Summary
이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.
Abstract
형질도입된 마우스 미성숙 흉선세포는 델타-유사 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)을 사용하여 시험관내에서 T 세포로 분화될 수 있다. 레트로바이러스 형질도입은 형질전환 유전자 통합을 위해 분열 세포를 필요로 하기 때문에, OP9-DL4는 조혈 전구 세포를 배양하기 위한 적합한 시험관내 환경을 제공한다. 이는 연구자가 형질전환 마우스를 생성하는 시간 소모적인 과정을 우회할 수 있게 해주기 때문에 정상적인 T 세포 발달 및 백혈구 생성 동안 특정 유전자의 발현 효과를 연구할 때 특히 유리합니다. 성공적인 결과를 얻으려면 서로 다른 유형의 세포를 동시에 조작하는 일련의 조정 단계를 신중하게 수행해야합니다. 이러한 절차는 매우 잘 정립되어 있지만 문헌에 공통 소스가 없다는 것은 종종 일련의 최적화가 필요하다는 것을 의미하며 이는 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 이 프로토콜은 OP9-DL4 세포에서 분화에 이어 1차 흉선 세포를 형질도입하는 데 효율적인 것으로 나타났습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 OP9-DL4 간질 세포에서 레트로바이러스로 형질도입된 흉선세포의 공동 배양을 위한 빠르고 최적화된 가이드 역할을 할 수 있습니다.
Introduction
OP9 골수 기질 세포주는 전구체의 여러 공급원으로부터 림프구 생성의 유도를 위한 유용한 시험관내 시스템을 제공한다1. OP9 세포를 사용한 첫 번째 연구에서는 대식세포 콜로니 자극 인자(MCSF) 발현의 부족이 OP9 세포주가 골수 유래 조혈 줄기 세포(HSC)에서 조혈 및 B 세포 분화를 지원하는 능력에 기여한다는 것을 입증했으며, 나중에 배아 줄기 세포(ESC)에 대해서도 나타났습니다.2,3,4,5 . 이전 연구에서, 델타 유사 1/4 발현 OP9 세포(OP9-DL1/OP9-DL4)의 생성은 T 세포 계통 헌신의 유도를 가능하게 했고6 흉선 성숙을 성공적으로 요약하는 능력을 입증했다 7,8. 간략하게, T 세포 발달은 CD4 및 CD8 분자의 순차적 발현에 의해 설명되었다. 미성숙 흉선 세포는 "이중 음성"(DN, CD4- CD8-)이며 CD44 및 CD25의 표면 발현에 따라 추가로 세분화될 수 있습니다. DN 흉선 세포는 마우스에서 CD8 발현과 인간에서 CD4를 특징으로 하는 미성숙 단일 양성(ISP) 단계를 통해 분화하고, CD4와 CD8의 동시 발현을 특징으로 하는 이중 양성(DP) 단계를 거쳐 분화하며, 마지막으로 CD4 또는 CD89의 발현을 특징으로 하는 성숙 단일 양성 단계. HSC는 Notch1 수용체를 발현하는데, 이는 일반적으로 흉선 상피 세포에서 발현되는 델타 유사 4(delta-like 4, DL4)와 상호작용하여 T 계통 분화를 유도한다10. 따라서, OP9-DL1/4 모델에 대한 관심은 점진적으로 증가하여, 지난 20년 동안 매우 다양한 응용분야에서 이 접근법의 광범위한 사용으로 이어졌다(8,11,12,13). DL1 및 DL4 둘 다 시험관 내에서 T 세포 분화를 지원할 수 있지만, 이들은 생체 내에서 차별적인 요건을 보여주며, 몇몇 연구들은 OP9_DL4가 마우스 흉선 환경을 요약하는데 OP9_DL1보다 더 효율적이라고 제안했다 7,14.
OP9-DL1/4 시스템의 잠재적인 응용 분야 중에서, 이 시스템과 DN 세포 또는 HSC와 레트로바이러스 벡터의 형질도입의 조합에 특히 관심이 있습니다. 이 조합은 정상 T 세포 발달 및 백혈구 생성 동안 유전자 발현을 조작하는 효과적인 방법이며 관심 유전자의 기능을 유도하거나 억제하는 효율적인 방법인 것으로 나타났습니다15,16,17. 이 모델은 형질전환 마우스를 생성하는 것과는 대조적으로 유연하고 합리적인 시간 내에 여러 유전자 조합의 효과를 조사할 수 있기 때문에 백혈병15을 유발하는 종양유전자 간의 협력을 연구하는 데 특히 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 정상 세포에 종양 유전자를 도입하는 효과를 평가하기 위해 유사한 모델이 이전에 사용되었습니다15,16,17. 또한, 레트로바이러스 형질도입은 형질전환 유전자 통합을 위한 분열 세포18을 필요로 하며, 렌티바이러스 형질도입은 형질전환 유전자 통합을 위한 분열 세포의 필요성을 제거함으로써 이러한 한계를 극복할 수 있지만, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 DN 흉선 세포의 성공적인 형질도입을 달성할 수 없었습니다. 따라서, OP9-DL1/DL4는 조혈 전구 세포를 성장시키기에 적합한 도구이다.
OP9-DL4에서 형질도입된 흉선 세포의 림프구 생성을 위한 표준 프로토콜에는 성공적인 결과를 달성하기 위해 신중하게 수행해야 하는 일련의 조정된 단계가 포함됩니다. 이러한 기술은 수년 동안 지역 사회에 잘 봉사해 온 기술이지만 종종 문헌에서 사용할 수 있는 프로토콜이 단편화되어 있습니다. 결과적으로 각 실험실은 절차의 여러 단계를 조정하고 최적화해야 하며 이는 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 여기에서 이 프로토콜은 마우스 흉선에서 DN 흉선 세포를 분리한 다음 추가 기능 분석을 위해 OP9-DL4 기질 세포에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양을 설명합니다. 이러한 확립된 프로토콜은 OP9-DL4 세포에 대한 분화 또는 T 세포 급성 림프구성 백혈병의 유도에 이어 1차 흉선세포를 형질도입하는 데 효율적이고 재현 가능한 것으로 나타났다15.
Protocol
기술된 모든 동물 실험은 NIH 기관 생물안전 위원회(IBC) 및 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 시약 및 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 레트로바이러스 생산자 세포 배양 및 유지 관리 절차에 대한 자세한 내용은 게시된 지침19를 참조하십시오. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1 을 참조하십시오.
1. OP9-DL4 세포의 배양 시작(Day 1)
- 바이알을 잡고 37°C의 수조에서 부드럽게 진탕하여 OP9-DL4 세포를 빠르게 해동합니다. 즉시 5mL의 OP9 배지(MEM-알파 배지, 10% FBS, 50U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 55μM 2-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민)가 들어 있는 원심분리기 튜브로 세포를 옮겨 동결 방지제를 제거합니다.
- 실온에서 5분 동안 300× g 으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고, 세포를 1 mL의 OP9 배지에 재현탁시킨다.
- 5mL의 OP9 배지를 T25 플라스크에 넣고 이 플라스크에 재현탁된 세포를 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
- 2-3일 후, 1:3 분할을 사용하여 세포를 계대 배양합니다(매주 월요일, 수요일, 금요일에 세포 계대).
참고: OP9-DL4 셀이 합류점에 도달하기 전에 분할합니다. OP9-DL4 플라스크는 흉선 세포와의 공동 배양을 위해 6-7일과 8-9+일에 80%-90% 합류해야 합니다. 따라서 OP9-DL4 셀을 분할하는 동안 해당 날짜에 필요한 OP9-DL4 셀의 수를 계획하는 것이 중요합니다.- 플라스크로부터 배지를 버리고, 단분자층을 1x PBS로 세척한다. PBS를 버리고 0.25% 트립신 1mL를 넣고 37°C에서 1-5분 동안 또는 세포가 플라스크에서 제거될 때까지 배양합니다. 플라스크를 두드려 세포를 제거합니다.
참고: (선택 사항) 세포 해리의 진행 상황은 현미경으로 확인할 수 있습니다. - 5mL의 OP9 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하고, 재현탁 동안 플라스크의 세포로 덮인 표면을 헹구어 세포를 재현탁합니다.
- 실온에서 5분 동안 300× g 의 세포 현탁액을 원심분리하고 3mL의 OP9 배지에 재현탁합니다(1:3 분할의 경우).
- 1 mL의 세포 현탁액을 이미 5 mL의 신선한 OP9 배지가 들어있는 T25 플라스크에 넣는다. 나머지 셀을 고정/폐기합니다.
- OP9-DL4 세포를 동결시키기 위해, 1 mL의 동결 배지와 1 바이알의 비율로 90 % FBS / 10 % DMSO에서 세포를 재현탁한다.
- 향후 요구 사항에 따라 -80°C의 1mL 극저온 또는 액체 질소에서 동결합니다. 장기간 보관을 위해 액체 질소에 보관하십시오.
- 플라스크로부터 배지를 버리고, 단분자층을 1x PBS로 세척한다. PBS를 버리고 0.25% 트립신 1mL를 넣고 37°C에서 1-5분 동안 또는 세포가 플라스크에서 제거될 때까지 배양합니다. 플라스크를 두드려 세포를 제거합니다.
2. 레트로바이러스 생산자 세포주의 배양 시작(Day 1)
- 바이알을 잡고 37°C의 수조에서 부드럽게 진탕하여 레트로바이러스 생산자 세포주를 빠르게 해동합니다. 즉시 5mL의 레트로바이러스 생산자 세포 배지(RPC: DMEM, 10% FBS)가 들어 있는 원심분리기 튜브로 세포를 옮겨 동결방지제를 제거합니다.
- 실온에서 5분 동안 300× g 으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 1mL의 RPC 배지에 세포를 재현탁합니다.
- 5mL의 RPC 배지를 T25 플라스크에 넣고 재현탁된 세포를 이 플라스크에 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
- 세포를 2-3일마다 1:5에서 1:8로 나누어 통과시킵니다.
- 플라스크를 두드려 세포를 제거하고 공격적으로 피펫팅하여 세포를 다시 일시 중단합니다.
참고: 이 세포는 트립신 없이 공격적인 피펫팅을 통해 플라스크 표면에서 제거할 수 있습니다. 또는 세포가 쉽게 분리될 때까지 트립신화(0.05% 트립신/0.53mM EDTA)하고 단일 세포 현탁액에 쉽게 피펫팅할 수 있습니다.
- 플라스크를 두드려 세포를 제거하고 공격적으로 피펫팅하여 세포를 다시 일시 중단합니다.
- 세포 현탁액을 300× g 에서 5분 동안 원심분리하고 5mL의 RPC 배지(1:5 분할용)에 재현탁합니다.
- 1mL의 세포 현탁액을 이미 5mL의 신선한 RPC 배지가 들어 있는 T25 플라스크에 넣습니다. 나머지 셀을 고정/폐기합니다. OP9-DL4 세포에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 레트로바이러스 생산자 세포를 동결합니다(단계 1.4.4.1–1.4.4.2).
3. 6웰 플레이트에서 레트로바이러스 생산자 세포의 배양 시작(4-5일)
- 2mL의 RPC 배지에서 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 70%-90% 밀도로 형질감염 18-24시간 전에 레트로바이러스 생산자 세포를 시딩하고 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다.
참고: 형질도입될 흉선 세포를 2-5 ×10 5 대 1 ×10 6 개의 흉선세포마다 레트로바이러스 생산자 세포의 두 웰을 형질감염시킵니다.
4. 관심 유전자를 포함하는 레트로바이러스를 생성하기 위해 레트로바이러스 생산자 세포를 형질감염시키기(5-6일)
- 트랜스펙션 1시간 전에 배지를 새 RPC 배지로 교체합니다.
- 리포펙션 혼합물 준비(6웰 플레이트의 각 웰에 대해 - 필요에 따라 스케일 업): 4μg의 DNA(헬퍼 플라스미드(pCL-Eco) 2μg 및 전달 플라스미드(pMIG) 2μg)를 환원 혈청 배지 250μL에 희석합니다. 부드럽게 섞는다.
- 10 μL의 형질주입 시약을 4.2 단계로부터의 환원된 혈청 배지 250 uL와 혼합한다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 5분 배양 후, 희석된 DNA를 희석된 형질주입 시약(총 부피 = 500μL)과 결합합니다. 부드럽게 섞고 실온에서 20-25 분 동안 배양하십시오.
- 500μL의 DNA/형질주입 시약 혼합물을 원형 운동으로 세포에 떨어뜨려 레트로바이러스 생산자 세포가 포함된 웰에 부드럽게 추가합니다. 플레이트를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 혼합하고 37°C 인큐베이터에서 16-24시간 동안 배양합니다.
참고: Subconfluent 세포(80%–90%)는 형질주입에 가장 적합하며 잠재적으로 가장 높은 바이러스 역가를 생성합니다. 레트로바이러스 생산자 세포는 플라스크에서 매우 쉽게 빠져나가므로 이러한 세포를 다룰 때 갑작스러운 움직임을 피하십시오.
5. 레트로바이러스 생산자 세포 배지 변경(6-7일)
- 형질주입 후 약 16시간 후에 기존 배지를 2mL의 새로운 RPC 배지로 교체합니다. 37°C에서 20-24시간 동안 세포를 계속 배양합니다.
- 형광 현미경으로 형질주입 효율을 평가합니다(선택 사항).
참고: 이 프로토콜에서 GFP 양성 세포는 관심 있는 세포입니다( 그림 2 참조). 이 단계는 이 프로토콜에서 사용하기 위해 선택된 레트로바이러스 벡터(리포터 유전자가 골격에 존재하는지 여부)에 따라 달라집니다.
6. 흉선 세포 준비 및 CD4+ 및 CD8+ 세포 고갈(6-7일)
- 4-6주 된 C57BL/6 마우스에서 흉선을 채취합니다. 흉선 채취에 대한 자세한 내용은 Xing and Hogquist20을 참조하십시오.
참고: 마우스는 CO2 흡입에 의해 안락사된 후 자궁경부 탈구되었습니다. - 흉선을 페트리 접시에 PBS 5mL에 넣어 흉선 세포 단세포 현탁액을 준비합니다. 멸균 유리 슬라이드를 사용하여 슬라이드의 젖빛 표면 사이에 흉선을 놓고 슬라이드를 부드럽게 문질러 두 슬라이드 사이의 흉선을 굴립니다. 유리 슬라이드를 헹구어 세포를 모으고 남은 흉선 기질 조직을 버립니다.
참고: 한 흉선에서 추정되는 수율은 106 6 세포 × 90 × 10 6-100 세포이며, 세포의 약 1%는 CD4 및 CD8 고갈 후에도 남아 있습니다. 출생 후 첫 주 동안 마우스 흉선의 세포질이 빠르게 증가하고 4-6 주령에 고원에 도달하고 이후 점진적으로 팽창하기 때문에 더 나은 세포 수율을 위해 어린 마우스의 흉선 조직을 사용하십시오21. 자동 혈구 계수기 또는 다른 방법을 사용하여 세포 수를 세십시오. - 세포 여과기를 통해 흉선 현탁액 5mL를 피펫팅하여 흉선 현탁액을 30μm 또는 40μm 필터를 통해 흉선 현탁액을 여과합니다. 세포를 300 × g 에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
- 상층액을 제거하고, 1분 동안 튜브당 1mL의 완충액(샘플 크기에 따라 다름)을 첨가하여 ACK 용해 완충액으로 적혈구를 용해합니다. 5mL의 세포 고갈 완충액(500mL의 PBS[pH 7.2], 0.5% BSA, 2mM 0.5M EDTA, pH 8.0)을 추가하여 ACK 용해 완충액을 비활성화하고, 300× g 에서 10분 동안 원심분리하고, 계수를 위해 1-5mL의 세포 고갈 완충액에 다시 현탁합니다.
참고: 고갈 전(고갈 전) 얼음 위에 다음을 따로 보관하십시오: 계수할 세포 현탁액 70μL(선택한 계수 세포 방법에 따라 다름) 및 세포 현탁액 200μL를 CD4 및 CD8에 대한 염색 및 유세포 분석으로 분석하여 고갈 효율을 결정합니다22,23. - 세포를 계수하고, 300 × g 에서 10분 동안 원심분리한다. 세포 고갈 완충액의 1 × 107/80 μL에서 세포를 재현탁합니다. 1 × 107 세포 당 CD4 및 CD8 마이크로 비드 각각 10 μL를 첨가하십시오. 잘 섞고 냉장고(2–8 °C)의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.
- 2mL의 공핍 완충액으로 헹구고 플로우 스루를 폐기하여 공핍 컬럼을 준비합니다.
- 1 ×10 7 세포 당 1-2 mL의 고갈 완충액을 첨가하고 300 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 6.6 단계에서 세포를 세척합니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.
- 500μL의 공핍 완충액에서 최대 1.25 ×10 8 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고, 플로우스루(표지되지 않은 세포)를 수집한다. 1mL의 완충액으로 컬럼을 2배 세척하고 플로우 스루를 수집합니다.
참고: 컬럼 저장소가 비어 있는 경우에만 새 버퍼를 추가하십시오. 고갈 후 얼음 위에 다음을 따로 보관하십시오 (고갈 후 제어) : 70 μL의 세포 현탁액 (선택한 계수 세포 방법에 따라 다름) 및 1,000 μL의 세포 현탁액을 CD4 및 CD8에 대한 염색 및 유세포 분석으로 분석하여 고갈 효율을 결정합니다22,23. - 고갈 전에 수집된 200μL의 세포를 4개의 FACS 튜브(염색되지 않은 샘플, CD4 단일 염색, CD8 단일 염색 및 CD4/CD8 이중 염색)로 분할하여 고갈 효율 제어를 염색합니다(염색되지 않은 샘플 및 단일 염색된 샘플을 사용하여 유세포 분석 파라미터 설정). 고갈 후 수집된 1,000μL의 세포를 사용하여 CD4 및 CD8을 염색하고 고갈 전에 수집된 이중 염색 샘플과 비교합니다( 그림 3의 일반적인 고갈 결과 참조).
참고: 항체 제조업체의 권장 사항에 따라 유세포 분석 염색을 위한 부피를 조정합니다(예: 완충액 50μL에 1 x 106 개 세포당 항-CD4-FITC 1μL + 항-CD8-PE 0.5μL).
7. OP9-DL4 세포에서 흉선세포 배양(6-7일)
- 고갈 후 흉선세포를 2-5 ×10 5 대 1 × 10 6 사이토카인(10ng/mL 재조합 IL-7 및 재조합 hFLT-3)을 포함하는 OP9 배지의 80%-90% 융합 OP9-DL4 세포의 T25 플라스크에 넣습니다. 37°C 및 5%CO2에서 배양한다. OP9-DL4 세포에서 약 24시간 동안 성장합니다.
참고: 이 지속 시간은 T 세포를 형질도입할 수 있도록 하는 데 필요합니다( 그림 4의 일반적인 결과 참조). 흉선세포와 OP9-DL4 세포의 공동배양물의 T25 플라스크 하나를 대조군(형질도입되지 않음)으로 사용할 수 있도록 예약한다. 형질도입되지 않은 흉선세포는 형질도입된 흉선세포(단계 9.1)와 함께 형질도입 효율을 평가하기 위한 음성 대조군으로 염색됩니다. 형질도입되지 않은 흉선세포는 또한 세포 분화에 대한 형질전환유전자 발현의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 사이토카인 함유 배지는 1개월 후에 폐기한다.
8. 상청액에서 레트로바이러스를 채취하여 흉선세포를 형질도입하는 데 사용(8-9일)
- 6웰 플레이트를 기울이고 플레이트 바닥에 3-5mL 주사기를 배치하고 플런저를 당겨 상층액을 흡인하여 형질주입된 세포에서 레트로바이러스를 포함하는 상층액을 수집합니다. 배지를 2mL의 새 RPC 배지로 교체합니다. 8.9단계에서 두 번째 형질도입을 위해 37°C에서 20-24시간 동안 세포를 계속 배양합니다.
- 0.45μm 주사기 필터를 통해 레트로바이러스 상청액을 여과하고 여과액을 50mL 튜브에 수집합니다.
참고: 레트로바이러스 상청액을 동결하지 마십시오. 형질 도입을 위해 갓 만든 바이러스 제제를 사용하십시오. - 플라스크 표면에서 흉선세포 및 OP9-DL4 세포를 제거하기 위해 공격적인 피펫팅에 의해 OP9-DL4 배양물로부터 흉선세포를 수집한다. 40μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 대부분의 OP9-DL4 세포를 제거하고 여과액을 50mL 튜브에 수집합니다.
참고: OP9 셀은 매우 접착력이 있습니다. 공격적인 피펫팅이 플라스크에서 OP9-DL4 세포의 일부를 제거할 수 있지만, 이 과정에서 OP9-DL4 단층의 파괴는 최소화되며, OP9-DL4 세포가 1차 흉선 세포보다 훨씬 크기 때문에 떨어져 나온 OP9-DL4 세포는 40μm 세포 스트레이너로 걸러집니다. OP9-DL4 세포가 여전히 80%-90% 합류하면 흉선 세포를 제거하고 동일한 OP9-DL4 플라스크에 다시 플레이팅합니다. 또는 새로운 OP9-DL4 플라스크를 준비해야 합니다. - 단계 8.3의 여액에서 흉선 세포를 300 × g 에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리십시오.
- 50mL 튜브에서 흉선세포를 0.5-1mL의 OP9 배지 + 사이토카인에 재현탁합니다(7.1단계 참조). 바이러스가 포함된 RPC 배지 1-2mL를 추가합니다(흉선 세포 배지의 두 배의 RPC 배지). 헥사메트린 브로마이드(10μg/μL 스톡 농도)를 첨가하여 8μg의 헥사메트린 브로마이드/mL의 총 세포 현탁액을 생성합니다.
- 실온에서 1시간 동안 850 × g 에서 세포를 원심분리하여 스피노큘레이트한다.
- 플라스크 당 6 mL의 OP9 배지 + 사이토카인에 세포를 재현탁시키고(단계 7.1 참조), 현탁액을 OP9-DL4 세포 단층 상에 다시 첨가한다.
참고: 또는 형질도입된 흉선 세포를 받을 수 있도록 새 OP9-DL4 플라스크를 준비하십시오. 흉선 세포를 사용한 OP9-DL4 플라스크에 다시 넣어야 하는 경우 흉선 세포 분주 1시간 동안 OP9-DL4 세포에 신선한 OP9 배지를 추가하여 세포를 건강하게 유지하고 80%-90% 밀도를 보장해야 합니다. - 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 레트로바이러스 함유 세포 상청액의 새 웰을 사용하여 8.2–8.7단계를 반복합니다.
9. 형질도입된 흉선세포를 OP9-DL4 배양액에 2-5일 동안 유지하거나 필요에 따라 동결(Day 9+)
- CD4, CD8, CD25 및 CD44와 같은 T 세포 발달 마커에 대한 흉선 세포를 염색하여 유세포 분석에 의한 흉선 세포 분화를 평가합니다23. 그림 5에서 일반적인 흉선 세포 분화 결과를 참조하십시오.
Representative Results
고갈 효율은 면역자기 세포 분리(MACS) 후 CD4 및 CD8에 대해 자기적으로 표지되지 않은 세포 분획을 표지하고 이를 2차원 이변량 도트 플롯에서 분석하여 유세포 분석법으로 평가할 수 있습니다(그림 3). 이중 음성(CD4-, CD8-) 세포의 양호한 수율은 그림 3과 같이 95% 이상입니다. 낮은 수율의 가장 일반적인 두 가지 원인은 세포 수와 컬럼 용량을 초과하는 표지된 세포의 수를 기준으로 한 마이크로비드의 계산 착오입니다. 레이블이 지정된 셀의 수에 따라 올바른 MACS 열 수를 선택하는 것이 좋습니다. 흉선 세포로 작업 할 때, 표지 된 세포 (DP 및 SP 세포)의 수는 총 세포 수 (96 % 이상)와 거의 같습니다. 세포 계수는 자동 세포 계수기, Neubauer 챔버 또는 다른 방법으로 수행할 수 있습니다. 결과적으로 셀 카운팅에 할당된 부피는 특정 기계와 선택한 카운팅 방법에 따라 조정해야 할 수 있습니다.
고갈 전후에 존재하는 세포의 수를 결정하는 것이 중요합니다. 이러한 세포 수는 필요한 LD 고갈 컬럼의 수를 계산하고 DN 흉선 세포를 적절한 수의 OP9-DL4 플라스크에 고르게 분배하는 데 필요합니다. 유세포 분석에 대한 대조군(표지되지 않은 세포, CD4에 대해 표지된 세포 및 CD8에 대해 표지된 세포)은 더 많은 세포를 포함하므로 예약된 고갈 전 샘플로 수행할 수 있습니다. 그러나 대부분의 세포가 컬럼 내에 유지될 것으로 예상되기 때문에 라벨링할 고갈 후 샘플에는 더 많은 부피가 필요합니다. 따라서 선택한 라벨링 프로토콜에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
형광 유전자와 같이 스크리닝 가능한 마커를 발현하는 벡터를 사용하는 경우, 형질주입 및 형질도입은 형광 현미경으로 대략적이고 경험적으로 평가할 수 있습니다(그림 2). 형질도입 효율은 단계 8.3에 기재된 바와 같이 OP9-DL4 단층으로부터 흉선세포를 수확하고, 유세포 분석에 의해 형광 유전자의 발현을 관찰함으로써 분석될 수 있다. GFP를 리포터 유전자로 하는 빈 레트로바이러스 벡터를 사용한 형질도입 효율은 84.2%였다(그림 4).
OP9-DL4 세포에 대한 T 세포 분화는 형질도입 4일 후에 관찰할 수 있다. 유세포 분석은 일반적으로 OP9-DL4 세포 및/또는 이식유전자 발현에 대한 공동 배양에 의해 유도된 세포 분화를 평가하기 위해 수행되며, 여기서 세포는 CD4, CD8, CD44 및 CD25에 대해 표지되었습니다. 마우스에서 T 세포 발달의 분자 및 세포 메커니즘을 조사하는 데 유용한 것으로 밝혀진 세포 표면 분자 표지의 몇 가지 가능한 조합이 있습니다24,25,26,27. 그러므로, 형광 항체의 패널은 다루어지는 관심의 문제에 따라 달라질 수 있다. 패널 B에 표시된 빈 레트로바이러스 벡터 pMIG를 사용한 DN 흉선 세포의 형질도입은 단일 양성(CD4+ 또는 CD8+), 이중 양성(CD4+/CD8+), 이중 음성(CD4-/CD8-) 및 그 하위 단계 이중 음성 1-4(DN1-DN4)를 패널 A에 표시된 형질도입되지 않은 흉선세포와 비교하여 T 세포 발달이 형질도입 과정에 의해 영향을 받지 않았음을 나타냅니다.
그림 1: 흉선 세포 분리, 형질도입 및 공동 배양 단계의 다이어그램. 약어: DN = 이중 음수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: GFP 형질도입된 흉선세포 또는 형질도입되지 않은 흉선 세포 및 OP9-DL4 세포의 공동 배양 형광 현미경. (A) 형질도입되지 않은 흉선세포 및 (B) 두 번째 형질도입 후 3일째에 OP9-DL4에서 안정적인 GFP 발현 쥐 흉선세포. GFP 검출에 적합한 40x 렌즈와 480/30 필터가 장착된 Olympus-IX71 형광 현미경을 사용했습니다. 스케일 바 = 40 μm. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; DN = 이중 음수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 흉선 세포 고갈의 유세포 분석. 7-8주령 C57BL/6J 암컷 마우스에서 얻은 흉선 세포에서 CD4 및 CD8의 발현을 분석하는 대표적인 유세포 분석 플롯 (A) CD4+ 및 CD8+의 고갈 전 및 (B) 고갈 후 제조업체의 지침에 따라 마이크로비드 및 LD 컬럼을 사용합니다. 왼쪽의 점도표는 이벤트의 크기와 복잡도(각각 FCS-A 및 SSC-A)를 기반으로 게이트를 보여줍니다. 중간 패널은 FSC-H 대 FSC-A를 보여 주어 단일 셀을 게이트하고 이중선을 제외합니다. 우측의 플롯에서, 세포는 단일-세포 게이트로부터 CD4 및 CD8로 정의되었다. 약어: FSC-A = 전방 산란 피크 면적; SSC-A = 측면 산란-피크 면적; FSC-H = 전방 산란-피크 높이; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코에리트린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 흉선 세포의 유세포 분석, 레트로바이러스 형질도입 효율. (A) OP9-DL4 상에서 공동 배양된 형질도입되지 않은 흉선세포; (B) 형질도입 후 3일째에 OP9-DL4에서 후발현된 흉선세포. 약어: FSC-A = 전방 산란 피크 면적; SSC-A = 측면 산란-피크 면적; FSC-H = 전방 산란-피크 높이; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코에리트린; DN = 이중 음수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: OP9-DL4 공동 배양 4일 후 형질도입된 흉선 세포의 유세포 분석. (A) 형질도입되지 않음 및 (B) pMIG 레트로바이러스로 형질도입됨. 세포는 먼저 살아있는 세포에서 게이트된 다음 크기와 복잡성(각각 FCS-A 및 SSC-A)에 따라 게이트된 다음 FSC-H 대 FSC-A를 플로팅하여 단일 세포에서 게이트하고 이중선을 제외했습니다. 형질도입되지 않은 세포의 경우, 다음과 같은 게이트 전략을 사용하였다. 단일 세포 게이트에서 세포는 단일 양성(CD4+ 또는 CD8+), 이중 양성(CD4+/CD8+) 및 이중 음성(CD4-/CD8-)으로 정의되었습니다. 이어서, 이중 음성(CD4-/CD8-) 게이트로부터, 세포를 CD44+, CD25+, CD44+/CD25+ 및 CD44-/CD25-로 정의하였다. 패널 B에 표시된 pMIG 형질도입된 세포의 경우, 단일 세포 게이트에서 세포를 먼저 GFP+/GFP-로 정의한 다음, GFP+ 세포에서 CD4, CD8, CD44 및 CD25 발현에 의해 정의된 주요 T 세포 발달 단계로의 세포 집단 분포를 비트라듀싱된 세포와 동일한 게이트 전략을 사용하여 결정했습니다. 약어: FSC-A = 전방 산란 피크 면적; SSC-A = 측면 산란-피크 면적; FSC-H = 전방 산란-피크 높이; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 레트로바이러스 형질감염 후 OP9-DL4 분화 모델을 사용한 흉선 유래 DN(CD4-/CD8-) T 세포 연구를 위해 특별히 개발되었습니다. 그러나, 세포 분화에 이어 이러한 형질도입 프로토콜을 받게 될 표적 세포는 더 넓은 학제 간 유용성을 가질 가능성이 높습니다. 따라서 미성숙 흉선 세포 외에도 태아 간 또는 골수에서 유래한 세포와 같은 조혈 줄기 세포가 잠재적으로 이 프로토콜에 사용될 수 있습니다.
OP9-DL4 시스템은 세포 분화(cell differentiation)17 및 종양 발생(oncogenesis)15을 포함한 다양한 측면에서 유전자 기능을 연구하는 효과적인 모델임이 입증되었다. 조혈 전구체의 레트로바이러스 변형은 안정적인 유전자 변형을 가능하게 하는 잘 확립된 기술이지만, OP9-DL4 시스템에서 세포 분화 유도와 레트로바이러스 형질도입을 결합하려면 주의와 기술이 필요합니다. 이 프로토콜의 성공을 달성하기 위한 중요한 측면은 프로토콜이 건강을 유지하고 각 특정 단계에 필요한 이상적인 합류점에서 유지되어야 하는 세 가지 다른 세포 유형을 사용하는 것을 포함하기 때문에 모든 단계가 잘 조정되도록 하는 것입니다. 이를 염두에 두고 다음 단계로 진행하기 전에 각 단계를 실행한 후 모든 품질 관리 체크포인트 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 모든 단계가 제대로 작동합니다. 따라서 이 프로토콜의 성공적인 실행을 위해서는 공핍, 형질도입 및 형질도입 효율을 확인하는 것이 중요합니다( 그림 4의 형질도입 효율에 대한 일반적인 결과 참조). 우수한 일차 세포 형질도입 효율은 높은 바이러스 역가와 관련이 있습니다. 일반적으로 삽입물이 클수록 바이러스 역가가 낮아진다18. 훈련 목적으로 빈 벡터를 사용하여 이 프로토콜로 얻을 수 있는 결과를 나타냅니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 형질도입 및 형질주입 효율은 특히 GFP와 같은 바이러스 백본 발현 리포터 유전자를 고려할 때 삽입물 크기에 따라 달라집니다. 둘 이상의 유전자의 상호작용을 연구할 때 사용할 수 있는 한 가지 전략은 각 유전자를 다른 전달 벡터에 클로닝한 다음 개별 바이러스 생산, 마지막으로 표적 세포의 공동 형질도입을 수행하는 것입니다. 이 경우, 선별 단계를 적용하여 단독으로 형질도입된 세포를 제거하고 공동형질도입된 세포만을 보유할 수 있다.
OP9-DL1/DL4 기질 공급층 세포주의 대다수는 DL1 또는 DL4 구축물의 일부로서 GFP를 발현하도록 유전적으로 조작되었다는 점은 주목할 필요가 있다7. 이 프로토콜에서 우리는 GFP도 발현하는 레트로바이러스 벡터를 사용했습니다. 그러나 OP9-DL4 세포에서 발현되는 GFP 단백질보다 밝으며 형광 현미경으로 공동 배양을 시각화할 때 형질도입 검사를 방해하지 않습니다.
OP9 세포는 여러 계대 후, 오랜 기간 배양 후, 또는 과잉 접합 조건 하에서 지방세포로 분화한다19. 이것은 큰 액포의 발달에 의해 입증됩니다. 따라서, 이러한 특성을 나타내는 OP9 세포는 이 프로토콜에서 사용되어서는 안 된다. 지나치게 합류한 레트로바이러스 생산자 세포를 형질감염시키면 바이러스 역가가 낮아집니다. 실제로, subconfluent 단계는 세포가 가장 transfection 할 수있는시기입니다. 또한, 저-합류 레트로바이러스 생산자 세포를 형질감염시키면 형질주입 과정에서 세포 스트레스가 감소하고 가장 높은 바이러스 역가를 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 바이러스 상청액을 적정하지 않지만, 레트로바이러스 벡터에 리포터 유전자가 없는 경우와 같이 바이러스 생산의 간접적인 결정을 방해하는 경우와 같은 일부 경우 또는 실험 설계에서 표적 세포 게놈에 통합하기 위해 보다 정확한 수의 이식유전자 사본이 필요한 경우. 그러나, 레트로바이러스 벡터 상청액의 역가는 적정 결과가 얻어질 때까지 -80°C 또는 4°C에서 보관할 때 유의하게 감소한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서 형질도입을 위해 새로 준비된 바이러스 상청액을 사용하면 형질도입 효율이 더 우수해집니다.
흉선에는 많은 수의 이중 양성(DP) 흉선세포(85% 이상)와 약 10%의 단일 양성15 세포(CD4 또는 CD8)가 포함되어 있으며, 이는 DN 후 단계 흉선세포입니다. DP 세포는 레트로바이러스 조작을 위해 시험관 내에서 생존할 수 없는 반면 SP 세포는 형질도입할 수 없습니다. 따라서, 이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 형질도입성 DN 흉선세포를 생성하는데 적용될 수 있다.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다
Acknowledgments
이 작업은 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 교내 프로그램 인 ZIABC009287 프로젝트의 지원을 받았습니다. OP9-DL4는 Juan Carlos Zúñiga-Pflücker 박사(Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Canada)로부터 입수했습니다. 저자는 지속적인 기술 지원과 실험 조언 및 의견에 대해 NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program과 유세포 분석 지원에 대해 Jeff Carrel, Megan Karwan 및 Kimberly Klarmann에게 감사드립니다. 중요한 조언과 의견을 주신 Howard Young에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
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