Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie van dubbelnegatieve thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuursysteem (OP9-DL4) voor verdere functionele analyse.
Abstract
Getransduceerde muis onrijpe thymocyten kunnen in vitro worden gedifferentieerd in T-cellen met behulp van het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuur systeem (OP9-DL4). Omdat retrovirale transductie delende cellen vereist voor transgenintegratie, biedt OP9-DL4 een geschikte in vitro omgeving voor het kweken van hematopoietische voorlopercellen. Dit is vooral voordelig bij het bestuderen van de effecten van de expressie van een specifiek gen tijdens de normale ontwikkeling van T-cellen en leukemogenese, omdat het onderzoekers in staat stelt het tijdrovende proces van het genereren van transgene muizen te omzeilen. Om succesvolle resultaten te bereiken, moet een reeks gecoördineerde stappen waarbij verschillende soorten cellen gelijktijdig worden gemanipuleerd, zorgvuldig worden uitgevoerd. Hoewel dit zeer gevestigde procedures zijn, betekent het ontbreken van een gemeenschappelijke bron in de literatuur vaak dat een reeks optimalisaties vereist is, wat tijdrovend kan zijn. Van dit protocol is aangetoond dat het efficiënt is in het transduceren van primaire thymocyten, gevolgd door differentiatie op OP9-DL4-cellen. Hier wordt een protocol beschreven dat kan dienen als een snelle en geoptimaliseerde gids voor de co-cultuur van retroviraal getransduceerde thymocyten op OP9-DL4 stromale cellen.
Introduction
De OP9 beenmerg stromale cellijn biedt een nuttig in vitro systeem voor de inductie van lymfopeese uit verschillende bronnen van voorlopers1. De eerste studies die OP9-cellen gebruikten, toonden aan dat het ontbreken van macrofaagkoloniestimulerende factor (MCSF) -expressie bijdroeg aan het vermogen van de OP9-cellijn om hematopoiese en B-celdifferentiatie van beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen (HSC's) te ondersteunen, zoals later ook werd aangetoond voor embryonale stamcellen (SER's)2,3,4,5 . In eerdere studies maakte de generatie van delta-achtige 1/4-tot expressie brengende OP9-cellen (OP9-DL1/OP9-DL4) de inductie van T-cellijnverbintenis6 mogelijk en toonde het vermogen aan om thymusrijping met succes te recapituleren 7,8. In het kort is de ontwikkeling van T-cellen beschreven door de sequentiële expressie van CD4- en CD8-moleculen. Onrijpe thymocyten zijn "dubbel-negatief" (DN, CD4− CD8−) en kunnen verder worden onderverdeeld volgens de oppervlakte-expressie van CD44 en CD25. DN-thymocyten differentiëren door het onrijpe single-positive (ISP) stadium, gekenmerkt door CD8-expressie bij muizen en CD4 bij mensen, gevolgd door het dubbel-positieve (DP) stadium, gekenmerkt door de co-expressie van CD4 en CD8, en, ten slotte, de volwassen single-positive fase, gekenmerkt door de expressie van CD4 of CD89. HSC's drukken de Notch1-receptor uit, die normaal interageert met de delta-achtige 4 (DL4) die tot expressie komt op thymusepitheelcellen om T-afstammingsdifferentiatie10 te induceren. Vandaar dat de belangstelling voor het OP9-DL1/4-model geleidelijk is toegenomen, wat heeft geleid tot het uitgebreide gebruik van deze aanpak in een breed scala aan toepassingen in de afgelopen twee decennia 8,11,12,13. Hoewel DL1 en DL4 beide in staat zijn om T-celdifferentiatie in vitro te ondersteunen, vertonen ze differentiële vereisten in vivo, en een paar studies hebben gesuggereerd dat OP9_DL4 efficiënter is dan OP9_DL1 bij het samenvatten van de thymusomgeving van de muis 7,14.
Onder de mogelijke toepassingen van het OP9-DL1/4-systeem is er vooral belangstelling voor de combinatie van dit systeem met de transductie van DN-cellen of HSC's met retrovirale vectoren. Deze combinatie is een effectieve manier om genexpressie te manipuleren tijdens normale T-celontwikkeling en leukemogenese en is een efficiënte methode gebleken om de functie van een interessant gen te induceren of te remmen15,16,17. Dit model is bijzonder succesvol gebruikt om de samenwerking tussen de oncogenen die leukemie veroorzaken15 te bestuderen, omdat het flexibel is en het mogelijk maakt om de effecten van meerdere gencombinaties binnen een redelijke tijd te onderzoeken, in tegenstelling tot het genereren van transgene muizen. Bovendien zijn soortgelijke modellen eerder gebruikt om de effecten van het introduceren van oncogenen in normale cellente beoordelen 15,16,17. Bovendien vereist retrovirale transductie delende cellen voor transgenintegratie18, en hoewel lentivirale transductie deze beperking zou overwinnen door de noodzaak van delende cellen voor transgenintegratie te elimineren, zijn we niet in staat geweest om de succesvolle transductie van DN-thymocyten te bereiken met behulp van lentivirale vectoren. OP9-DL1/DL4 is dus een geschikt hulpmiddel voor het kweken van hematopoëtische voorlopercellen.
Het standaardprotocol voor de lymfopeese van getransduceerde thymocyten op OP9-DL4 omvat een reeks gecoördineerde stappen die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd om een succesvol resultaat te bereiken. Hoewel dit technieken zijn die de gemeenschap al vele jaren goed dienen, zijn de protocollen die beschikbaar zijn in de literatuur vaak gefragmenteerd. Als gevolg hiervan wordt elk laboratorium gedwongen om verschillende fasen van de procedure aan te passen en te optimaliseren, wat tijdrovend kan zijn. Hier beschrijft dit protocol de isolatie van DN-thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op OP9-DL4 stromale cellen voor verdere functionele analyse. Van dit vastgestelde protocol is aangetoond dat het efficiënt en reproduceerbaar is bij het transduceren van primaire thymocyten, gevolgd door differentiatie op OP9-DL4-cellen of de inductie van T-cel acute lymfatische leukemie15.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de NIH Institutional Biosafety Committee (IBC) en Animal Care and Use Committee (ACUC). Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt. Raadpleeg de gepubliceerde richtlijnen19 voor meer informatie over retrovirusproducerende celkweek en onderhoudsprocedures. Zie figuur 1 voor een overzicht van het protocol.
1. Start van de kweek van OP9-DL4 cellen (Dag 1)
- Ontdooi OP9-DL4-cellen snel door de injectieflacon vast te houden en voorzichtig te schudden in een waterbad bij 37 °C. Breng de cellen onmiddellijk over in een centrifugebuis met 5 ml van het OP9-medium (MEM-alfamedium, 10% FBS, 50 U/ml penicilline/streptomycine, 55 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine) om de cryoprotectieve middelen te verwijderen.
- Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de cellen in 1 ml OP9-medium.
- Breng 5 ml OP9-medium in een T25-kolf en voeg de geresuspendeerde cellen toe aan deze kolf. Cultuur bij 37 °C en 5% CO2.
- Na 2-3 dagen, subcultuur de cellen met behulp van een 1:3 split (passeer de cellen elke maandag, woensdag en vrijdag).
OPMERKING: Splits de OP9-DL4-cellen voordat ze samenvloeiing bereiken. De OP9-DL4-kolf moet 80%-90% confluent zijn op dag 6-7 en op dag 8-9+ voor co-kweek met thymocyten. Daarom is het belangrijk om te plannen hoeveel OP9-DL4-cellen op die dagen nodig zijn tijdens het splitsen van de OP9-DL4-cellen.- Gooi het medium uit de kolf en was de monolaag met 1x PBS. Gooi de PBS weg, voeg 1 ml 0,25% trypsine toe en incubeer gedurende 1-5 minuten bij 37 °C, of totdat de cellen uit de kolf zijn losgekomen. Stamp op de kolf om de cellen los te maken.
OPMERKING: (Optioneel) De voortgang van celdissociatie kan worden gecontroleerd door microscopie. - Voeg 5 ml OP9-medium toe om de trypsine te inactiveren en resuspensie van de cellen door het met cellen bedekte oppervlak van de kolf tijdens de resuspensie te spoelen.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g en resuspensie in 3 ml OP9-medium (voor een splitsing van 1:3).
- Breng 1 ml van de celsuspensie in een T25-kolf die al 5 ml vers OP9-medium bevat. Bevries/gooi de resterende cellen weg.
- Om de OP9-DL4-cellen te bevriezen, resuspenseert u de cellen in 90% FBS / 10% DMSO in een verhouding van 1 ml vriesmedium tot één injectieflacon met cellen.
- Invriezen in cryovialen van 1 ml bij −80 °C of in vloeibare stikstof, afhankelijk van de toekomstige vereisten. Bewaren in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Gooi het medium uit de kolf en was de monolaag met 1x PBS. Gooi de PBS weg, voeg 1 ml 0,25% trypsine toe en incubeer gedurende 1-5 minuten bij 37 °C, of totdat de cellen uit de kolf zijn losgekomen. Stamp op de kolf om de cellen los te maken.
2. Het starten van de kweek van de retrovirus-producerende cellijn (Dag 1)
- Ontdooi de retrovirusproducerende cellijn snel door de injectieflacon vast te houden en voorzichtig te schudden in een waterbad bij 37 °C. Breng de cellen onmiddellijk over naar een centrifugebuis met 5 ml retrovirus-producerend celmedium (RPC: DMEM, 10% FBS) om het cryoprotectieve middel te verwijderen.
- Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in 1 ml RPC-medium.
- Breng 5 ml RPC-medium in een T25-kolf en voeg de geresuspendeerde cellen toe aan deze kolf. Cultuur bij 37 °C en 5% CO2.
- Passeer de cellen om de 2-3 dagen in een split van 1:5 tot 1:8.
- Stamp op de kolf om de cellen los te maken en resuspensie van de cellen door agressief te pipetteren.
OPMERKING: Deze cellen kunnen van het oppervlak van de kolf worden verwijderd door agressief pipetteren zonder trypsine. Als alternatief, trypsinize (0,05% trypsine / 0,53 mM EDTA) totdat de cellen gemakkelijk loskomen en gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd in een eencellige suspensie.
- Stamp op de kolf om de cellen los te maken en resuspensie van de cellen door agressief te pipetteren.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 × g en resuspensie in 5 ml RPC-medium (voor een splitsing van 1:5).
- Breng 1 ml van de celsuspensie in een T25-kolf die al 5 ml vers RPC-medium bevat. Bevries/gooi de resterende cellen weg. Bevries de retrovirusproducerende cellen op dezelfde manier als beschreven voor OP9-DL4-cellen (stappen 1.4.4.1–1.4.4.2).
3. Beginnen met de kweek van de retrovirus-producerende cellen in 6-well platen (Dag 4-5)
- Zaai de retrovirus-producerende cellen 18-24 uur vóór transfectie bij 70% -90% confluentie in elke put van een 6-well weefselkweekplaat in 2 ml RPC-medium en incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Transfect twee putjes van de retrovirus-producerende cellen voor elke 2-5 × 105 tot 1 × 106 thymocyten die zullen worden getransduceerd.
4. Transfecteren van de retrovirusproducerende cellen om het retrovirus te genereren dat de genen van belang bevat (dag 5-6)
- Vervang het medium 1 uur voor de transfectie door vers RPC-medium.
- Bereid lipofectiemengsels (voor elk putje van een 6-putsplaat - schaal naar behoefte op): Verdun 4 μg DNA (2 μg helperplasmide (pCL-Eco) en 2 μg transferplasmide (pMIG) in 250 μL gereduceerd serummedium. Meng voorzichtig.
- Meng 10 μl transfectiereagens met 250 ml van het gereduceerde serummedium uit stap 4.2. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Combineer na 5 minuten incubatie het verdunde DNA met het verdunde transfectiereagens (totaal volume = 500 μL). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20-25 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg de 500 μL DNA/transfectie-reagensmengsels voorzichtig toe aan de put die de retrovirusproducerende cellen bevat door ze met een cirkelvormige beweging op de cellen te laten vallen. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer te wiegen en incubeer de plaat in een incubator van 37 °C gedurende 16-24 uur.
OPMERKING: Subconfluente cellen (80%-90%) zijn het meest geschikt voor transfectie en genereren mogelijk de hoogste virale titer. Aangezien de retrovirusproducerende cellen zich zeer gemakkelijk van de kolf losmaken, moet u plotselinge bewegingen vermijden bij het hanteren van deze cellen.
5. Het veranderen van het retrovirus-producerende celmedium (dag 6-7)
- Vervang het oude medium ongeveer 16 uur na transfectie door 2 ml vers RPC-medium. Blijf cellen incuberen bij 37 °C gedurende 20-24 uur.
- Evalueer de transfectie-efficiëntie onder een fluorescentiemicroscoop (optioneel).
OPMERKING: In dit protocol zijn GFP-positieve cellen de cellen van belang (zie figuur 2). Deze stap is afhankelijk van de retrovirusvector die is geselecteerd om in dit protocol te gebruiken (of er een reporter-gen aanwezig is in de ruggengraat).
6. Thymocytenbereiding en uitputting van CD4+ en CD8+ cellen (dag 6-7)
- Oogst de thymus van een 4-6 weken oude C57BL/6 muis. Voor meer informatie over het oogsten van thymus, refereer je naar Xing en Hogquist20.
OPMERKING: Muizen werden geëuthanaseerd door CO 2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. - Bereid een thymocyte eencellige suspensie door de thymus in 5 ml PBS in een petrischaal te plaatsen. Gebruik steriele glasglaasjes om de thymus tussen de matte oppervlakken van de dia's te plaatsen en de dia's zachtjes tegen elkaar te wrijven, waarbij de thymus tussen de twee dia's wordt gerold. Spoel de glasglaasjes om de cellen te verzamelen en gooi het resterende thymische stromale weefsel weg.
OPMERKING: De geschatte opbrengst van één thymus is 90 × 10 6-100 × 106 cellen, en ongeveer 1% van de cellen zal overblijven na CD4- en CD8-depletie. Gebruik thymusweefsel van jongere muizen voor een betere opbrengst van cellen, omdat de cellulariteit van de thymus van de muis in de eerste weken na de geboorte snel toeneemt, een plateau bereikt op de leeftijd van 4-6 weken en geleidelijk involuteert vervolgens21. Tel de cellen met behulp van een automatische bloedcelteller of een alternatieve methode. - Filter de thymuspensie door een filter van 30 μm of 40 μm door 5 ml van de thymussuspensie door een celzeef te pipetteren. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 × g .
- Verwijder het supernatant en lyseer de rode bloedcellen met ACK-lysisbuffer door (afhankelijk van de monstergrootte) 1 ml buffer per buis gedurende 1 minuut toe te voegen. Voeg 5 ml celdepletiebuffer toe (500 ml PBS [pH 7,2], 0,5% BSA, 2 mM 0,5 M EDTA, pH 8,0) om de ACK-lysisbuffer te deactiveren, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g en resuspensie in 1-5 ml celdepletiebuffer voor telling.
OPMERKING: Zet het volgende op ijs voor uitputting (pre-depletie): 70 μL celsuspensie om te tellen (varieer dit afhankelijk van de gekozen telcelmethode) en 200 μL celsuspensie om de efficiëntie van depletie te bepalen door kleuring voor CD4 en CD8 en analyse door flowcytometrie22,23. - Tel de cellen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 × g . Resuspendie van de cellen bij 1 × 107/80 μL celdepletiebuffer. Voeg 10 μL elk van CD4 en CD8 microbeads per 1 × 107 cellen toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker in de koelkast (2-8 °C).
- Bereid een depletiekolom voor door deze af te spoelen met 2 ml depletiebuffer en de doorstroming weg te gooien.
- Was de cellen vanaf stap 6.6 door 1-2 ml depletiebuffer per 1 × 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 × g . Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Resuspendeer tot 1,25 × 108 cellen in 500 μL depletiebuffer. Pas de celsuspensie toe op de kolom en verzamel de doorstroom (niet-gelabelde cellen). Was de kolom 2x met 1 ml buffer en vang de doorstroming op.
OPMERKING: Voeg alleen een nieuwe buffer toe als het kolomreservoir leeg is. Zet het volgende opzij op ijs na depletie (controle na depletie): 70 μL celsuspensie om te tellen (varieer dit afhankelijk van de gekozen telcelmethode) en 1.000 μL celsuspensie om de efficiëntie van uitputting te bepalen door kleuring voor CD4 en CD8 en analyse door flowcytometrie22,23. - Bevlek de uitputtingsefficiëntiecontroles door de 200 μL cellen die vóór de uitputting zijn verzameld, te splitsen in vier FACS-buizen: ongekleurd, CD4 enkelgekleurd, CD8 enkelgekleurd en CD4 / CD8 dubbel gekleurd (gebruik de niet-gekleurde en enkelgekleurde monsters om de flowcytometrieparameters in te stellen). Gebruik de 1.000 μL cellen verzameld na depletie om te kleuren voor CD4 en CD8 en vergelijk met het dubbel gekleurde monster verzameld vóór de uitputting (zie typische uitputtingsresultaten in figuur 3).
OPMERKING: Pas de volumes voor flowcytometriekleuring aan volgens de aanbeveling van de fabrikant van het antilichaam (bijv. 1 μL anti-CD4-FITC + 0,5 μL anti-CD8-PE per 1 x 106 cellen in 50 μL buffer).
7. Het kweken van thymocyten op OP9-DL4 cellen (dag 6-7)
- Plaats 2-5 × 105 tot 1 × 106 thymocyten na depletie in een T25-kolf van 80%-90% confluente OP9-DL4-cellen in OP9-medium met cytokines (10 ng/ml recombinant IL-7 en recombinant hFLT-3). Cultuur bij 37 °C en 5% CO2. Kweek ongeveer 24 uur op OP9-DL4-cellen.
OPMERKING: Deze duur is nodig om de T-cellen overdraagbaar te maken (zie een typisch resultaat in figuur 4). Reserveer één T25-kolf van de cocultuur van thymocyten en OP9-DL4-cellen voor gebruik als controle (niet-transduceerd). De niet-getransduceerde thymocyten worden samen met de getransduceerde thymocyten (stap 9.1) gekleurd als een negatieve controle om de transductie-efficiëntie te evalueren. Niet-getransduceerde thymocyten kunnen ook worden gebruikt om het effect van de transgenexpressie op celdifferentiatie te meten. Gooi het cytokine-bevattende medium na 1 maand weg.
8. Het retrovirus uit het supernatant oogsten en gebruiken om de thymocyten te transduceren (dag 8-9)
- Verzamel het supernatant met de retrovirussen uit de getransfecteerde cellen door de 6-putplaat te kantelen en een spuit van 3-5 ml aan de onderkant van de plaat te plaatsen terwijl u aan de zuiger trekt om het supernatant op te zuigen. Vervang het medium door 2 ml vers RPC-medium. Blijf de cellen incuberen bij 37 °C gedurende 20-24 uur voor de tweede transductie in stap 8.9.
- Filter het retrovirussupernatant door een spuitfilter van 0,45 μm en verzamel het filtraat in een buis van 50 ml.
OPMERKING: Bevries het retrovirale supernatant niet. Gebruik een vers gemaakt viruspreparaat voor transductie. - Verzamel thymocyten uit de OP9-DL4-cultuur door agressief pipetteren om de thymocyten en OP9-DL4-cellen van het kolfoppervlak te verwijderen. Filter de celsuspensie door een celzeef van 40 μm om de meeste OP9-DL4-cellen te verwijderen en verzamel het filtraat in een buis van 50 ml.
OPMERKING: OP9-cellen zijn zeer hechtend. Hoewel agressief pipetteren een deel van de OP9-DL4-cellen uit de kolf kan verwijderen, is de verstoring van de OP9-DL4-monolaag tijdens dit proces minimaal en worden de OP9-DL4-cellen die loskomen gefilterd met de 40 μm celzeef, omdat de OP9-DL4-cellen veel groter zijn dan de primaire thymocyten. Als de OP9-DL4-cellen nog steeds 80%-90% confluent zijn, verwijdert u de thymocyten en plaatst u ze opnieuw in dezelfde OP9-DL4-kolf. Als alternatief moet een nieuwe OP9-DL4-kolf worden voorbereid. - Centrifugeer de thymocyten in het filtraat vanaf stap 8.3 bij 300 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer in de buis van 50 ml de thymocyten in 0,5-1 ml OP9-medium + cytokines (zie stap 7.1). Voeg 1-2 ml RPC-medium toe dat het virus bevat (tweemaal zoveel RPC-medium als thymocytenmedium). Voeg hexamethrinebromide (10 μg/μL stamconcentratie) toe om 8 μg hexamethrinebromide/ml totale celsuspensie te verkrijgen.
- Spinoculeer door de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur bij 850 × g te centrifugeren.
- Resuspendie van de cellen in 6 ml OP9-medium + cytokines per kolf (zie stap 7.1) en voeg de suspensie weer toe aan de OP9-DL4-celmonolaag.
OPMERKING: U kunt ook nieuwe OP9-DL4-kolven klaarzetten om de getransduceerde thymocyten te ontvangen. Als de thymocyten terug in een gebruikte OP9-DL4-kolf moeten worden geplaatst, zorg er dan voor dat u vers OP9-medium aan de OP9-DL4-cellen toevoegt tijdens de 1 uur van thymocytenspinoculatie om de cellen gezond te houden en 80% -90% confluentie te garanderen. - Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Herhaal stap 8.2-8.7 met behulp van een nieuwe put van het retrovirusbevattende celsupernatant.
9. Het handhaven van getransduceerde thymocyten op OP9-DL4-cultuur gedurende 2-5 dagen of invriezen indien nodig (dag 9+)
- Beoordeel de thymocytendifferentiatie door flowcytometrie door thymocyten te kleuren voor T-celontwikkelingsmarkers zoals CD4, CD8, CD25 en CD4423. Zie typische thymocytendifferentiatieresultaten in figuur 5.
Representative Results
De depletie-efficiëntie kan cytometrisch worden beoordeeld door de magnetisch niet-gelabelde celfractie voor CD4 en CD8 na immunomagnetische celscheiding (MACS) te labelen en deze te analyseren op een tweedimensionale bivariate dot-plot (figuur 3). Een goede opbrengst van dubbelnegatieve (CD4−, CD8−) cellen is 95% of hoger, zoals weergegeven in figuur 3. Twee van de meest voorkomende oorzaken van een lagere opbrengst zijn de misrekening van de microbeads op basis van het aantal cellen en het aantal gelabelde cellen dat de kolomcapaciteit overschrijdt. Het wordt aanbevolen om het juiste aantal MACS-kolommen te kiezen op basis van het aantal gelabelde cellen. Bij het werken met thymocyten is het aantal gelabelde cellen (DP- en SP-cellen) bijna gelijk aan het aantal totale cellen (meer dan 96%). Celtelling kan worden gedaan in een automatische celteller, een Neubauer-kamer of met een alternatieve methode. Als gevolg hiervan moeten de volumes die zijn toegewezen voor het tellen van cellen mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de specifieke machine en de gekozen telmethode.
Het is belangrijk om het aantal cellen te bepalen dat aanwezig is voor en na uitputting. Deze celtellingen zijn nodig om het aantal benodigde LD-depletiekolommen te berekenen en om de DN-thymocyten gelijkmatig te verdelen over het juiste aantal OP9-DL4-kolven. De controles voor flowcytometrie (niet-gelabelde cellen, cellen gelabeld voor CD4 en cellen gelabeld voor CD8) kunnen worden uitgevoerd met het gereserveerde pre-depletiemonster, omdat dit meer cellen bevat. Omdat echter wordt verwacht dat de meeste cellen in de kolom worden bewaard, heeft het te labelen monster na depletie een hoger volume nodig. Daarom kan het nodig zijn om aanpassingen aan te brengen volgens het gekozen etiketteringsprotocol.
Bij gebruik van vectoren die screenbare markers tot expressie brengen, zoals een fluorescentiegen, kunnen de transfectie en transductie ruw en empirisch worden beoordeeld door fluorescentiemicroscopie (figuur 2). De transductie-efficiëntie kan worden geanalyseerd door de thymocyt uit de OP9-DL4-monolaag te oogsten, zoals beschreven in stap 8.3, en te kijken naar de expressie van een fluorescentiegen door flowcytometrie. De efficiëntie van transductie met behulp van een lege retrovirale vector met GFP als reportergen was 84,2% (figuur 4).
T-celdifferentiatie op OP9-DL4-cellen kan 4 dagen na transductie worden waargenomen. Flowcytometrie wordt meestal uitgevoerd om de celdifferentiatie geïnduceerd door de co-cultuur op OP9-DL4-cellen en / of de transgenexpressie te beoordelen, zoals weergegeven in figuur 5, waar de cellen werden gelabeld voor CD4, CD8, CD44 en CD25. Er zijn verschillende mogelijke combinaties van celoppervlakmolecuullabeling waarvan is aangetoond dat ze nuttig zijn voor het onderzoeken van de moleculaire en cellulaire mechanismen van T-celontwikkeling bij muizen24,25,26,27. Daarom kunnen de panelen van fluorescerende antilichamen variëren afhankelijk van de vraag van belang die wordt behandeld. De transductie van DN-thymocyten met de lege retrovirale vector pMIG, weergegeven in paneel B, vertoonde ongeveer dezelfde verhoudingen van enkele positieven (CD4+ of CD8+), dubbele positieven (CD4+/CD8+), dubbele negatieven (CD4−/CD8−), en de substadia dubbel-negatief 1-4 (DN1-DN4) als de niet-getransduceerde thymocyten, weergegeven in paneel A, wat aangeeft dat de ontwikkeling van T-cellen niet werd beïnvloed door het transductieproces.
Figuur 1: Diagram van de stappen van thymocytenisolatie, transductie en co-cultuur. Afkorting: DN = dubbel-negatief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Co-cultuur fluorescentiemicroscopie van GFP-getransduceerde thymocyten of niet-getransduceerde thymocyten en OP9-DL4-cellen. (A) Niet-getransduceerde thymocyten en (B) stabiele GFP-tot expressie brengende muizenthymocyten op OP9-DL4 op dag 3 na de tweede transductie. Er werd gebruik gemaakt van een Olympus-IX71 fluorescentiemicroscoop met een 40x lens en een 480/30 filter geschikt voor GFP detectie. Schaalbalk = 40 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; DN = dubbel-negatief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Flowcytometrie van thymocytendepletie. Representatieve flowcytometrieplots analyseren de expressie van CD4 en CD8 op thymocyten verkregen uit 7-8 weken oude C57BL / 6J vrouwelijke muizen (A) pre-depletie en (B) post-depletie van CD4 + en CD8 + met behulp van microbeads en LD-kolommen volgens de instructies van de fabrikant. De stippenplots aan de linkerkant tonen poorten op basis van de grootte en complexiteit van het evenement (respectievelijk FCS-A en SSC-A). Het middelste paneel toont FSC-H versus FSC-A om enkele cellen te gaten en doubletten uit te sluiten. In de plots aan de rechterkant werden cellen gedefinieerd als CD4 en CD8 van de eencellige poort. Afkortingen: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = fycoerythrin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Flowcytometrie van de retrovirale transductie-efficiëntie van thymocyten. (A) niet-getransduceerde thymocyten die samen op OP9-DL4 zijn gekweekt; (B) retroviraal getransduceerde thymocyten op OP9-DL4 op dag 3 na transductie. Afkortingen: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = fycoerythrin; DN = dubbel-negatief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Flowcytometrie van getransduceerde thymocyten na 4 dagen OP9-DL4 co-cultuur. (A) Niet-getransduceerd en (B) getransduceerd met pMIG retrovirus. De cellen werden eerst gated op levende cellen en vervolgens gated op basis van grootte en complexiteit (respectievelijk FCS-A en SSC-A), gevolgd door het plotten van FSC-H versus FSC-A om op afzonderlijke cellen te gaan en doubletten uit te sluiten. Voor niet-getransduceerde cellen gebruikten we de volgende poortstrategie. Vanuit de eencellige poort werden de cellen gedefinieerd als enkele positieven (CD4+ of CD8+), dubbele positieven (CD4+/CD8+) en dubbele negatieven (CD4−/CD8−). Vervolgens werden de cellen vanaf de dubbele negatieven (CD4−/CD8−) gate gedefinieerd als CD44+, CD25+, CD44+/CD25+ en CD44−/CD25−, zoals weergegeven in paneel A. Voor de pMIG-getransduceerde cellen, weergegeven in paneel B, werden de cellen van de eencellige poort eerst gedefinieerd als GFP + / GFP−, en vervolgens van GFP + -cellen, werd de celpopulatieverdeling in de belangrijkste T-celontwikkelingsstadia, zoals gedefinieerd door CD4, CD8, CD44 en CD25-expressie, bepaald met behulp van dezelfde poortstrategie als voor de niet-getraduceerde cellen. Afkortingen: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het hier beschreven protocol is speciaal ontwikkeld voor thymus-afgeleide DN (CD4−/CD8−) T-celstudies met retrovirale transfectie gevolgd door een OP9-DL4 differentiatiemodel. Het is echter waarschijnlijk dat de doelcellen die zullen worden onderworpen aan dit protocol van transductie gevolgd door celdifferentiatie een breder interdisciplinair nut zullen hebben. Dus, naast onrijpe thymocyten, kunnen hematopoëtische stamcellen, zoals cellen afkomstig van foetale lever of beenmerg, mogelijk in dit protocol worden gebruikt.
Het OP9-DL4-systeem heeft bewezen een effectief model te zijn om de genfunctie in verschillende aspecten te bestuderen, waaronder celdifferentiatie17 en oncogenese15. Hoewel de retrovirale modificatie van hematopoietische voorlopercellen een gevestigde techniek is die stabiele genetische modificatie mogelijk maakt, vereist het combineren van de inductie van celdifferentiatie op het OP9-DL4-systeem en retrovirale transductie zorg en vaardigheid. Het kritieke aspect voor het behalen van succes met dit protocol is ervoor te zorgen dat alle stappen goed worden gecoördineerd, omdat het protocol drie verschillende celtypen gebruikt die gezond moeten worden gehouden en op de ideale samenvloeiing die nodig is voor elke specifieke fase. Met dat in gedachten is het belangrijk om alle kwaliteitscontrolepuntanalyses uit te voeren na de uitvoering van elke stap voordat u doorgaat naar de volgende stap. Dit zorgt ervoor dat alle stappen werken. Daarom is het controleren van de uitputtings-, transfectie- en transductie-efficiëntie belangrijk voor de succesvolle uitvoering van dit protocol (zie een typisch resultaat voor transductie-efficiëntie in figuur 4). Een goede primaire celtransductie-efficiëntie is gekoppeld aan een hoge virale titer. Doorgaans resulteren grotere inserts in lagere virustiters18. Voor trainingsdoeleinden gebruiken we een lege vector om de resultaten weer te geven die met dit protocol kunnen worden verkregen. In onze ervaring variëren de transductie- en transfectie-efficiënties afhankelijk van de insertgrootte, vooral gezien de virale backbone-expressing reportergenen, zoals GFP. Een strategie die kan worden gebruikt bij het bestuderen van de interactie van meer dan één gen is om elk gen te klonen in een andere overdrachtsvector, gevolgd door individuele virusproductie en ten slotte co-transductie van de doelcel. In dat geval kan een selectiestap worden toegepast om de afzonderlijk getransduceerde cellen te elimineren en alleen de gecotransduceerde cellen te behouden.
Het is vermeldenswaard dat de meerderheid van de OP9-DL1 / DL4 stromale feederlaagcellijnen genetisch zijn gemanipuleerd om GFP uit te drukken als onderdeel van de DL1- of DL4-constructies7. In dit protocol gebruikten we een retrovirale vector die ook GFP uitdrukt; het is echter helderder dan het GFP-eiwit dat wordt uitgedrukt door OP9-DL4-cellen en interfereert niet met de transductie-inspectie bij het visualiseren van de co-cultuur onder de fluorescentiemicroscoop.
OP9-cellen differentiëren in adipocyten na vele passages, lange perioden in cultuur of onder omstandigheden van over-confluentie19. Dit blijkt uit de ontwikkeling van grote vacuolen. Op9-cellen met deze kenmerken mogen dus niet in dit protocol worden gebruikt. Transfecterende te confluente retrovirus-producerende cellen zullen resulteren in een lage virustiter. Inderdaad, het subconfluente stadium is wanneer de cellen het meest transfeceerbaar zijn. Bovendien zal het transfecteren van retrovirusproducerende cellen met een lage confluentie de celstress in het transfectieproces verminderen en de hoogste virustiter geven.
Hoewel we in dit protocol het virussupernatant niet titreren, moet in sommige gevallen rekening worden gehouden met titratie van virussupernatanten, zoals bij afwezigheid van een reportergen in de retrovirale vector, wat de indirecte bepaling van virale productie zou voorkomen, of in gevallen waarin het experimentele ontwerp vereist dat een nauwkeuriger aantal transgenkopieën in het doelcelgenoom wordt geïntegreerd. Het is echter belangrijk op te merken dat de titer van retroviraal vectorsupernatant aanzienlijk afneemt wanneer deze wordt bewaard bij −80 °C of 4 °C totdat de titratieresultaten zijn verkregen. Daarom zal het gebruik van vers bereid virussupernatant voor transductie een betere transductie-efficiëntie opleveren.
De thymus bevat een groot aantal dubbel-positieve (DP) thymocyten (meer dan 85%) en ongeveer 10% single-positive15 cellen (CD4 of CD8), die de post-DN stadium thymocyten zijn. De DP-cellen kunnen niet in vitro overleven voor retrovirale manipulatie, terwijl de SP-cellen niet overdraagbaar zijn. Daarom kan dit protocol worden toegepast om retrovirale vector transduceerbare DN-thymocyten te genereren.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het intramurale programma van het National Cancer Institute, project ZIABC009287. OP9-DL4 werd verkregen van Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Canada). De auteurs bedanken het NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program voor hun voortdurende technische assistentie en experimenteel advies en input, evenals Jeff Carrel, Megan Karwan en Kimberly Klarmann voor flowcytometrie-assistentie. We zijn Howard Young dankbaar voor kritisch advies en input.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
- Zuniga-Pflucker, J. C.
- Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science. 272 (5262), 722-724 (1996).
- Ueno, H., et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).
- Jaleco, A. C., et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation. Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).
- Mohtashami, M., et al. Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).
- Mazzucchelli, R., Durum, S. K. Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).
- Robey, E. A., Bluestone, J. A. Notch signaling in lymphocyte development and function. Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).
- Lavaert, M., et al. Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes. Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).
- Roh, K. H., Roy, K. Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis. Biomaterials Research. 20 (20), (2016).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).
- Cramer, S. D., et al. Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).
- Treanor, L. M., et al. Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential. Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).
- Yokoyama, K., et al. In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).
- Simmons, A., Alberola-Ila, J. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors. Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).
- Retroviral systems. , Nolan Lab. Available from: https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html (2022).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).
- Gray, D. H., et al. Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells. Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).
- Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).
- Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system. BD Biosciences–Application Note. , (2012).
- Sakaguchi, N., et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).
- He, X., Park, K., Kappes, D. J. The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment. Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).
- Wang, Y., et al. A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling. PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).
- Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program. Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).
