 til 1 × 106 thymocytter, der vil blive transduceret.
4. Transfektering af retrovirusproducentcellerne for at generere retrovirus, der indeholder generne af interesse (dag 5-6)
- Udskift mediet med frisk RPC-medium 1 time før transfektion.
- Forbered lipofektionsblandinger (for hver brønd i en 6-brønds plade - skaler op efter behov): Fortynd 4 μg DNA (2 μg hjælperplasmid (pCL-Eco) og 2 μg overførselsplasmid (pMIG) i 250 μL reduceret serummedium. Bland forsigtigt.
- 10 μL transfektionsreagens blandes med 250 liter reduceret serumsubstrat fra trin 4.2. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Efter 5 minutters inkubation kombineres det fortyndede DNA med fortyndet transfektionsreagens (totalvolumen = 500 μL). Bland forsigtigt og inkuber i 20-25 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 500 μL DNA / transfektionsreagensblandinger forsigtigt til brønden indeholdende retrovirusproducentcellerne ved at falde ned på cellerne med en cirkulær bevægelse. Bland forsigtigt ved at rokke pladen frem og tilbage, og inkuber pladen i en 37 °C inkubator i 16-24 timer.
BEMÆRK: Subsammenflydende celler (80% -90%) er bedst egnet til transfektion og genererer potentielt den højeste virale titer. Da retrovirusproducentcellerne løsner sig meget let fra kolben, skal du undgå pludselige bevægelser, når du håndterer disse celler.
5. Ændring af retrovirusproducentcellemediet (dag 6-7)
- Udskift det gamle medium ca. 16 timer efter transfektion med 2 ml frisk RPC-medium. Fortsæt med at inkubere celler ved 37 ° C i 20-24 timer.
- Evaluer transfektionseffektiviteten under et fluorescensmikroskop (valgfrit).
BEMÆRK: I denne protokol er GFP-positive celler de interessante celler (se figur 2). Dette trin afhænger af den retrovirusvektor, der er valgt til brug i denne protokol (om et reportergen er til stede i rygraden).
6. Thymocytforberedelse og udtømning af CD4 + og CD8 + celler (dag 6-7)
- Høst thymus fra en 4-6 uger gammel C57BL/6 mus. For flere detaljer om thymus høst, se Xing og Hogquist20.
BEMÆRK: Mus blev aflivet ved CO2 indånding efterfulgt af cervikal dislokation. - Forbered en thymocyt enkeltcellesuspension ved at placere thymus i 5 ml PBS i en petriskål. Brug sterile glasskinner til at placere thymus mellem de frostede overflader af diasene og gnid forsigtigt gliderne sammen og rulle thymus mellem de to dias. Skyl glasrutsjebanerne for at samle cellerne, og kassér det resterende thymiske stromale væv.
BEMÆRK: Det estimerede udbytte fra en thymus er 90 × 10 6-100 × 106 celler, og ca. 1% af cellerne forbliver efter CD4 og CD8 udtømning. Brug thymusvæv fra yngre mus for et bedre udbytte af celler, da cellulariteten af musethymus i de første uger efter fødslen stiger hurtigt, når et plateau ved 4-6 ugers alderen og gradvist involverer efterfølgende21. Tæl cellerne ved hjælp af en automatisk blodcelletæller eller en alternativ metode. - Filtrer thymisk suspension gennem et 30 μm eller 40 μm filter ved at pipettere 5 ml af thymisk suspension gennem en cellesil. Centrifuger cellerne ved 300 × g i 10 min.
- Supernatanten fjernes, og de røde blodlegemer lyses med ACK-lysisbuffer ved (afhængigt af prøvestørrelsen) at tilsætte 1 ml buffer pr. glas i 1 min. Der tilsættes 5 ml celleudtømningsbuffer (500 ml PBS [pH 7,2], 0,5 % BSA, 2 mM 0,5 M EDTA, pH 8,0) for at deaktivere ACK-lysisbufferen, centrifugeres ved 300 × g i 10 minutter, og resuspenderes i 1-5 ml celleudtømningsbuffer til tælling.
BEMÆRK: Sæt følgende til side på is før udtømning (præ-udtømning): 70 μL cellesuspension til tælling (varier dette afhængigt af den valgte tællecellemetode) og 200 μL cellesuspension for at bestemme effektiviteten af nedbrydning ved farvning for CD4 og CD8 og analyse ved flowcytometri22,23. - Cellerne tælles, og centrifugeres ved 300 × g i 10 minutter. Resuspender cellerne ved 1 × 107/80 μL celleudtømningsbuffer. Der tilsættes 10 μL hver af CD4- og CD8-mikroperlerne pr. 1 × 107 celler. Bland godt og inkuber i 15 minutter i mørke i køleskabet (2-8 °C).
- Forbered en udtømningskolonne ved at skylle den med 2 ml udtømningsbuffer og kassere gennemstrømningen.
- Cellerne vaskes fra trin 6.6 ved at tilsætte 1-2 ml udtømningsbuffer pr. 1 × 107 celler, og centrifugeres ved 300 × g i 10 minutter. Supernatanten fjernes og kasseres.
- Resuspender op til 1,25 × 108 celler i 500 μL udtømningsbuffer. Anvend cellesuspenderingen på kolonnen, og saml gennemløbet (celler uden etiketter). Vask søjlen 2x med 1 ml buffer, og opsaml gennemstrømningen.
BEMÆRK: Tilføj kun ny buffer, når kolonnebeholderen er tom. Følgende afsættes på is efter udtømning (kontrol efter udtømning): 70 μL cellesuspension til tælling (varier dette afhængigt af den valgte tællecellemetode) og 1.000 μL cellesuspension for at bestemme effektiviteten af nedbrydning ved farvning for CD4 og CD8 og analyse ved flowcytometri22,23. - Plet udtømningseffektivitetskontrollerne ved at opdele de 200 μL celler, der er indsamlet før udtømning, i fire FACS-rør: ufarvet, CD4 enkeltfarvet, CD8 enkeltfarvet og CD4 / CD8 dobbeltfarvet (brug de ufarvede og enkeltfarvede prøver til at indstille flowcytometriparametrene). Brug de 1.000 μL celler, der er indsamlet efter udtømning, til at plette for CD4 og CD8 og sammenlign med den dobbeltfarvede prøve indsamlet før udtømning (se typiske udtømningsresultater i figur 3).
BEMÆRK: Juster volumenerne for flowcytometrifarvning i henhold til antistofproducentens anbefaling (f.eks. 1 μL anti-CD4-FITC + 0,5 μL anti-CD8-PE pr. 1 x 106 celler i 50 μL buffer).
7. Dyrkning af thymocytter på OP9-DL4-celler (dag 6-7)
- Anbring 2–5 × 105 til 1 × 106 thymocytter efter udtømning i en T25-kolbe med 80%-90% sammenflydende OP9-DL4-celler i OP9-medium indeholdende cytokiner (10 ng / ml rekombinant IL-7 og rekombinant hFLT-3). Kultur ved 37 °C og 5% CO2. Voks i ca. 24 timer på OP9-DL4-celler.
BEMÆRK: Denne varighed er nødvendig for at gøre T-cellerne transducible (se et typisk resultat i figur 4). Der reserveres en T25-kolbe af samkulturen af thymocytter og OP9-DL4-celler, der skal anvendes som kontrol (utransduced). De utransducerede thymocytter farves sammen med de transducerede thymocytter (trin 9.1) som en negativ kontrol for at evaluere transduktionseffektiviteten. Utransducerede thymocytter kan også bruges til at måle effekten af transgenekspressionen på celledifferentiering. Kassér det cytokinholdige medium efter 1 måned.
8. Høst retrovirus fra supernatanten og brug af det til at transducere thymocytterne (dag 8-9)
- Supernatanten med retrovirus opsamles fra de transfekterede celler ved at vippe 6-brøndpladen og placere en 3-5 ml sprøjte i bunden af pladen, mens du trækker i stemplet for at aspirere supernatanten. Udskift mediet med 2 ml frisk RPC-medium. Cellerne fortsætter med at inkubere ved 37 °C i 20-24 timer til den anden transduktion i trin 8.9.
- Retrovirussupernatanten filtreres gennem et 0,45 μm sprøjtefilter, og filtratet opsamles i et 50 ml glas.
BEMÆRK: Den retrovirale supernatant må ikke nedfryses. Brug et frisklavet viruspræparat til transduktion. - Saml thymocytter fra OP9-DL4-kulturen ved aggressiv pipettering for at fjerne thymocytterne og OP9-DL4-cellerne fra kolbeoverfladen. Filtrer cellesuspensionen gennem en 40 μm cellesi for at fjerne de fleste OP9-DL4-celler, og opsaml filtratet i et 50 ml rør.
BEMÆRK: OP9-celler er meget klæbende. Selvom aggressiv pipettering kan fjerne nogle af OP9-DL4-cellerne fra kolben, er forstyrrelsen af OP9-DL4-monolaget under denne proces minimal, og OP9-DL4-cellerne, der kommer ud, filtreres ud med 40 μm-cellesilen, da OP9-DL4-cellerne er meget større end de primære thymocytter. Hvis OP9-DL4-cellerne stadig er 80% -90% sammenflydende, skal du fjerne thymocytterne og omlægge dem i den samme OP9-DL4-kolbe. Alternativt skal der fremstilles en ny OP9-DL4-kolbe. - Thymocytterne centrifugeres i filtratet fra trin 8.3 ved 300 × g i 5 minutter. Supernatanten kasseres.
- I 50 ml røret resuspenderes thymocytterne i 0,5-1 ml OP9-medium + cytokiner (se trin 7.1). Tilsæt 1-2 ml RPC-medium indeholdende virussen (dobbelt så meget RPC-medium som thymocytmedium). Der tilsættes hexametrinbromid (10 μg/μl stamkoncentration) for at opnå 8 μg hexametrinbromid/ml total cellesuspension.
- Spinoculere ved centrifugering af cellerne ved 850 × g i 1 time ved stuetemperatur.
- Resuspender cellerne i 6 ml OP9-medium + cytokiner pr. kolbe (se trin 7.1), og tilsæt suspensionen tilbage på OP9-DL4-cellemonolaget.
BEMÆRK: Alternativt kan du have nye OP9-DL4-kolber klar til at modtage de transducerede thymocytter. Hvis thymocytterne skal placeres tilbage i en brugt OP9-DL4-kolbe, skal du sørge for at tilføje frisk OP9-medium til OP9-DL4-cellerne i løbet af 1 time thymocytspinokulation for at holde cellerne sunde og sikre 80% -90% sammenløb. - Der inkuberes ved 37 °C natten over.
- Gentag trin 8.2-8.7 med et nyt hul af den retrovirusholdige cellesupernatant.
9. Vedligeholdelse af transducerede thymocytter på OP9-DL4-kultur i 2-5 dage eller frysning efter behov (dag 9+)
- Vurder thymocytdifferentieringen ved flowcytometri ved farvning af thymocytter til T-celleudviklingsmarkører såsom CD4, CD8, CD25 og CD4423. Se typiske thymocytdifferentieringsresultater i figur 5.
Representative Results
Udtømningseffektiviteten kan vurderes flowcytometrisk ved at mærke den magnetisk umærkede cellefraktion for CD4 og CD8 efter immunomagnetisk celleseparation (MACS) og analysere dette på et todimensionelt bivariat prikplot (figur 3). Et godt udbytte af dobbelt negative (CD4-, CD8-) celler er 95% eller derover, som vist i figur 3. To af de mest almindelige årsager til lavere udbytte er fejlberegningen af mikroperlerne baseret på antallet af celler og antallet af mærkede celler, der overstiger kolonnekapaciteten. Det anbefales at vælge det korrekte antal MACS-kolonner i henhold til antallet af mærkede celler. Ved arbejde med thymocytter er antallet af mærkede celler (DP- og SP-celler) næsten lig med antallet af samlede celler (mere end 96%). Celletælling kan udføres i en automatisk celletæller, et Neubauer-kammer eller med enhver alternativ metode. Som følge heraf skal de mængder, der er afsat til celletælling, muligvis justeres afhængigt af den specifikke maskine og den valgte tællemetode.
Det er vigtigt at bestemme antallet af celler, der er til stede før og efter udtømning. Disse celletal er nødvendige for at beregne antallet af LD-udtømningskolonner, der er nødvendige, og for jævnt at fordele DN-thymocytterne i det passende antal OP9-DL4-kolber. Kontrollerne for flowcytometri (umærkede celler, celler mærket til CD4 og celler mærket til CD8) kan udføres med den reserverede præudtømningsprøve, da denne indeholder flere celler. Men da de fleste af cellerne forventes at blive bevaret i kolonnen, vil prøven efter udtømning, der skal mærkes, kræve et højere volumen. Derfor kan det være nødvendigt at foretage justeringer i henhold til den valgte mærkningsprotokol.
Ved anvendelse af vektorer, der udtrykker screenbare markører, såsom et fluorescensgen, kan transfektionen og transduktionen groft og empirisk vurderes ved fluorescensmikroskopi (figur 2). Transduktionseffektiviteten kan analyseres ved at høste thymocytten fra OP9-DL4-monolaget, som beskrevet i trin 8.3, og se på ekspressionen af et fluorescensgen ved flowcytometri. Effektiviteten af transduktion ved hjælp af en tom retroviral vektor med GFP som reportergen var 84,2% (figur 4).
T-celledifferentiering på OP9-DL4-celler kan observeres 4 dage efter transduktion. Flowcytometri udføres normalt for at vurdere celledifferentieringen induceret af cokulturen på OP9-DL4-celler og / eller transgenekspressionen, som repræsenteret i figur 5, hvor cellerne blev mærket for CD4, CD8, CD44 og CD25. Der er flere mulige kombinationer af celleoverflademolekylemærkning, der har vist sig at være nyttige til undersøgelse af de molekylære og cellulære mekanismer for T-celleudvikling hos mus24,25,26,27. Derfor kan panelerne af fluorescerende antistoffer variere alt efter det spørgsmål af interesse, der behandles. Transduktionen af DN-thymocytter med den tomme retrovirale vektor pMIG, vist i panel B, præsenterede omtrent de samme proportioner af enkeltpositive (CD4 + eller CD8 +), dobbeltpositive (CD4 + / CD8 +), dobbelte negativer (CD4 - / CD8 - og dets understadier dobbelt-negative 1-4 (DN1-DN4) som de utransducerede thymocytter, vist i panel A, hvilket indikerer, at T-celleudvikling ikke blev påvirket af transduktionsprocessen.
Figur 1: Diagram over trinene i thymocytisolering, transduktion og co-kultur. Forkortelse: DN = dobbelt-negativ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Co-kultur fluorescens mikroskopi af GFP-transduced thymocytter eller utransduced thymocytter og OP9-DL4 celler. (A) Utransducerede thymocytter og (B) stabile GFP-ekspressive murine thymocytter på OP9-DL4 på dag 3 efter den anden transduktion. Et Olympus-IX71 fluorescensmikroskop med en 40x linse og et 480/30 filter egnet til GFP-detektion blev brugt. Skalabjælke = 40 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; DN = dobbelt negativ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flowcytometri af thymocytudtømning. Repræsentative flowcytometriplots, der analyserer ekspressionen af CD4 og CD8 på thymocytter opnået fra 7-8 uger gamle C57BL/6J hunmus (A) før udtømning og (B) efter udtømning af CD4+ og CD8+ ved hjælp af mikroperler og LD-søjler i henhold til producentens anvisninger. Prikplottene til venstre viser porte baseret på begivenhedens størrelse og kompleksitet (henholdsvis FCS-A og SSC-A). Det midterste panel viser FSC-H versus FSC-A for at gate enkeltceller og udelukke dubletter. I plottene til højre blev celler defineret som CD4 og CD8 fra enkeltcelleporten. Forkortelser: FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PE = phycoerythrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Flowcytometri af thymocyt retroviral transduktionseffektivitet. A) Utransducerede thymocytter dyrket sammen på OP9-DL4 B) retroviralt transducerede thymocytter på OP9-DL4 på dag 3 efter transduktion. Forkortelser: FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PE = phycoerythrin; DN = dobbelt negativ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Flowcytometri af transducerede thymocytter efter 4 dages OP9-DL4 co-kultur. (A) Utransduceret og (B) transduceret med pMIG retrovirus. Cellerne blev først gated på levende celler og derefter gated baseret på størrelse og kompleksitet (henholdsvis FCS-A og SSC-A), efterfulgt af plotning FSC-H versus FSC-A for at gate på enkeltceller og udelukke dubletter. For utransducerede celler brugte vi følgende gate-strategi. Fra enkeltcelleporten blev cellerne defineret som enkeltpositive (CD4+ eller CD8+), dobbeltpositive (CD4+/CD8+) og dobbeltnegativer (CD4−/CD8−). Derefter blev cellerne fra dobbeltnegativporten (CD4−/CD8−) defineret som CD44+, CD25+, CD44+/CD25+ og CD44−/CD25−, som vist i panel A. For de pMIG-transducerede celler, vist i panel B, fra enkeltcelleporten, blev cellerne først defineret som GFP+/GFP−, og derefter fra GFP+-celler blev cellepopulationsfordelingen i de vigtigste T-celleudviklingsstadier, som defineret af CD4-, CD8-, CD44- og CD25-ekspression, bestemt ved hjælp af den samme gate-strategi som for de ikke-traducerede celler. Forkortelser: FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; FITC = fluoresceinisothiocyanat; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Protokollen beskrevet her blev udviklet specielt til thymusafledte DN (CD4−/CD8−) T-cellestudier med retroviral transfektion efterfulgt af en OP9-DL4 differentieringsmodel. Det er imidlertid sandsynligt, at målcellerne, der vil blive underkastet denne transduktionsprotokol efterfulgt af celledifferentiering, vil have en bredere tværfaglig nytteværdi. Ud over umodne thymocytter kan hæmatopoietiske stamceller, såsom celler afledt af enten føtal lever eller knoglemarv, potentielt anvendes i denne protokol.
OP9-DL4-systemet har vist sig at være en effektiv model til at studere genfunktion i en række aspekter, herunder celledifferentiering17 og onkogenese15. Mens retroviral modifikation af hæmatopoietiske forfædre er en veletableret teknik, der muliggør stabil genetisk modifikation, kræver kombination af induktion af celledifferentiering på OP9-DL4-systemet og retroviral transduktion omhu og dygtighed. Det kritiske aspekt for at opnå succes med denne protokol er at sikre, at alle trin er velkoordinerede, da protokollen involverer brug af tre forskellige celletyper, der skal holdes sunde og ved den ideelle sammenløb, der kræves for hvert specifikt trin. Med det i tankerne er det vigtigt at udføre alle kvalitetskontrolkontrolpunktanalyser efter udførelsen af hvert trin, før du fortsætter til næste trin. Dette vil sikre, at alle trin fungerer. Derfor er det vigtigt at kontrollere udtømnings-, transfektions- og transduktionseffektiviteten for en vellykket udførelse af denne protokol (se et typisk resultat for transduktionseffektivitet i figur 4). God primær celletransduktionseffektivitet er forbundet med en høj viral titer. Større indsatser resulterer typisk i lavere virustitere18. Til træningsformål bruger vi en tom vektor til at repræsentere de resultater, der kan opnås med denne protokol. Efter vores erfaring varierer transduktions- og transfektionseffektiviteten alt efter indsatsstørrelsen, især i betragtning af de virale rygradsudbrydende reportergener, såsom GFP. En strategi, der kan bruges, når man studerer interaktionen mellem mere end et gen, er at klone hvert gen til en anden overførselsvektor efterfulgt af individuel virusproduktion og endelig co-transduktion af målcellen. I så fald kan der anvendes et selektionstrin for at fjerne de enkelttransducerede celler og kun beholde de co-transducerede celler.
Det er værd at bemærke, at størstedelen af OP9-DL1/DL4 stromale føderlagscellelinjer er blevet genetisk manipuleret til at udtrykke GFP som en del af DL1- eller DL4-konstruktionerne7. I denne protokol brugte vi en retroviral vektor, der også udtrykker GFP; Det er dog lysere end GFP-proteinet udtrykt af OP9-DL4-celler og forstyrrer ikke transduktionsinspektionen, når man visualiserer cokulturen under fluorescensmikroskopet.
OP9-celler differentieres til adipocytter efter mange passager, lange perioder i kultur eller under betingelser med oversammenløb19. Dette fremgår af udviklingen af store vakuoler. Således bør OP9-celler, der præsenterer disse egenskaber, ikke anvendes i denne protokol. Transfektering af alt for sammenflydende retrovirusproducerende celler vil resultere i en lav virustiter. Faktisk er det subsammenflydende stadium, når cellerne er mest transfektable. Desuden vil transfektering af retrovirusproducerende celler med lav sammenløb reducere cellespændingen i transfektionsprocessen og give den højeste virustiter.
Selv om vi i denne protokol ikke titrerer virussupernatanten, skal virussupernatanttitrering tages i betragtning i nogle tilfælde, f.eks. hvis der ikke findes et reportergen i den retrovirale vektor, hvilket ville forhindre indirekte bestemmelse af viral produktion, eller i tilfælde, hvor forsøgsdesignet kræver, at et mere nøjagtigt antal transgenkopier integreres i målcellegenomet. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at titeren af retroviral vektorsupernatant falder betydeligt, når den opbevares ved -80 °C eller 4 °C, indtil titreringsresultaterne opnås. Anvendelse af frisklavet virussupernatant til transduktion vil derfor give bedre transduktionseffektivitet.
Thymus indeholder et stort antal dobbeltpositive (DP) thymocytter (mere end 85%) og ca. 10% enkeltpositive15 celler (CD4 eller CD8), som er thymocytterne efter DN-stadiet. DP-cellerne kan ikke overleve in vitro til retroviral manipulation, mens SP-cellerne er uoverførbare. Derfor kan denne protokol anvendes til at generere retrovirale vektortransducible DN-thymocytter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det intramurale program fra National Cancer Institute, projekt ZIABC009287. OP9-DL4 blev opnået fra Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Canada). Forfatterne takker NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program for deres fortsatte tekniske assistance og eksperimentelle rådgivning og input samt Jeff Carrel, Megan Karwan og Kimberly Klarmann for flowcytometrihjælp. Vi er taknemmelige for Howard Young for kritiske råd og input.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
- Zuniga-Pflucker, J. C.
- Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science. 272 (5262), 722-724 (1996).
- Ueno, H., et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).
- Jaleco, A. C., et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation. Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).
- Mohtashami, M., et al. Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).
- Mazzucchelli, R., Durum, S. K. Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).
- Robey, E. A., Bluestone, J. A. Notch signaling in lymphocyte development and function. Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).
- Lavaert, M., et al. Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes. Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).
- Roh, K. H., Roy, K. Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis. Biomaterials Research. 20 (20), (2016).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).
- Cramer, S. D., et al. Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).
- Treanor, L. M., et al. Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential. Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).
- Yokoyama, K., et al. In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).
- Simmons, A., Alberola-Ila, J. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors. Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).
- Retroviral systems. , Nolan Lab. Available from: https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html (2022).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).
- Gray, D. H., et al. Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells. Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).
- Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).
- Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system. BD Biosciences–Application Note. , (2012).
- Sakaguchi, N., et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).
- He, X., Park, K., Kappes, D. J. The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment. Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).
- Wang, Y., et al. A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling. PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).
- Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program. Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).
