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Cancer Research

डेल्टा-जैसे 4-व्यक्त स्ट्रोमल कोशिकाओं पर म्यूरिन थाइमोसाइट्स की सह-संस्कृति और पारगमन टी-सेल ल्यूकेमिया में ऑन्कोजीन का अध्ययन करने के लिए

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/64271
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1, 1,2,3, 4, 1, 1
1Cytokines and Immunity Section, Cancer Innovation Laboratory, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Comparative Biomedical Scientist Training Program, NIH, 3Department of Pathobiology and Diagnostic Investigation, Veterinary Diagnostic Laboratory, Michigan State University, 4NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस थाइमस से डबल-नकारात्मक थाइमोसाइट्स के अलगाव का वर्णन करता है, जिसके बाद डेल्टा-जैसे 4-व्यक्त अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल लाइन को-कल्चर सिस्टम (ओपी 9-डीएल 4) पर रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन और सह-संस्कृति होती है।

Abstract

ट्रांसड्यूस्ड माउस अपरिपक्व थाइमोसाइट्स को डेल्टा-जैसे 4-व्यक्त अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल लाइन सह-संस्कृति प्रणाली (ओपी 9-डीएल 4) का उपयोग करके विट्रो में टी कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है। चूंकि रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन के लिए ट्रांसजीन एकीकरण के लिए विभाजित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, ओपी 9-डीएल 4 हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं की खेती के लिए एक उपयुक्त इन विट्रो वातावरण प्रदान करता है। सामान्य टी सेल विकास और ल्यूकेमोजेनेसिस के दौरान एक विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के प्रभावों का अध्ययन करते समय यह विशेष रूप से फायदेमंद है, क्योंकि यह शोधकर्ताओं को ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करने की समय लेने वाली प्रक्रिया को दरकिनार करने की अनुमति देता है। सफल परिणामों को प्राप्त करने के लिए, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के एक साथ हेरफेर से जुड़े समन्वित चरणों की एक श्रृंखला सावधानीपूर्वक की जानी चाहिए। यद्यपि ये बहुत अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रियाएं हैं, साहित्य में एक सामान्य स्रोत की कमी का मतलब अक्सर अनुकूलन की एक श्रृंखला की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली हो सकती है। इस प्रोटोकॉल को प्राथमिक थाइमोसाइट्स को ट्रांसड्यूस करने में कुशल दिखाया गया है, जिसके बाद ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर भेदभाव किया गया है। विस्तृत यहां एक प्रोटोकॉल है जो ओपी 9-डीएल 4 स्ट्रोमल कोशिकाओं पर रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स की सह-संस्कृति के लिए एक त्वरित और अनुकूलित गाइड के रूप में काम कर सकता है।

Introduction

ओपी 9 अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल लाइन पूर्वजोंके कई स्रोतों से लिम्फोपोइजिस के प्रेरण के लिए एक उपयोगी इन विट्रो सिस्टम प्रदान करती है। ओपी 9 कोशिकाओं का उपयोग करने वाले पहले अध्ययनों से पता चला है कि मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एमसीएसएफ) अभिव्यक्ति की कमी ने अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) से हेमटोपोइजिस और बी सेल भेदभाव का समर्थन करने के लिए ओपी 9 सेल लाइन की क्षमता में योगदान दिया, जैसा कि बाद में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) 2,3,4,5 के लिए भी दिखाया गया था। . पिछले अध्ययनों में, डेल्टा जैसी 1/4-व्यक्त ओपी 9 कोशिकाओं (ओपी 9-डीएल 1 / ओपी 9-डीएल 4) की पीढ़ी ने टी सेल वंश प्रतिबद्धता6 के प्रेरण को सक्षम किया और थाइमिक परिपक्वता 7,8 को सफलतापूर्वक पुन: उत्पन्न करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। संक्षेप में, टी सेल विकास को सीडी 4 और सीडी 8 अणुओं की अनुक्रमिक अभिव्यक्ति द्वारा वर्णित किया गया है। अपरिपक्व थाइमोसाइट्स "डबल-नकारात्मक" (डीएन, सीडी 4 − सीडी 8−) हैं और सीडी 44 और सीडी 25 की सतह अभिव्यक्ति के अनुसार आगे उप-विभाजित किए जा सकते हैं। डीएन थाइमोसाइट्स अपरिपक्व एकल-सकारात्मक (आईएसपी) चरण के माध्यम से अंतर करते हैं, जो चूहों में सीडी 8 अभिव्यक्ति और मनुष्यों में सीडी 4 की विशेषता है, इसके बाद डबल-पॉजिटिव (डीपी) चरण, सीडी 4 और सीडी 8 की सह-अभिव्यक्ति की विशेषता है, और अंत में, परिपक्व एकल-सकारात्मक चरण, सीडी 4 या सीडी 89 की अभिव्यक्ति की विशेषता है। एचएससी नॉच 1 रिसेप्टर को व्यक्त करते हैं, जो आमतौर पर टी वंश भेदभाव10 को प्रेरित करने के लिए थाइमिक उपकला कोशिकाओं पर व्यक्त डेल्टा जैसे 4 (डीएल 4) के साथ बातचीत करता है। इसलिए, ओपी 9-डीएल 1/4 मॉडल में रुचि उत्तरोत्तर बढ़ी है, जिससे पिछले दो दशकों में विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों में इस दृष्टिकोण का व्यापक उपयोगहुआ है। यद्यपि डीएल 1 और डीएल 4 दोनों विट्रो में टी सेल भेदभाव का समर्थन करने में सक्षम हैं, वे विवो में अंतर आवश्यकताओं को दिखाते हैं, और कुछ अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि OP9_DL4 माउस थाइमिक वातावरण 7,14 को पुन: व्यवस्थित करने में OP9_DL1 की तुलना में अधिक कुशल है।

ओपी 9-डीएल 1/4 प्रणाली के संभावित अनुप्रयोगों में, रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ डीएन कोशिकाओं या एचएससी के पारगमन के साथ इस प्रणाली के संयोजन में विशेष रुचि है। यह संयोजन सामान्य टी सेल विकास और ल्यूकेमोजेनेसिस के दौरान जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने का एक प्रभावी तरीका है औरइसे रुचि के जीन 15,16,17 के कार्य को प्रेरित करने या बाधित करने के लिए एक कुशल विधि के रूप में दिखाया गया है। इस मॉडल का उपयोग विशेष रूप से ल्यूकेमिया15 को चलाने वाले ऑन्कोजीन के बीच सहयोग का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है क्योंकि यह लचीला है और ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करने के विपरीत उचित समय में कई जीन संयोजनों के प्रभावों की जांच को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इसी तरह के मॉडल का उपयोग पहले सामान्य कोशिकाओं15,16,17 में ऑन्कोजीन पेश करने के प्रभावों का आकलन करने के लिए किया गया है। इसके अतिरिक्त, रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन के लिए ट्रांसजीन एकीकरण18 के लिए विभाजित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, और जबकि लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन ट्रांसजेन एकीकरण के लिए कोशिकाओं को विभाजित करने की आवश्यकता को समाप्त करके इस सीमा को दूर करेगा, हम लेंटीवायरल वैक्टर का उपयोग करके डीएन थाइमोसाइट्स के सफल पारगमन को प्राप्त करने में असमर्थ रहे हैं। इस प्रकार, ओपी 9-डीएल 1 / डीएल 4 हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए एक उपयुक्त उपकरण है।

ओपी 9-डीएल 4 पर ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स के लिम्फोपोइजिस के लिए मानक प्रोटोकॉल में समन्वित चरणों की एक श्रृंखला शामिल है जिसे एक सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। यद्यपि ये ऐसी तकनीकें हैं जो कई वर्षों से समुदाय की अच्छी तरह से सेवा कर रही हैं, अक्सर साहित्य में उपलब्ध प्रोटोकॉल खंडित होते हैं। नतीजतन, प्रत्येक प्रयोगशाला को प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को अनुकूलित और अनुकूलित करने के लिए मजबूर किया जाता है, जो समय लेने वाला हो सकता है। यहां, यह प्रोटोकॉल माउस थाइमस से डीएन थाइमोसाइट्स के अलगाव का वर्णन करता है, इसके बाद आगे के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए ओपी 9-डीएल 4 स्ट्रोमल कोशिकाओं पर रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन और सह-संस्कृति होती है। इस स्थापित प्रोटोकॉल को प्राथमिक थाइमोसाइट्स को ट्रांसड्यूस करने में कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दिखाया गया है, इसके बाद ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर भेदभाव या टी सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया15 का प्रेरण होता है।

Protocol

वर्णित सभी पशु प्रयोगों को एनआईएच संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) और पशु देखभाल और उपयोग समिति (एसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और सामग्रियों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। रेट्रोवायरस-निर्माता सेल संस्कृति और रखरखाव प्रक्रियाओं के बारे में अधिक जानकारी के लिए प्रकाशित दिशानिर्देश19 देखें। प्रोटोकॉल के अवलोकन के लिए चित्रा 1 देखें।

1. OP9-DL4 कोशिकाओं की संस्कृति शुरू करना (दिन 1)

  1. शीशी को पकड़कर ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं को तेजी से पिघलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में धीरे से हिलाएं। क्रायोप्रोटेक्टेंट एजेंटों को हटाने के लिए कोशिकाओं को तुरंत ओपी 9 माध्यम (एमईएम-अल्फा माध्यम, 10% एफबीएस, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 55 μM 2-मर्काप्टोएथेनॉल, 2 mM L-ग्लूटामाइन) के 5 एमएल युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाला को त्याग दें, और कोशिकाओं को ओपी 9 माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें।
  3. एक टी 25 फ्लास्क में ओपी 9 माध्यम के 5 एमएल रखें, और इस फ्लास्क में पुन: निलंबित कोशिकाओं को जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर संस्कृति।
  4. 2-3 दिनों के बाद, उपसंस्कृति 1: 3 का उपयोग करके कोशिकाओं को विभाजित करती है (हर सोमवार, बुधवार और शुक्रवार को कोशिकाओं को पारित करती है)।
    नोट: ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं को विभाजित करें इससे पहले कि वे सामंजस्य तक पहुंच जाएं। ओपी 9-डीएल 4 फ्लास्क को थाइमोसाइट्स के साथ सह-संस्कृति के लिए 6-7 दिनों में 80% -90% और दिन 8-9 + पर होना चाहिए। इसलिए, यह योजना बनाना महत्वपूर्ण है कि ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं को विभाजित करते समय उन दिनों में कितने ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं की आवश्यकता होगी।
    1. फ्लास्क से माध्यम को छोड़ दें, और मोनोलेयर को 1x PBS के साथ धो लें। पीबीएस को छोड़ दें, 0.25% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, या जब तक कोशिकाएं फ्लास्क से बाहर न हो जाएं। कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क को थपथपाएं।
      नोट: (वैकल्पिक) सेल पृथक्करण की प्रगति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जा सकती है।
    2. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए ओपी 9 माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, और पुन: निलंबन के दौरान फ्लास्क की सेल-कवर सतह को धोकर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और ओपी 9 माध्यम के 3 एमएल (1: 3 विभाजन के लिए) में फिर से निलंबित करें।
    4. सेल निलंबन के 1 एमएल को टी 25 फ्लास्क में रखें जिसमें पहले से ही 5 एमएल ताजा ओपी 9 माध्यम होता है। शेष कोशिकाओं को फ्रीज/त्याग दें।
      1. ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, कोशिकाओं को 90% एफबीएस / 10% डीएमएसओ में 1 एमएल फ्रीजिंग माध्यम से कोशिकाओं की एक शीशी के अनुपात में पुन: निलंबित करें।
      2. भविष्य की आवश्यकताओं के आधार पर -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन में 1 एमएल क्रायोवियल्स में फ्रीज करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।

2. रेट्रोवायरस-निर्माता सेल लाइन की संस्कृति शुरू करना (दिन 1)

  1. शीशी को पकड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में धीरे से हिलाते हुए रेट्रोवायरस-निर्माता सेल लाइन को तेजी से पिघलाएं। क्रायोप्रोटेक्टेंट एजेंट को हटाने के लिए कोशिकाओं को तुरंत 5 एमएल रेट्रोवायरस-निर्माता सेल माध्यम (आरपीसी: डीएमईएम, 10% एफबीएस) युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और आरपीसी माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. 5 एमएल आरपीसी माध्यम को टी 25 फ्लास्क में रखें, और इस फ्लास्क में पुन: निलंबित कोशिकाओं को जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर संस्कृति।
  4. कोशिकाओं को हर 2-3 दिनों में 1: 5 से 1: 8 विभाजित पर पारित करें।
    1. कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क को थपथपाएं, और आक्रामक रूप से पाइपिंग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: ट्रिप्सिन के बिना आक्रामक पाइपिंग द्वारा इन कोशिकाओं को फ्लास्क की सतह से हटाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ट्रिप्सिनाइज (0.05% ट्रिप्सिन / 0.53 एमएम ईडीटीए) जब तक कि कोशिकाएं आसानी से अलग नहीं हो जाती हैं और आसानी से एकल-सेल निलंबन में पाइप की जा सकती हैं।
  5. सेल निलंबन को 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और आरपीसी माध्यम के 5 एमएल (1: 5 विभाजन के लिए) में फिर से निलंबित करें।
  6. सेल निलंबन के 1 एमएल को टी 25 फ्लास्क में रखें जिसमें पहले से ही 5 एमएल ताजा आरपीसी माध्यम होता है। शेष कोशिकाओं को फ्रीज/त्याग दें। रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं को उसी तरह फ्रीज करें जैसे ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं (चरण 1.4.4.1-1.4.4.2) के लिए वर्णित है।

3. 6-वेल प्लेटों में रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं की संस्कृति शुरू करना (दिन 4-5)

  1. रेट्रोवायरस-उत्पादक कोशिकाओं को आरपीसी माध्यम के 2 एमएल में 6-वेल टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 70% -90% कंफ्लुएंसी पर अभिकर्मक से 18-24 घंटे पहले बीज दें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं के दो कुओं को प्रत्येक 2-5 × 105 से 1 × 106 थाइमोसाइट्स के लिए ट्रांसक्रिप्ट करें जिन्हें ट्रांसड्यूस किया जाएगा।

4. रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं को रेट्रोवायरस उत्पन्न करने के लिए स्थानांतरित करना जिसमें रुचि के जीन होते हैं (दिन 5-6)

  1. अभिकर्मक से 1 घंटे पहले माध्यम को ताजा आरपीसी माध्यम के साथ बदलें।
  2. लिपोफेक्शन मिश्रण तैयार करें (6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए- आवश्यकतानुसार स्केल अप करें): डीएनए के 4 μg (2 μg हेल्पर प्लास्मिड (pCL-Eco) और 2 μg ट्रांसफर प्लास्मिड (pMIG) को कम-सीरम माध्यम के 250 μL में पतला करें। धीरे से मिलाएं।
  3. चरण 4.2 से कम-सीरम माध्यम के 250 यूएल के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक के 10 μL मिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. इनक्यूबेशन के 5 मिनट के बाद, पतला अभिकर्मक (कुल मात्रा = 500 μL) के साथ पतला डीएनए को मिलाएं। धीरे से मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 20-25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 500 μL डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण को धीरे से रेट्रोवायरस-उत्पादक कोशिकाओं वाले कुएं में एक गोलाकार आंदोलन के साथ कोशिकाओं पर गिराकर जोड़ें। प्लेट को आगे और पीछे हिलाते हुए धीरे-धीरे मिलाएं, और प्लेट को 16-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: सबकॉन्फ्लुएंट कोशिकाएं (80% -90%) अभिकर्मक के लिए सबसे उपयुक्त हैं और संभावित रूप से उच्चतम वायरल टिटर उत्पन्न करती हैं। चूंकि रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाएं फ्लास्क से बहुत आसानी से हट जाती हैं, इसलिए इन कोशिकाओं को संभालते समय अचानक आंदोलनों से बचें।

5. रेट्रोवायरस-निर्माता सेल माध्यम को बदलना (दिन 6-7)

  1. अभिकर्मक के लगभग 16 घंटे बाद पुराने माध्यम को 2 एमएल ताजा आरपीसी माध्यम से बदलें। 20-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना जारी रखें।
  2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (वैकल्पिक) के तहत अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाएं रुचि की कोशिकाएं हैं ( चित्रा 2 देखें)। यह कदम इस प्रोटोकॉल में उपयोग करने के लिए चुने गए रेट्रोवायरस वेक्टर पर निर्भर करता है (क्या रीढ़ की हड्डी में एक रिपोर्टर जीन मौजूद है)।

6. सीडी 4 + और सीडी 8 + कोशिकाओं की थाइमोसाइट तैयारी और कमी (दिन 6-7)

  1. 4-6 सप्ताह पुराने C57BL/6 माउस से थाइमस की कटाई करें। थाइमस कटाई के बारे में अधिक जानकारी के लिए, शिंग और हॉगक्विस्ट20 देखें।
    नोट: चूहों को सीओ2 इनहेलेशन द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी, जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हुई थी।
  2. पेट्री डिश में पीबीएस के 5 एमएल में थाइमस रखकर एक थाइमोसाइट सिंगल-सेल सस्पेंशन तैयार करें। बाँझ ग्लास स्लाइड का उपयोग करके, थाइमस को स्लाइड्स की ठंढी सतहों के बीच रखें, और धीरे से स्लाइड्स को एक साथ रगड़ें, दो स्लाइडों के बीच थाइमस को घुमाएं। कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ग्लास स्लाइड को कुल्ला करें, और अवशेष थाइमिक स्ट्रोमल ऊतक को त्याग दें।
    नोट: एक थाइमस से अनुमानित उपज 90 × 10 6-100 × 106 कोशिकाएं हैं, और सीडी 4 और सीडी 8 की कमी के बाद लगभग 1% कोशिकाएं बनी रहेंगी। कोशिकाओं की बेहतर उपज के लिए युवा चूहों से थाइमस ऊतक का उपयोग करें, क्योंकि जन्म के बाद पहले हफ्तों में माउस थाइमस की सेलुलरिटी जल्दी से बढ़ जाती है, 4-6 सप्ताह की उम्र में एक पठार तक पहुंच जाती है, और बाद मेंधीरे-धीरे 21 में प्रवेश करती है। स्वचालित रक्त कोशिका काउंटर या किसी वैकल्पिक विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  3. सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 5 एमएल थाइमिक सस्पेंशन को पाइप करके 30 μm या 40 μm फ़िल्टर के माध्यम से थाइमिक सस्पेंशन को फ़िल्टर करें। 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और 1 मिनट के लिए प्रति ट्यूब 1 एमएल बफर जोड़कर (नमूना आकार के आधार पर) एसीके लाइसिस बफर के साथ लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करें। एसीके लाइसिस बफर को निष्क्रिय करने के लिए 5 एमएल सेल रिक्तीकरण बफर (पीबीएस [पीएच 7.2], 0.5% बीएसए, 2 एमएम 0.5 एम ईडीटीए, पीएच 8.0) जोड़ें, 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और गिनती के लिए 1-5 एमएल सेल रिक्तीकरण बफर में पुन: निलंबित करें।
    नोट: कमी (पूर्व-अवक्षय) से पहले बर्फ पर निम्नलिखित को अलग रखें: गणना करने के लिए सेल निलंबन का 70 μL (चुने गए सेल विधि के आधार पर इसे अलग-अलग करें) और सीडी 4 और सीडी 8 के लिए धुंधला करके कमी की दक्षता निर्धारित करने और फ्लो साइटोमेट्री22,23 द्वारा विश्लेषण करने के लिए सेल निलंबन का 200 μL।
  5. कोशिकाओं की गणना करें, और सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर। कोशिका ओं को सेल की कमी बफर के 1 × 107/80 μL पर पुन: निलंबित किया जाता है। 107 कोशिकाओं में प्रति 10 10 7 कोशिकाओं में सीडी 4 और सीडी 8 माइक्रोबीड्स में से प्रत्येक × 10 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं, और रेफ्रिजरेटर (2-8 डिग्री सेल्सियस) में अंधेरे में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. इसे 2 एमएल की कमी बफर के साथ धोकर और प्रवाह को छोड़कर एक रिक्तीकरण स्तंभ तैयार करें।
  7. चरण 6.6 से कोशिकाओं को 107 कोशिकाओं × प्रति 1-2 एमएल कमी बफर जोड़कर और 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज जोड़कर धोएं। सतह पर तैरने वाले को निकालें और त्याग दें।
  8. 500 μL रिक्तीकरण बफर में 1.25 × 108 कोशिकाओं तक पुन: निलंबित। स्तंभ पर सेल निलंबन लागू करें, और प्रवाह (बिना लेबल वाली कोशिकाओं) को इकट्ठा करें। कॉलम 2x को 1 एमएल बफर के साथ धोएं, और प्रवाह को इकट्ठा करें।
    नोट: कॉलम जलाशय खाली होने पर केवल नया बफर जोड़ें। कमी के बाद बर्फ पर निम्नलिखित को अलग रखें (पोस्ट-अवक्षय नियंत्रण): गणना के लिए सेल निलंबन का 70 μL (चुनी गई सेल विधि के आधार पर इसे अलग-अलग करें) और सीडी 4 और सीडी 8 के लिए धुंधला करके कमी की दक्षता निर्धारित करने और प्रवाह साइटोमेट्री22,23 द्वारा विश्लेषण करने के लिए सेल निलंबन का 1,000 μL।
  9. रिक्तीकरण से पहले एकत्र की गई कोशिकाओं के 200 μL को चार FACS ट्यूबों में विभाजित करके कमी दक्षता नियंत्रण को दाग दें: बिना दाग वाले, CD4 एकल-दाग वाले, CD8 एकल-दाग वाले, और CD4/CD8 डबल-दाग वाले (प्रवाह साइटोमेट्री मापदंडों को स्थापित करने के लिए बिना दाग वाले और एकल-दाग वाले नमूनों का उपयोग करें)। सीडी 4 और सीडी 8 के लिए दाग लगाने के लिए कमी के बाद एकत्र की गई कोशिकाओं के 1,000 μL का उपयोग करें और कमी से पहले एकत्र किए गए दोहरे दाग वाले नमूने के साथ तुलना करें ( चित्र 3 में विशिष्ट कमी के परिणाम देखें)।
    नोट: एंटीबॉडी निर्माता की सिफारिश के अनुसार फ्लो साइटोमेट्री धुंधला करने के लिए वॉल्यूम समायोजित करें (उदाहरण के लिए, एंटी-सीडी 4-एफआईटीसी का 1 μL + एंटी-सीडी 8-पीई का 0.5 μL प्रति 1 x 106 कोशिकाओं में 50 μL बफर में)।

7. ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर थाइमोसाइट्स की खेती (दिन 6-7)

  1. साइटोकिन्स युक्त ओपी 9 माध्यम में2-5 × 10 5 से 1 × 106 पोस्ट-डेप्लेशन थाइमोसाइट्स को 80% -90% कंफ्लुएंट ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं के टी 25 फ्लास्क में रखें जिसमें साइटोकिन्स (10 एनजी / एमएल पुनः संयोजक आईएल -7 और पुनः संयोजक एचएफएलटी -3) होते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर संस्कृति। ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर लगभग 24 घंटे के लिए बढ़ें।
    नोट: टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूसेबल बनाने के लिए इस अवधि की आवश्यकता होती है ( चित्रा 4 में एक विशिष्ट परिणाम देखें)। थाइमोसाइट्स और ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं की सह-संस्कृति के एक टी 25 फ्लास्क को नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए आरक्षित करें (अपरिवर्तित)। ट्रांसडक्शन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स (चरण 9.1) के साथ अनट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स को एक साथ दाग दिया जाएगा। सेल भेदभाव पर ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के प्रभाव को मापने के लिए अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स का भी उपयोग किया जा सकता है। 1 महीने के बाद साइटोकिन युक्त माध्यम को छोड़ दें।

8. सतह पर तैरने वाले से रेट्रोवायरस की कटाई और थाइमोसाइट्स को ट्रांसड्यूस करने के लिए इसका उपयोग करना (दिन 8-9)

  1. 6-वेल प्लेट को झुकाकर और प्लेट के निचले भाग में 3-5 एमएल सिरिंज को रखकर ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं से रेट्रोवायरस युक्त सुपरनैटेंट एकत्र करें, जबकि प्लंजर को सुपरनैटेंट को खींचने के लिए खींचें। माध्यम को 2 एमएल ताजा आरपीसी माध्यम से बदलें। चरण 8.9 में दूसरे पारगमन के लिए 20-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना जारी रखें।
  2. रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट को 0.45 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, और 50 एमएल ट्यूब में फिल्ट्रेट एकत्र करें।
    नोट: रेट्रोवायरल सुपरनैटेंट को फ्रीज न करें। पारगमन के लिए एक ताजा बनाए गए वायरस की तैयारी का उपयोग करें।
  3. फ्लास्क सतह से थाइमोसाइट्स और ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं को हटाने के लिए आक्रामक पाइपिंग द्वारा ओपी 9-डीएल 4 संस्कृति से थाइमोसाइट्स एकत्र करें। अधिकांश ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं को हटाने के लिए 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें, और 50 एमएल ट्यूब में छानने को इकट्ठा करें।
    नोट: OP9 कोशिकाएँ बहुत अनुयायी हैं। यद्यपि आक्रामक पिपेटिंग फ्लास्क से कुछ ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं को हटा सकती है, इस प्रक्रिया के दौरान ओपी 9-डीएल 4 मोनोलेयर का विघटन न्यूनतम है, और ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाएं जो बाहर आती हैं, उन्हें 40 μm सेल स्ट्रेनर के साथ फ़िल्टर किया जाएगा, क्योंकि OP9-DL4 कोशिकाएं प्राथमिक थाइमोसाइट्स की तुलना में बहुत बड़ी हैं। यदि OP9-DL4 कोशिकाएं अभी भी 80% -90% कॉन्फ्लुएंट हैं, तो थाइमोसाइट्स को हटा दें, और उन्हें उसी OP9-DL4 फ्लास्क में फिर से प्लेट करें। वैकल्पिक रूप से, एक नया OP9-DL4 फ्लास्क तैयार किया जाना चाहिए।
  4. चरण 8.3 से 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए छांट्रेट में थाइमोसाइट्स को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  5. 50 एमएल ट्यूब में, ओपी 9 माध्यम + साइटोकिन्स के 0.5-1 एमएल में थाइमोसाइट्स को फिर से निलंबित करें (चरण 7.1 देखें)। वायरस युक्त आरपीसी माध्यम के 1-2 एमएल जोड़ें (थाइमोसाइट माध्यम से दोगुना आरपीसी माध्यम)। कुल सेल सस्पेंशन के 8 μg हेक्सामेथ्रिन ब्रोमाइड / एमएल प्राप्त करने के लिए हेक्सामेथ्रिन ब्रोमाइड (10 μg / μL स्टॉक एकाग्रता) जोड़ें।
  6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 850 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करके स्पिनोकुलेट करें।
  7. ओपी 9 माध्यम + साइटोकिन्स प्रति फ्लास्क के 6 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (चरण 7.1 देखें), और निलंबन को ओपी 9-डीएल 4 सेल मोनोलेयर पर वापस जोड़ें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स प्राप्त करने के लिए नए ओपी 9-डीएल 4 फ्लास्क तैयार हैं। यदि थाइमोसाइट्स को उपयोग किए गए ओपी 9-डीएल 4 फ्लास्क में वापस रखा जाना है, तो कोशिकाओं को स्वस्थ रखने और 80% -90% कंफ्लुएंसी सुनिश्चित करने के लिए थाइमोसाइट स्पिनोक्यूलेशन के 1 घंटे के दौरान ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं में ताजा ओपी 9 माध्यम जोड़ना सुनिश्चित करें।
  8. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. रेट्रोवायरस युक्त सेल सुपरनैटेंट के एक नए कुएं का उपयोग करके चरण 8.2-8.7 दोहराएं।

9. ओपी 9-डीएल 4 संस्कृति पर ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स को 2-5 दिनों के लिए बनाए रखना या आवश्यकतानुसार ठंड (दिन 9+)

  1. सीडी 4, सीडी 8, सीडी 25 और सीडी 4423 जैसे टी सेल विकास मार्करों के लिए थाइमोसाइट्स को धुंधला करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा थाइमोसाइट भेदभाव का आकलन करें। चित्रा 5 में विशिष्ट थाइमोसाइट भेदभाव परिणाम देखें।

Representative Results

इम्यूनोमैग्नेटिक सेल सेपरेशन (एमएसीएस) के बाद सीडी 4 और सीडी 8 के लिए चुंबकीय रूप से अनलेबल सेल अंश को लेबल करके और दो-आयामी द्विभिन्नरूपी डॉट-प्लॉट (चित्रा 3) पर इसका विश्लेषण करके कमी दक्षता का मूल्यांकन साइटोमेट्रिक रूप से प्रवाह किया जा सकता है। डबल नकारात्मक (CD4−, CD8−) कोशिकाओं की एक अच्छी उपज 95% या उससे अधिक है, जैसा कि चित्र 3 में दर्शाया गया है। कम उपज के दो सबसे आम कारण कोशिकाओं की संख्या और कॉलम क्षमता से अधिक लेबल कोशिकाओं की संख्या के आधार पर माइक्रोबीड्स की गलत गणना है। लेबल किए गए कोशिकाओं की संख्या के अनुसार एमएसीएस कॉलम की सही संख्या चुनने की सिफारिश की जाती है। थाइमोसाइट्स के साथ काम करते समय, लेबल कोशिकाओं (डीपी और एसपी कोशिकाओं) की संख्या कुल कोशिकाओं (96% से अधिक) की संख्या के लगभग बराबर होती है। सेल गिनती एक स्वचालित सेल काउंटर, एक न्यूबॉयर कक्ष, या किसी भी वैकल्पिक विधि के साथ की जा सकती है। नतीजतन, सेल गिनती के लिए आवंटित वॉल्यूम को विशिष्ट मशीन और चुनी हुई गिनती विधि के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

कमी से पहले और बाद में मौजूद कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। इन सेल गणनाओं को आवश्यक एलडी रिक्तीकरण स्तंभों की संख्या की गणना करने और डीएन थाइमोसाइट्स को ओपी 9-डीएल 4 फ्लास्क की उचित संख्या में समान रूप से वितरित करने की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री (अनलेबल कोशिकाओं, सीडी 4 के लिए लेबल की गई कोशिकाओं और सीडी 8 के लिए लेबल की गई कोशिकाओं) के लिए नियंत्रण आरक्षित पूर्व-रिक्तीकरण नमूने के साथ किया जा सकता है, क्योंकि इसमें अधिक कोशिकाएं होती हैं। हालांकि, चूंकि अधिकांश कोशिकाओं को कॉलम के भीतर बनाए रखने की उम्मीद है, इसलिए लेबल किए जाने वाले पोस्ट-रिक्तीकरण नमूने को उच्च मात्रा की आवश्यकता होगी। नतीजतन, चयनित लेबलिंग प्रोटोकॉल के अनुसार समायोजन करने की आवश्यकता हो सकती है।

प्रतिदीप्ति जीन जैसे स्क्रीन करने योग्य मार्करों को व्यक्त करने वाले वैक्टर का उपयोग करते समय, अभिकर्मक और पारगमन को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा मोटे तौर पर और अनुभवजन्य रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। पारगमन दक्षता का विश्लेषण ओपी 9-डीएल 4 मोनोलेयर से थाइमोसाइट की कटाई करके किया जा सकता है, जैसा कि चरण 8.3 में वर्णित है, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रतिदीप्ति जीन की अभिव्यक्ति को देखते हुए। रिपोर्टर जीन के रूप में जीएफपी के साथ एक खाली रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग करके पारगमन की दक्षता 84.2% थी (चित्रा 4)।

ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं पर टी सेल भेदभाव पारगमन के 4 दिन बाद देखा जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री आमतौर पर ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं और / या ट्रांसजीन अभिव्यक्ति पर सह-संस्कृति द्वारा प्रेरित सेल भेदभाव का आकलन करने के लिए किया जाता है, जैसा कि चित्रा 5 में दर्शाया गया है, जहां कोशिकाओं को सीडी 4, सीडी 8, सीडी 44 और सीडी 25 के लिए लेबल किया गया था। सेल सतह अणु लेबलिंग के कई संभावित संयोजन हैं जिन्हें चूहों 24,25,26,27 में टी सेल विकास के आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के लिए उपयोगी दिखाया गया है। इसलिए, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के पैनल संबोधित किए जा रहे ब्याज के सवाल के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। पैनल बी में दिखाए गए खाली रेट्रोवायरल वेक्टर पीएमआईजी के साथ डीएन थाइमोसाइट्स के पारगमन ने एकल सकारात्मक (सीडी 4 + या सीडी 8 +), डबल पॉजिटिव (सीडी 4 + / सीडी 8 +), डबल नकारात्मक (सीडी 4 −/ सीडी 8 -), और इसके उप-चरण डबल-नकारात्मक 1-4 (डीएन 1-डीएन 4) के लगभग समान अनुपात को पैनल ए में दिखाया गया है, जो दर्शाता है कि टी सेल विकास पारगमन प्रक्रिया से प्रभावित नहीं था।

Figure 1
चित्रा 1: थाइमोसाइट अलगाव, पारगमन और सह-संस्कृति के चरणों का आरेख। संक्षिप्त नाम: डीएन = डबल-नकारात्मक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: जीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स या अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स और ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं की सह-संस्कृति फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी। (ए) दूसरे पारगमन के बाद दिन 3 पर ओपी 9-डीएल 4 पर अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स और (बी) स्थिर जीएफपी-व्यक्त म्यूरिन थाइमोसाइट्स। एक ओलंपस-आईएक्स 71 फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप जिसमें 40 एक्स लेंस और जीएफपी का पता लगाने के लिए उपयुक्त 480/30 फिल्टर का उपयोग किया गया था। स्केल बार = 40 μm। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; डीएन = डबल-नकारात्मक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: थाइमोसाइट की कमी का प्रवाह साइटोमेट्री। निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोबीड्स और एलडी कॉलम का उपयोग करके 7-8 सप्ताह पुराने सी 57बीएल / 6 जे महिला चूहों (ए) पूर्व-कमी और (बी) सीडी 4 + और सीडी 8 + की कमी के बाद से प्राप्त थाइमोसाइट्स पर सीडी 4 और सीडी 8 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने वाले प्रतिनिधि फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट। बाईं ओर के डॉट प्लॉट घटना के आकार और जटिलता (क्रमशः एफसीएस-ए और एसएससी-ए) के आधार पर गेट दिखाते हैं। मध्य पैनल एकल कोशिकाओं को गेट करने और डबल्स को बाहर करने के लिए एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए दिखाता है। दाईं ओर के भूखंडों में, कोशिकाओं को एकल-सेल गेट से सीडी 4 और सीडी 8 के रूप में परिभाषित किया गया था। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: थाइमोसाइट रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन दक्षता का फ्लो साइटोमेट्री। (ए) ओपी 9-डीएल 4 पर सह-संवर्धित अपरिवर्तित थाइमोसाइट्स; (बी) ट्रांसडक्शन के बाद दिन 3 पर ओपी 9-डीएल 4 पर रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; डीएन = डबल-नकारात्मक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ओपी 9-डीएल 4 सह-संस्कृति के 4 दिनों के बाद ट्रांसड्यूस्ड थाइमोसाइट्स का फ्लोसाइटोमेट्री। (ए) अपरिवर्तित और (बी) पीएमआईजी रेट्रोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया। कोशिकाओं को पहले जीवित कोशिकाओं पर गेट किया गया था और फिर आकार और जटिलता (एफसीएस-ए और एसएससी-ए, क्रमशः) के आधार पर गेट किया गया था, इसके बाद एकल कोशिकाओं पर गेट करने और डबल्स को बाहर करने के लिए एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए को प्लॉट किया गया था। अपरिवर्तित कोशिकाओं के लिए, हमने निम्नलिखित गेट रणनीति का उपयोग किया। एकल-सेल गेट से, कोशिकाओं को एकल सकारात्मक (सीडी 4 + या सीडी 8 +), डबल पॉजिटिव (सीडी 4 + / सीडी 8 +), और डबल नकारात्मक (सीडी 4 −/ सीडी 8 -) के रूप में परिभाषित किया गया था। फिर, डबल नकारात्मक (CD4−/CD8−) गेट से, कक्षों को CD44+, CD25+, CD44+/CD25+, और CD44−/CD25−के रूप में परिभाषित किया गया, जैसा कि पैनल A में दिखाया गया है। एकल-सेल गेट से पैनल बी में दिखाए गए पीएमआईजी ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को पहले जीएफपी + / जीएफपी - के रूप में परिभाषित किया गया था, और फिर जीएफपी + कोशिकाओं से, सीडी 4, सीडी 8, सीडी 44 और सीडी 25 अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित प्रमुख टी सेल विकास चरणों में सेल जनसंख्या वितरण, उसी गेट रणनीति का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से थाइमस-व्युत्पन्न डीएन (सीडी 4−/सीडी 8−) टी सेल अध्ययन के लिए रेट्रोवायरल अभिकर्मक के साथ विकसित किया गया था, जिसके बाद ओपी 9-डीएल 4 भेदभाव मॉडल था। हालांकि, यह संभावना है कि लक्ष्य कोशिकाएं जो सेल भेदभाव के बाद पारगमन के इस प्रोटोकॉल के अधीन होंगी, उनकी व्यापक अंतःविषय उपयोगिता होगी। इस प्रकार, अपरिपक्व थाइमोसाइट्स के अलावा, हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल, जैसे कि भ्रूण के यकृत या अस्थि मज्जा से प्राप्त कोशिकाएं, संभावित रूप से इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जा सकती हैं।

ओपी 9-डीएल 4 प्रणाली विभिन्न पहलुओं में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी मॉडल साबित हुई है, जिसमें सेल भेदभाव17 और ऑन्कोजेनेसिस15 शामिल हैं। जबकि हेमटोपोइएटिक पूर्वजों का रेट्रोवायरल संशोधन एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है जो स्थिर आनुवंशिक संशोधन को सक्षम बनाता है, ओपी 9-डीएल 4 प्रणाली और रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन पर सेल भेदभाव के प्रेरण के संयोजन के लिए देखभाल और कौशल की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल के साथ सफलता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण पहलू यह सुनिश्चित करना है कि सभी कदम अच्छी तरह से समन्वित हैं, क्योंकि प्रोटोकॉल में तीन अलग-अलग सेल प्रकारों का उपयोग करना शामिल है जिन्हें स्वस्थ रखने और प्रत्येक विशिष्ट चरण के लिए आवश्यक आदर्श संगम पर रखने की आवश्यकता है। इसे ध्यान में रखते हुए, अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले प्रत्येक चरण के निष्पादन के बाद सभी गुणवत्ता नियंत्रण चेकपॉइंट विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करेगा कि सभी कदम काम कर रहे हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन के लिए कमी, अभिकर्मक और पारगमन क्षमता की जांच करना महत्वपूर्ण है ( चित्रा 4 में पारगमन दक्षता के लिए एक विशिष्ट परिणाम देखें)। अच्छी प्राथमिक सेल ट्रांसडक्शन दक्षता एक उच्च वायरल टिटर से जुड़ी हुई है। आमतौर पर, बड़े आवेषण के परिणामस्वरूप वायरस टिटर्स18 कम होते हैं। प्रशिक्षण उद्देश्यों के लिए, हम इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किए जा सकने वाले परिणामों का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक खाली वेक्टर का उपयोग करते हैं। हमारे अनुभव में, पारगमन और अभिकर्मक क्षमता सम्मिलित आकार के अनुसार भिन्न होती है, विशेष रूप से वायरल बैकबोन-व्यक्त रिपोर्टर जीन, जैसे जीएफपी को ध्यान में रखते हुए। एक से अधिक जीन की बातचीत का अध्ययन करते समय एक रणनीति का उपयोग किया जा सकता है, प्रत्येक जीन को एक अलग हस्तांतरण वेक्टर में क्लोन करना है, इसके बाद व्यक्तिगत वायरस उत्पादन, और अंत में, लक्ष्य सेल का सह-पारगमन। उस स्थिति में, एकल ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को खत्म करने और केवल सह-ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक चयन चरण लागू किया जा सकता है।

यह ध्यान देने योग्य है कि ओपी 9-डीएल 1 / डीएल 4 स्ट्रोमल फीडर परत सेल लाइनों के बहुमत को आनुवंशिक रूप से डीएल 1 या डीएल 4 निर्माण7 के हिस्से के रूप में जीएफपी को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हमने एक रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग किया जो जीएफपी को भी व्यक्त करता है; हालांकि, यह ओपी 9-डीएल 4 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त जीएफपी प्रोटीन की तुलना में उज्जवल है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत सह-संस्कृति की कल्पना करते समय पारगमन निरीक्षण में हस्तक्षेप नहीं करता है।

ओपी 9 कोशिकाएं कई मार्गों के बाद एडिपोसाइट्स में अंतर करती हैं, संस्कृति में लंबी अवधि, या अति-संयोजन की स्थितियों केतहत। यह बड़े रिक्तिकाओं के विकास से स्पष्ट है। इस प्रकार, इन विशेषताओं को प्रस्तुत करने वाले ओपी 9 कोशिकाओं का उपयोग इस प्रोटोकॉल में नहीं किया जाना चाहिए। अत्यधिक कॉन्फ्लुएंट रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से कम वायरस टिटर होगा। दरअसल, सबकॉन्फ्लुएंट चरण तब होता है जब कोशिकाएं सबसे अधिक स्थानांतरित होती हैं। इसके अलावा, कम-संगम रेट्रोवायरस-निर्माता कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से अभिकर्मक प्रक्रिया में सेल तनाव कम हो जाएगा और उच्चतम वायरस टिटर मिलेगा।

हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, हम वायरस सुपरनैटेंट को टाइट नहीं करते हैं, कुछ मामलों में वायरस सुपरनैटेंट अनुमापन पर विचार किया जाना चाहिए, जैसे कि रेट्रोवायरल वेक्टर में एक रिपोर्टर जीन की अनुपस्थिति में, जो वायरल उत्पादन के अप्रत्यक्ष निर्धारण को रोक देगा, या ऐसे मामलों में जहां प्रयोगात्मक डिजाइन को लक्ष्य सेल जीनोम में एकीकृत करने के लिए ट्रांसजीन प्रतियों की अधिक सटीक संख्या की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि रेट्रोवायरल वेक्टर सुपरनैटेंट का टिटर -80 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर काफी कम हो जाता है जब तक कि अनुमापन परिणाम प्राप्त नहीं होते हैं। इसलिए, पारगमन के लिए ताजा तैयार वायरस सुपरनैटेंट का उपयोग करने से बेहतर पारगमन दक्षता प्राप्त होगी।

थाइमस में बड़ी संख्या में डबल-पॉजिटिव (डीपी) थाइमोसाइट्स (85% से अधिक) और लगभग 10% एकल-सकारात्मक15 कोशिकाएं (सीडी 4 या सीडी 8) होती हैं, जो पोस्ट-डीएन चरण थाइमोसाइट्स हैं। डीपी कोशिकाएं रेट्रोवायरल हेरफेर के लिए विट्रो में जीवित नहीं रह सकती हैं, जबकि एसपी कोशिकाएं अपरिवर्तनीय हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को रेट्रोवायरल वेक्टर ट्रांसड्यूसिबल डीएन थाइमोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के इंट्राम्यूरल कार्यक्रम, परियोजना ZIABC009287 द्वारा समर्थित किया गया था। ओपी 9-डीएल 4 डॉ जुआन कार्लोस ज़ुनिगा-पफ्लकर (सनीब्रुक हेल्थ साइंसेज सेंटर, टोरंटो, ओएन, कनाडा) से प्राप्त किया गया था। लेखक ों ने एनसीआई-फ्रेडरिक प्रयोगशाला पशु विज्ञान कार्यक्रम को उनकी निरंतर तकनीकी सहायता और प्रयोगात्मक सलाह और इनपुट के साथ-साथ जेफ कैरेल, मेगन कारवान और किम्बर्ली क्लारमैन को फ्लो साइटोमेट्री सहायता के लिए धन्यवाद दिया। हम महत्वपूर्ण सलाह और इनपुट के लिए हॉवर्ड यंग के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma M3148
ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
BSA Cell Signaling Technology 9998S
CD4 Microbeads Miltenyi 130-049-201
CD8 Microbeads Miltenyi 130-049-401
Centrifuge 5910R eppendorf 5942IP802353
DMEM Corning 10-013-CV
EDTA Invitrogen 15575-038
Fetal calf serum HyClone FBS ThermoScientific  SH30910.03
LD columns Miltenyi 130-042-901
L-glutamine Sigma G7513 Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine
Lipofectamine 2000 Invitrogen P/N 52887
MEM-alpha Medium Gibco 12561-072
OPTI-MEM I Reducing Serum Medium Invitrogen 31985-062
PBS pH 7.2 Corning 21-040-CV
pcL-Eco Plasmid Addgene 12371
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
pMIG Plasmid Addgene 6492
Polybrene Chemicon TR-1003-G
Pre-Separation Filters Miltenyi 130-041-407
recombinant hFLT-3L PeproTech 300-19
recombinant IL-7 Peprotech 217-17
Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco Orbigen RVC-10002
Syringe filter (0.45 µm) Millipore SLHV033RS

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कैंसर अनुसंधान अंक 196 थाइमोसाइट ओपी 9 लिम्फोपोइज़ पारगमन सह-संस्कृति
डेल्टा-जैसे 4-व्यक्त स्ट्रोमल कोशिकाओं पर म्यूरिन थाइमोसाइट्स की सह-संस्कृति और पारगमन टी-सेल ल्यूकेमिया में ऑन्कोजीन का अध्ययन करने के लिए
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Rodrigues, G. O. L., Li, W., Cramer, … More

Rodrigues, G. O. L., Li, W., Cramer, S. D., Winer, H. Y., Hsu, T. C., Gower, T., Hixon, J. A., Durum, S. K. Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia. J. Vis. Exp. (196), e64271, doi:10.3791/64271 (2023).

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