Summary
Denne protokollen beskriver isolering av dobbeltnegative tymocytter fra musens thymus etterfulgt av retroviral transduksjon og kokultur på det deltalignende 4-uttrykkende benmargsstromale cellelinjedyrkningssystemet (OP9-DL4) for videre funksjonell analyse.
Abstract
Transducerte mus umodne tymocytter kan differensieres til T-celler in vitro ved hjelp av delta-lignende 4-uttrykkende benmarg stromale cellelinje co-kultur system (OP9-DL4). Siden retroviral transduksjon krever deling av celler for transgenintegrasjon, gir OP9-DL4 et egnet in vitro-miljø for dyrking av hematopoietiske stamceller. Dette er spesielt fordelaktig når man studerer effekten av ekspresjonen av et bestemt gen under normal T-celleutvikling og leukemogenese, da det tillater forskere å omgå den tidkrevende prosessen med å generere transgene mus. For å oppnå vellykkede resultater må en rekke koordinerte trinn som involverer samtidig manipulering av forskjellige typer celler utføres nøye. Selv om dette er svært veletablerte prosedyrer, betyr mangelen på en felles kilde i litteraturen ofte at det kreves en rekke optimaliseringer, noe som kan være tidkrevende. Denne protokollen har vist seg å være effektiv i transdusering av primære tymocytter etterfulgt av differensiering på OP9-DL4-celler. Detaljert her er en protokoll som kan tjene som en rask og optimalisert guide for samkulturen av retroviralt transducerte tymocytter på OP9-DL4 stromale celler.
Introduction
OP9 benmarg stromale cellelinje gir et nyttig in vitro system for induksjon av lymfopoiese fra flere kilder til forfedre1. De første studiene som brukte OP9-celler viste at mangelen på makrofagkolonistimulerende faktor (MCSF) -uttrykk bidro til OP9-cellelinjens evne til å støtte hematopoiesis og B-celledifferensiering fra benmargsavledede hematopoietiske stamceller (HSC), som senere også ble vist for embryonale stamceller (ESC)2,3,4,5 . I tidligere studier har genereringen av delta-lignende 1/4-uttrykkende OP9-celler (OP9-DL1/OP9-DL4) muliggjort induksjon av T-celleavstamningsforpliktelse6 og demonstrert evnen til å rekapitulere tymisk modning 7,8. Kort fortalt har T-celleutvikling blitt beskrevet ved sekvensiell ekspresjon av CD4- og CD8-molekyler. Umodne tymocytter er "dobbeltnegative" (DN, CD4− CD8−) og kan videre deles inn i henhold til overflateuttrykket av CD44 og CD25. DN-tymocytter skiller seg gjennom det umodne enkeltpositive (ISP) stadiet, karakterisert ved CD8-uttrykk hos mus og CD4 hos mennesker, etterfulgt av det dobbelt-positive (DP) stadiet, karakterisert ved samuttrykk av CD4 og CD8, og til slutt det modne enkeltpositive stadiet, karakterisert ved uttrykket av CD4 eller CD89. HSC uttrykker Notch1-reseptoren, som normalt interagerer med den deltalignende 4 (DL4) uttrykt på tymiske epitelceller for å indusere T-avstamningsdifferensiering10. Derfor har interessen for OP9-DL1/4-modellen gradvis økt, noe som har ført til utstrakt bruk av denne tilnærmingen i et bredt spekter av applikasjoner de siste to tiårene 8,11,12,13. Selv om DL1 og DL4 begge er i stand til å støtte T-celledifferensiering in vitro, viser de differensielle krav in vivo, og noen få studier har antydet at OP9_DL4 er mer effektiv enn OP9_DL1 i å rekapitulere musens tymiske miljø 7,14.
Blant de potensielle anvendelsene av OP9-DL1/4-systemet er det spesiell interesse for kombinasjonen av dette systemet med transduksjon av DN-celler eller HSC-er med retrovirale vektorer. Denne kombinasjonen er en effektiv måte å manipulere genuttrykk under normal T-celleutvikling og leukemogenese og har vist seg å være en effektiv metode for å indusere eller hemme funksjonen til et gen av interesse15,16,17. Denne modellen har blitt spesielt vellykket brukt til å studere samarbeidet mellom onkogenene som driver leukemi15, da den er fleksibel og muliggjør undersøkelse av effekten av flere genkombinasjoner på rimelig tid, i motsetning til å generere transgene mus. Videre har lignende modeller blitt brukt tidligere for å vurdere effekten av å introdusere onkogener i normale celler15,16,17. I tillegg krever retroviral transduksjon å dele celler for transgenintegrasjon18, og mens lentiviral transduksjon ville overvinne denne begrensningen ved å eliminere behovet for å dele celler for transgenintegrasjon, har vi ikke vært i stand til å oppnå vellykket transduksjon av DN-tymocytter ved bruk av lentivirale vektorer. Dermed er OP9-DL1 / DL4 et egnet verktøy for dyrking av hematopoietiske stamceller.
Standardprotokollen for lymfopoiesen av transducerte tymocytter på OP9-DL4 innebærer en rekke koordinerte trinn som må utføres nøye for å oppnå et vellykket resultat. Selv om dette er teknikker som har tjent samfunnet godt i mange år, er ofte protokollene som er tilgjengelige i litteraturen fragmenterte. Som et resultat er hvert laboratorium tvunget til å tilpasse og optimalisere ulike stadier av prosedyren, noe som kan være tidkrevende. Her beskriver denne protokollen isoleringen av DN-tymocytter fra musens thymus, etterfulgt av retroviral transduksjon og kokultur på OP9-DL4 stromale celler for videre funksjonell analyse. Denne etablerte protokollen har vist seg å være effektiv og reproduserbar ved transdusering av primære tymocytter, etterfulgt av differensiering på OP9-DL4-celler eller induksjon av T-celle akutt lymfoblastisk leukemi15.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøk ble godkjent av NIH Institutional Biosafety Committee (IBC) og Animal Care and Use Committee (ACUC). Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle reagensene og materialene som brukes i denne protokollen. Se publiserte retningslinjer19 for mer informasjon om retrovirus-produsentcellekultur og vedlikeholdsprosedyrer. Se figur 1 for en oversikt over protokollen.
1. Starte kulturen av OP9-DL4-celler (dag 1)
- Tine OP9-DL4-cellene raskt ved å holde i hetteglasset og riste forsiktig i et vannbad ved 37 °C. Overfør umiddelbart cellene til et sentrifugerør inneholdende 5 ml av OP9-mediet (MEM-alfa-medium, 10% FBS, 50 U / ml penicillin / streptomycin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin) for å fjerne kryobeskyttelsesmidlene.
- Sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml OP9-medium.
- Plasser 5 ml OP9-medium i en T25-kolbe, og tilsett de resuspenderte cellene til denne kolben. Dyrkning ved 37 °C og 5 % CO2.
- Etter 2-3 dager, subkultur cellene ved hjelp av en 1: 3 splitt (passere cellene hver mandag, onsdag og fredag).
MERK: Del OP9-DL4-cellene før de når sammenløp. OP9-DL4-kolben må være 80 %–90 % sammenflytende på dag 6–7 og på dag 8–9+ for samkultur med tymocytter. Derfor er det viktig å planlegge hvor mange OP9-DL4-celler som kreves på disse dagene mens du deler OP9-DL4-cellene.- Kast mediet fra kolben, og vask monolaget med 1x PBS. Kast PBS, tilsett 1 ml 0,25 % trypsin og inkuber i 1–5 minutter ved 37 °C, eller til cellene har løsnet fra kolben. Dunk kolben for å løsne cellene.
MERK: (Valgfritt) Fremdriften av celledissosiasjon kan kontrolleres ved mikroskopi. - Tilsett 5 ml OP9-medium for å deaktivere trypsinet, og resuspender cellene ved å skylle den celledekkede overflaten av kolben under resuspensjon.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 × g i 5 minutter ved romtemperatur og resuspender i 3 ml OP9-medium (for en 1:3-deling).
- Plasser 1 ml av cellesuspensjonen i en T25-kolbe som allerede inneholder 5 ml ferskt OP9-medium. Frys/kast de gjenværende cellene.
- For å fryse OP9-DL4-cellene, resuspender cellene i 90% FBS / 10% DMSO i et forhold på 1 ml frysemedium til ett hetteglass med celler.
- Frys i 1 ml kryovialer ved -80 °C eller i flytende nitrogen, avhengig av fremtidige behov. Oppbevares i flytende nitrogen for langvarig lagring.
- Kast mediet fra kolben, og vask monolaget med 1x PBS. Kast PBS, tilsett 1 ml 0,25 % trypsin og inkuber i 1–5 minutter ved 37 °C, eller til cellene har løsnet fra kolben. Dunk kolben for å løsne cellene.
2. Starte kulturen av retrovirus-produsentens cellelinje (dag 1)
- Tine cellelinjen til retrovirusprodusenten raskt ved å holde hetteglasset og riste forsiktig i et vannbad ved 37 °C. Overfør umiddelbart cellene til et sentrifugerør inneholdende 5 ml retrovirus-produsentcellemedium (RPC: DMEM, 10% FBS) for å fjerne kryobeskyttelsesmiddelet.
- Sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml RPC-medium.
- Plasser 5 ml RPC-medium i en T25-kolbe, og tilsett de resuspenderte cellene til denne kolben. Dyrkning ved 37 °C og 5 % CO2.
- Pass cellene hver 2-3 dager på en 1: 5 til 1: 8 splitt.
- Dunk kolben for å løsne cellene, og resuspendere cellene ved å pipette aggressivt.
MERK: Disse cellene kan fjernes fra kolbeoverflaten ved aggressiv pipettering uten trypsin. Alternativt trypsiniserer (0,05% trypsin / 0,53 mM EDTA) til cellene lett løsner og lett kan pipetteres inn i en enkeltcellesuspensjon.
- Dunk kolben for å løsne cellene, og resuspendere cellene ved å pipette aggressivt.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 × g i 5 minutter, og resuspender i 5 ml RPC-medium (for en splitt på 1:5).
- Plasser 1 ml av cellesuspensjonen i en T25-kolbe som allerede inneholder 5 ml ferskt RPC-medium. Frys/kast de gjenværende cellene. Frys retrovirus-produsentcellene på samme måte som beskrevet for OP9-DL4-celler (trinn 1.4.4.1–1.4.4.2).
3. Begynner kulturen til retrovirus-produsentcellene i 6-brønnsplater (dag 4-5)
- Frø retrovirus-produsentcellene 18-24 timer før transfeksjon ved 70%-90% konfluens i hver brønn av en 6-brønns vevskulturplate i 2 ml RPC-medium, og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: Transfekt to brønner av retrovirus-produsentceller for hver 2-5 × 105 til 1 × 106 tymocytter som vil bli transducert.
4. Transfektere retrovirus-produsentcellene for å generere retroviruset som inneholder genene av interesse (dag 5-6)
- Bytt ut mediet med ferskt RPC-medium 1 time før transfeksjon.
- Forbered lipofeksjonsblandinger (for hver brønn i en 6-brønnsplate - skaler opp etter behov): Fortynn 4 μg DNA (2 μg hjelperplasmid (pCL-Eco) og 2 μg overføringsplasmid (pMIG) i 250 μL redusert serummedium. Bland forsiktig.
- Bland 10 μl transfeksjonsreagens med 250 uL av det reduserte serummediet fra trinn 4.2. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Etter 5 min inkubasjon, kombiner det fortynnede DNA med fortynnet transfeksjonsreagens (totalt volum = 500 μL). Bland forsiktig, og rug i 20–25 min ved romtemperatur.
- Tilsett 500 μL DNA/transfeksjonsreagensblandinger forsiktig til brønnen som inneholder retrovirus-produsentcellene ved å slippe på cellene med en sirkulær bevegelse. Bland forsiktig ved å vugge platen frem og tilbake, og rug platen i en 37 °C inkubator i 16–24 timer.
MERK: Subkonfluente celler (80%–90%) er best egnet for transfeksjon og potensielt generere den høyeste virale titeren. Siden retrovirus-produsentcellene løsner veldig lett fra kolben, unngå plutselige bevegelser når du håndterer disse cellene.
5. Endring av retrovirusprodusentens cellemedium (dag 6–7)
- Erstatt det gamle mediet ca. 16 timer etter transfeksjon med 2 ml ferskt RPC-medium. Fortsett å inkubere celler ved 37 °C i 20–24 timer.
- Evaluer transfeksjonseffektiviteten under et fluorescensmikroskop (valgfritt).
MERK: I denne protokollen er GFP-positive celler cellene av interesse (se figur 2). Dette trinnet avhenger av retrovirusvektoren som er valgt for bruk i denne protokollen (om et reportergen er tilstede i ryggraden).
6. Klargjøring av thymocytt og uttømming av CD4+- og CD8+-celler (dag 6–7)
- Høst thymus fra en 4-6 uker gammel C57BL/6 mus. For ytterligere detaljer om tymushøsting, se Xing og Hogquist20.
MERK: Mus ble avlivet ved CO2 -innånding etterfulgt av cervikal dislokasjon. - Forbered en tymocytt enkeltcellesuspensjon ved å plassere thymus i 5 ml PBS i en petriskål. Bruk sterile glasslysbilder, plasser thymus mellom de frostede overflatene på lysbildene, og gni lysbildene forsiktig sammen, rull thymus mellom de to lysbildene. Skyll glasslysbildene for å samle cellene, og kast bort resten av tymisk stromalvev.
MERK: Det estimerte utbyttet fra en thymus er 90 × 10 6-100 × 106 celler, og ca. 1% av cellene vil forbli etter CD4- og CD8-uttømming. Bruk tymusvev fra yngre mus for et bedre utbytte av celler, siden cellulariteten til musens thymus i de første ukene etter fødselen øker raskt, når et platå ved 4-6 ukers alder, og gradvis involverer senere21. Telle cellene ved hjelp av en automatisk blodcelleteller eller annen metode. - Filtrer den tymiske suspensjonen gjennom et filter på 30 μm eller 40 μm ved å pipetere 5 ml av den tymiske suspensjonen gjennom en cellesil. Sentrifuge cellene ved 300 × g i 10 minutter.
- Fjern supernatanten og lys de røde blodcellene med ACK lysisbuffer ved å legge til (avhengig av prøvestørrelsen) 1 ml buffer per rør i 1 min. Tilsett 5 ml celledeplesjonsbuffer (500 ml PBS [pH 7,2], 0,5 % BSA, 2 mM 0,5 M EDTA, pH 8,0) for å deaktivere ACK-lysebufferen, sentrifuge ved 300 × g i 10 minutter og resuspendere i 1–5 ml celleuttømmingsbuffer for telling.
MERK: Sett til side følgende på is før uttømming (pre-uttømming): 70 μL cellesuspensjon for å telle (varier dette avhengig av valgt tellecellemetode) og 200 μL cellesuspensjon for å bestemme effektiviteten av deplesjon ved farging for CD4 og CD8 og analyse ved flowcytometri22,23. - Tell cellene, og sentrifuge ved 300 × g i 10 minutter. Resuspender cellene ved 1 × 107/80 μL celleuttømmingsbuffer. Tilsett 10 μL hver CD4- og CD8-mikroperler per 1 × 107 celler. Bland godt, og rug i 15 min i mørket i kjøleskapet (2–8 °C).
- Forbered en uttømmingskolonne ved å skylle den med 2 ml uttømmingsbuffer og kaste gjennomstrømningen.
- Vask cellene fra trinn 6,6 ved å tilsette 1–2 ml deplesjonsbuffer per 1 × 107 celler, og sentrifuger ved 300 × g i 10 minutter. Fjern og kast supernatanten.
- Resuspender opptil 1,25 × 108 celler i 500 μL uttømmingsbuffer. Påfør cellesuspensjonen på kolonnen, og samle inn gjennomstrømningen (umerkede celler). Vask kolonnen 2x med 1 ml buffer, og samle gjennomstrømningen.
Legg bare til ny buffer når kolonnereservoaret er tomt. Sett til side følgende på is etter uttømming (kontroll etter uttømming): 70 μL cellesuspensjon som skal telles (varier dette avhengig av valgt tellecellemetode) og 1000 μL cellesuspensjon for å bestemme effektiviteten av uttømming ved farging for CD4 og CD8 og analyse ved flowcytometri22,23. - Flekk uttømmingseffektivitetskontrollene ved å dele 200 μL av celler samlet før uttømming i fire FACS-rør: ufarget, CD4 enkeltfarget, CD8 enkeltfarget og CD4 / CD8 dobbeltfarget (bruk de ufargede og enkeltfargede prøvene for å sette opp flowcytometriparametrene). Bruk 1,000 μL av celler samlet etter uttømming for å flekke for CD4 og CD8 og sammenlign med den dobbeltfargede prøven samlet før uttømming (se typiske uttømmingsresultater i figur 3).
MERK: Juster volumene for farging av flowcytometri i henhold til antistoffprodusentens anbefaling (f.eks. 1 μL anti-CD4-FITC + 0,5 μL anti-CD8-PE per 1 x 106 celler i 50 μL buffer).
7. Dyrking av tymocytter på OP9-DL4-celler (dag 6-7)
- Plasser 2–5 × 105 til 1 × 106 tymocytter etter uttømming i en T25-kolbe med 80 %–90 % konfluente OP9-DL4-celler i OP9-medium som inneholder cytokiner (10 ng/ml rekombinant IL-7 og rekombinant hFLT-3). Dyrkning ved 37 °C og 5 % CO2. Vokse i ca 24 timer på OP9-DL4 celler.
MERK: Denne varigheten er nødvendig for å gjøre T-cellene transduførbare (se et typisk resultat i figur 4). Reserve en T25-kolbe av kokulturen av tymocytter og OP9-DL4-celler som skal brukes som kontroll (utransducert). De utransducerte tymocyttene vil bli farget sammen med de transducerte tymocyttene (trinn 9.1) som en negativ kontroll for å evaluere transduksjonseffektiviteten. Utransducerte tymocytter kan også brukes til å måle effekten av transgenuttrykket på celledifferensiering. Kast det cytokinholdige mediet etter 1 måned.
8. Høsting av retroviruset fra supernatanten og bruk av det til å transdusere tymocyttene (dag 8–9)
- Samle supernatanten som inneholder retrovirusene fra de transfekterte cellene ved å vippe 6-brønnsplaten og plassere en 3-5 ml sprøyte nederst på platen mens du trekker i stempelet for å aspirere supernatanten. Bytt ut mediet med 2 ml ferskt RPC-medium. Fortsett å inkubere cellene ved 37 °C i 20–24 timer for andre transduksjon i trinn 8.9.
- Filtrer retrovirussupernatanten gjennom et 0,45 μm sprøytefilter, og samle filtratet i et 50 ml rør.
MERK: Ikke frys den retrovirale supernatanten. Bruk et nylaget viruspreparat for transduksjon. - Samle tymocytter fra OP9-DL4-kulturen ved aggressiv pipettering for å fjerne tymocyttene og OP9-DL4-cellene fra kolbeoverflaten. Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40 μm cellesil for å fjerne de fleste OP9-DL4-cellene, og samle filtratet i et 50 ml rør.
MERK: OP9-celler er svært tilhengere. Selv om aggressiv pipettering kan fjerne noen av OP9-DL4-cellene fra kolben, er forstyrrelsen av OP9-DL4-monolaget under denne prosessen minimal, og OP9-DL4-cellene som kommer av, vil bli filtrert ut med 40 μm cellesil, siden OP9-DL4-cellene er mye større enn de primære tymocyttene. Hvis OP9-DL4-cellene fortsatt er 80% -90% sammenflytende, fjern tymocyttene og plat dem på nytt i samme OP9-DL4-kolbe. Alternativt må en ny OP9-DL4-kolbe utarbeides. - Sentrifuger tymocyttene i filtratet fra trinn 8,3 ved 300 × g i 5 minutter. Kast supernatanten.
- I 50 ml røret, resuspender tymocyttene i 0,5-1 ml OP9 medium + cytokiner (se trinn 7.1). Tilsett 1–2 ml RPC-medium som inneholder viruset (dobbelt så mye RPC-medium som tymocyttmedium). Tilsett heksametrinbromid (10 μg/μL stamkonsentrasjon) for å gi 8 μg heksametrinbromid/ml total cellesuspensjon.
- Spinokulere ved å sentrifugere cellene ved 850 × g i 1 time ved romtemperatur.
- Resuspender cellene i 6 ml OP9 medium + cytokiner per kolbe (se trinn 7.1), og tilsett suspensjonen tilbake på OP9-DL4-cellemonolaget.
MERK: Alternativt kan du ha nye OP9-DL4-kolber klare til å motta de transducerte tymocyttene. Hvis tymocyttene skal plasseres tilbake i en brukt OP9-DL4-kolbe, må du sørge for å legge til nytt OP9-medium til OP9-DL4-cellene i løpet av 1 time med tymocyttspinokulasjon for å holde cellene sunne og sikre 80% -90% sammenløp. - Inkuber ved 37 °C over natten.
- Gjenta trinn 8.2–8.7 ved hjelp av en ny brønn i den retrovirusholdige cellesupernatanten.
9. Opprettholde transduserte tymocytter på OP9-DL4-kultur i 2-5 dager eller fryse etter behov (dag 9+)
- Vurdere tymocyttdifferensiering ved flowcytometri ved å farge tymocytter for T-celleutviklingsmarkører som CD4, CD8, CD25 og CD4423. Se typiske tymocyttdifferensieringsresultater i figur 5.
Representative Results
Deplesjonseffekten kan vurderes cytometrisk ved å merke den magnetisk umerkede cellefraksjonen for CD4 og CD8 etter immunmagnetisk celleseparasjon (MACS) og analysere denne på et todimensjonalt bivariat punktplott (figur 3). Et godt utbytte av dobbeltnegative (CD4-, CD8-) celler er 95% eller høyere, som representert i figur 3. To av de vanligste årsakene til lavere utbytte er feilberegningen av mikrokulene basert på antall celler og antall merkede celler som overskrider kolonnekapasiteten. Det anbefales å velge riktig antall MACS-kolonner i henhold til antall merkede celler. Når du arbeider med tymocytter, er antall merkede celler (DP og SP-celler) nesten lik antall totale celler (mer enn 96%). Celletelling kan gjøres i en automatisk celleteller, et Neubauer-kammer eller med en hvilken som helst alternativ metode. Som et resultat kan det hende at volumene som er tildelt for celletelling, må justeres avhengig av den spesifikke maskinen og den valgte tellemetoden.
Det er viktig å bestemme antall celler som er tilstede før og etter uttømming. Disse celletellingene er nødvendige for å beregne antall LD-uttømmingskolonner som trengs og for jevnt å fordele DN-tymocyttene til riktig antall OP9-DL4-kolber. Kontrollene for flowcytometri (umerkede celler, celler merket for CD4 og celler merket for CD8) kan utføres med den reserverte predeplesjonsprøven, da denne inneholder flere celler. Men siden de fleste cellene forventes å bli beholdt i kolonnen, vil prøven etter uttømming som skal merkes, kreve et høyere volum. Følgelig kan det hende at justeringer må gjøres i henhold til den valgte merkeprotokollen.
Ved bruk av vektorer som uttrykker screenbare markører, for eksempel et fluorescensgen, kan transfeksjon og transduksjon grovt og empirisk vurderes ved fluorescensmikroskopi (figur 2). Transduksjonseffektiviteten kan analyseres ved å høste tymocytten fra OP9-DL4-monolaget, som beskrevet i trinn 8.3, og se på ekspresjonen av et fluorescensgen ved flowcytometri. Effektiviteten av transduksjon ved bruk av en tom retroviral vektor med GFP som reportergen var 84,2% (figur 4).
T-celledifferensiering på OP9-DL4-celler kan observeres 4 dager etter transduksjon. Flowcytometri utføres vanligvis for å vurdere celledifferensieringen indusert av kokulturen på OP9-DL4-celler og/eller transgenuttrykket, som representert i figur 5, der cellene ble merket for CD4, CD8, CD44 og CD25. Det er flere mulige kombinasjoner av celleoverflatemolekylmerking som har vist seg å være nyttige for å undersøke molekylære og cellulære mekanismer for T-celleutvikling hos mus24,25,26,27. Derfor kan panelene av fluorescerende antistoffer variere i henhold til spørsmålet om interesse som tas opp. Transduksjonen av DN-tymocytter med den tomme retrovirale vektoren pMIG, vist i panel B, presenterte omtrent samme andel enkeltpositive (CD4+ eller CD8+), dobbeltpositive (CD4+/CD8+), dobbeltnegative (CD4−/CD8−) og dens substadier dobbeltnegative 1–4 (DN1–DN4) som de utransducerte tymocyttene, vist i panel A, noe som indikerer at T-celleutviklingen ikke ble påvirket av transduksjonsprosessen.
Figur 1: Diagram over trinnene i tymocyttisolering, transduksjon og samkultur. Forkortelse: DN = dobbel-negativ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fluorescensmikroskopi av GFP-transducerte tymocytter eller utransduserte tymocytter og OP9-DL4-celler. (A) Utransduserte tymocytter og (B) stabile GFP-uttrykkende murine tymocytter på OP9-DL4 på dag 3 etter den andre transduksjonen. Et Olympus-IX71 fluorescensmikroskop med en 40x linse og et 480/30 filter egnet for GFP-deteksjon ble brukt. Skala bar = 40 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; DN = dobbel-negativ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Flowcytometri ved tymocyttdeplesjon. Representative flowcytometriplott som analyserer ekspresjonen av CD4 og CD8 på tymocytter oppnådd fra 7-8 uker gamle C57BL/6J hunnmus (A) pre-uttømming og (B) etter uttømming av CD4+ og CD8+ ved bruk av mikroperler og LD-kolonner i henhold til produsentens instruksjoner. Prikkplottene til venstre viser porter basert på størrelsen og kompleksiteten til hendelsen (henholdsvis FCS-A og SSC-A). Det midterste panelet viser FSC-H versus FSC-A for å gate enkeltceller og ekskludere dubletter. I plottene til høyre ble cellene definert som CD4 og CD8 fra encelleporten. Forkortelser: FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Flowcytometri av tymocyttens retrovirale transduksjonseffektivitet. (A) Utransducerte tymocytter co-dyrket på OP9-DL4; (B) retroviralt transduserte tymocytter på OP9-DL4 ved dag 3 etter transduksjon. Forkortelser: FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; DN = dobbel-negativ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Flowcytometri av transduserte tymocytter etter 4 dagers kokultur av OP9-DL4. (A) Utransdusert og (B) transdusert med pMIG retrovirus. Cellene ble først styrt på levende celler og deretter styrt basert på størrelse og kompleksitet (henholdsvis FCS-A og SSC-A), etterfulgt av plotting av FSC-H versus FSC-A for å gate på enkeltceller og ekskludere dubletter. For utransduserte celler brukte vi følgende portstrategi. Fra encelleporten ble cellene definert som enkeltpositive (CD4+ eller CD8+), dobbeltpositive (CD4+/CD8+) og dobbeltnegative (CD4−/CD8−). Fra dobbeltnegativene (CD4−/CD8−) ble cellene definert som CD44+, CD25+, CD44+/CD25+ og CD44−/CD25−, som vist i panel A. For de pMIG-transducerte cellene, vist i panel B, fra encelleporten, ble cellene først definert som GFP + / GFP - og deretter fra GFP + -celler ble cellepopulasjonsfordelingen i de viktigste T-celleutviklingsstadiene, som definert ved CD4, CD8, CD44 og CD25-uttrykk, bestemt ved hjelp av samme portstrategi som for de uberørte cellene. Forkortelser: FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; FITC = fluoresceinisotiocyanat; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Protokollen beskrevet her ble utviklet spesielt for thymus-avledede DN (CD4−/CD8−) T-cellestudier med retroviral transfeksjon etterfulgt av en OP9-DL4 differensieringsmodell. Imidlertid er det sannsynlig at målcellene som vil bli utsatt for denne transduksjonsprotokollen etterfulgt av celledifferensiering, vil ha en bredere tverrfaglig nytteverdi. Således, i tillegg til umodne tymocytter, kan hematopoietiske stamceller, slik som celler avledet fra enten føtal lever eller benmarg, potensielt brukes i denne protokollen.
OP9-DL4-systemet har vist seg å være en effektiv modell for å studere genfunksjon i en rekke aspekter, inkludert celledifferensiering17 og onkogenese15. Mens den retrovirale modifikasjonen av hematopoietiske progenitorer er en veletablert teknikk som muliggjør stabil genetisk modifikasjon, krever kombinering av induksjon av celledifferensiering på OP9-DL4-systemet og retroviral transduksjon omsorg og dyktighet. Det kritiske aspektet for å oppnå suksess med denne protokollen er å sikre at alle trinnene er godt koordinert, siden protokollen innebærer å bruke tre forskjellige celletyper som må holdes sunne og ved den ideelle sammenløpet som kreves for hvert bestemt stadium. Med det i tankene er det viktig å utføre alle kvalitetskontrollpunktanalysene etter utførelsen av hvert trinn før du går videre til neste trinn. Dette vil sikre at alle trinnene fungerer. Derfor er kontroll av uttømming, transfeksjon og transduksjonseffektivitet viktig for vellykket utførelse av denne protokollen (se et typisk resultat for transduksjonseffektivitet i figur 4). God primærcelletransduksjonseffektivitet er knyttet til et høyt viralt titer. Vanligvis resulterer større innsatser i lavere virustitere18. For treningsformål bruker vi en tom vektor for å representere resultatene som kan oppnås med denne protokollen. Etter vår erfaring varierer transduksjons- og transfeksjonseffektiviteten i henhold til innsatsstørrelsen, spesielt med tanke på de virale ryggradsuttrykkende reportergenene, som GFP. En strategi som kan brukes når man studerer samspillet mellom mer enn ett gen, er å klone hvert gen til en annen overføringsvektor, etterfulgt av individuell virusproduksjon, og til slutt co-transduksjon av målcellen. I så fall kan et utvalgstrinn brukes for å eliminere de enkeltvis transduserte cellene og beholde bare de samtransduserte cellene.
Det er verdt å merke seg at flertallet av OP9-DL1 / DL4 stromal materlagcellelinjer har blitt genetisk konstruert for å uttrykke GFP som en del av DL1- eller DL4-konstruksjonene7. I denne protokollen brukte vi en retroviral vektor som også uttrykker GFP; Det er imidlertid lysere enn GFP-proteinet uttrykt av OP9-DL4-celler og forstyrrer ikke transduksjonsinspeksjonen når man visualiserer samkulturen under fluorescensmikroskopet.
OP9-celler differensieres til adipocytter etter mange passasjer, lange perioder i kultur, eller under forhold med overkonfluens19. Dette fremgår av utviklingen av store vakuoler. OP9-celler som presenterer disse egenskapene, bør derfor ikke brukes i denne protokollen. Transfektering av altfor konfluente retrovirus-produsentceller vil resultere i en lav virustiter. Faktisk er det subkonfluente stadiet når cellene er mest transfektable. Videre vil transfeksjon av retrovirus-produsentceller med lav konfluens redusere cellespenningen i transfeksjonsprosessen og gi den høyeste virustiteren.
Mens vi i denne protokollen ikke titrerer virussupernatanten, må virussupernatanttitrering vurderes i noen tilfeller, for eksempel i fravær av et reportergen i den retrovirale vektoren, noe som vil forhindre indirekte bestemmelse av virusproduksjon, eller i tilfeller der eksperimentell design krever et mer nøyaktig antall transgenkopier som skal integreres i målcellegenomet. Det er imidlertid viktig å merke seg at titeret til retroviral vektorsupernatant reduseres signifikant når det oppbevares ved -80 °C eller 4 °C inntil titreringsresultatene oppnås. Bruk av nytilberedt virussupernatant for transduksjon vil derfor gi bedre transduksjonseffektivitet.
Thymus inneholder et stort antall dobbeltpositive (DP) tymocytter (mer enn 85%) og ca. 10% enkeltpositive15 celler (CD4 eller CD8), som er tymocytter etter DN-stadiet. DP-cellene kan ikke overleve in vitro for retroviral manipulasjon, mens SP-cellene er uoverførbare. Derfor kan denne protokollen brukes til å generere retrovirale vektortransducerbare DN-tymocytter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det intramurale programmet til National Cancer Institute, prosjekt ZIABC009287. OP9-DL4 ble hentet fra Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Canada). Forfatterne takker NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program for deres fortsatte tekniske assistanse og eksperimentelle råd og innspill, samt Jeff Carrel, Megan Karwan og Kimberly Klarmann for flowcytometri assistanse. Vi takker Howard Young for kritiske råd og innspill.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
- Zuniga-Pflucker, J. C.
- Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science. 272 (5262), 722-724 (1996).
- Ueno, H., et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).
- Jaleco, A. C., et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation. Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).
- Mohtashami, M., et al. Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).
- Mazzucchelli, R., Durum, S. K. Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).
- Robey, E. A., Bluestone, J. A. Notch signaling in lymphocyte development and function. Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).
- Lavaert, M., et al. Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes. Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).
- Roh, K. H., Roy, K. Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis. Biomaterials Research. 20 (20), (2016).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).
- Cramer, S. D., et al. Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).
- Treanor, L. M., et al. Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential. Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).
- Yokoyama, K., et al. In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).
- Simmons, A., Alberola-Ila, J. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors. Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).
- Retroviral systems. , Nolan Lab. Available from: https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html (2022).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).
- Gray, D. H., et al. Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells. Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).
- Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).
- Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system. BD Biosciences–Application Note. , (2012).
- Sakaguchi, N., et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).
- He, X., Park, K., Kappes, D. J. The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment. Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).
- Wang, Y., et al. A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling. PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).
- Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program. Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).
