Summary
يصف هذا البروتوكول منهجية لتقييم وظيفة القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية الأصلية باستخدام مستشعر Ca2+ الفلوري GCaMP5G.
Abstract
القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا هي محولات طاقة بيولوجية تحول المحفزات الميكانيكية مثل قوى التمدد أو القص إلى إشارات كهربائية وكيميائية حيوية. في الثدييات ، تعد القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا ضرورية للكشف عن المحفزات الخارجية والداخلية في عمليات متنوعة مثل الإحساس باللمس والسمع وتنظيم حجم خلايا الدم الحمراء وتنظيم ضغط الدم الأساسي والإحساس بامتلاء المثانة البولية. في حين أن وظيفة القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا قد تمت دراستها على نطاق واسع في الإعداد في المختبر باستخدام تقنية المشبك الرقعي ، فإن تقييم وظيفتها في بيئتها الأصلية لا يزال مهمة صعبة ، غالبا بسبب محدودية الوصول إلى مواقع التعبير عن هذه القنوات (على سبيل المثال ، المحطات الطرفية الواردة ، وخلايا ميركل ، ومستقبلات الضغط ، والأنابيب الكلوية) أو صعوبات تطبيق تقنية المشبك الرقعي (على سبيل المثال ، الأسطح القمية لخلايا مظلة الظهارة البولية). يصف هذا البروتوكول إجراء لتقييم عابري Ca 2+ المستحثين ميكانيكيا باستخدام مستشعر الفلورسنت GCaMP5G في إعداد ظهارة البول خارج الجسم الحي ، وهي تقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أحداث Ca2+ المستحثة ميكانيكيا في مستحضرات الأنسجة الأصلية الأخرى.
Introduction
تتعرض الخلايا الطلائية في المسالك البولية لقوى ميكانيكية أثناء انتقال الراشح البولي عبر النيفرون، ويضخ البول من الحوض الكلوي وينتقل عبر الحالبين لتخزينه في المثانة البولية. من المسلم به منذ فترة طويلة أن القوى الميكانيكية (مثل إجهاد القص والتمدد) التي تمارسها السوائل على الخلايا الظهارية التي تبطن المسالك البولية تنظم إعادة امتصاص البروتين في النبيب القريب والمواد المذابة في النيفرون البعيد1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 ، 12,13 ، وكذلك تخزين البول في المثانة البولية والتبول14,15,16,17.
يتم تحويل المحفزات الميكانيكية إلى إشارات كهربائية وكيميائية حيوية ، وهي عملية يشار إليها باسم النقل الميكانيكي ، بوساطة البروتينات التي تستجيب لتشوه الهياكل الخلوية أو المصفوفة خارج الخلية المرتبطةبها 18،19،20،21. تعتبر القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا فريدة من نوعها بمعنى أنها تنتقل من حالة مغلقة إلى حالة نفاذية مفتوحة استجابة للتغيرات في توتر الغشاء أو الضغط أو إجهاد القص18،19،20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بدء عابرات Ca 2+ عن طريق النقل الميكانيكي بوساطة الانتغرين أو عن طريق تنشيط أنظمة الالتصاق المستجيبة ميكانيكيا عند تقاطعات الخلاياالخلوية 23،24،25،26. عادة ما يتم تقييم وظيفة القناة الأيونية باستخدام تقنية المشبك الرقعة ، والتي تتضمن تكوين ختم جيجا أوم بين غشاء الخلية وماصة التصحيح27. ومع ذلك ، يصعب الوصول إلى الخلايا الموجودة في طبقات الأنسجة العميقة ذات المصفوفة الكثيفة خارج الخلية (مثل الأنابيب الكلوية) أو المحاطة بحاجز مادي (مثل الجليكوكاليكس) باستخدام ماصة زجاجية دقيقة. وبالمثل ، لا يمكن دراسة الخلايا المدمجة أو التي هي أجزاء متكاملة من الأنسجة ذات الاستقرار الميكانيكي الضعيف (على سبيل المثال ، الظهارة البولية) بسهولة باستخدام تقنية المشبك الرقعي. نظرا لأن العديد من القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا قابلة للنفاذ إلى Ca 2+ ، فإن النهج البديل هو تقييم نشاطها بواسطة الفحص المجهري الفلوري باستخدام صبغة حساسة ل Ca2+ أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مثل GCaMP. أدت الجهود الأخيرة في هندسة البروتين إلى زيادة كبيرة في النطاق الديناميكي والحساسية والاستجابة ل GECIs28،29،30 ، وقد سمح التقدم في علم الوراثة بالتعبير عنها في مجموعات خلايا معينة ، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة النقل الميكانيكي.
تعمل الظهارة البولية ، وهي الظهارة الطبقية التي تغطي الجزء الداخلي من المثانة البولية ، كحاجز ، مما يمنع انتشار المواد المذابة البولية في الخلالي المثانة ، ولكنه يعمل أيضا كمحول ، ويستشعر امتلاء المثانة وينقل هذه الأحداث إلى الأعصاب والعضلات الكامنة16. أظهرت الدراسات السابقة أن الاتصال بين الظهارة البولية والأنسجة الكامنة يتطلب القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا Piezo1 و Piezo231. لتقييم عابرات Ca 2+ المستحثة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية ، تم تطوير تقنية جديدة موصوفة تستخدم نقل الجينات الفيروسية الغدية للتعبير عن مستشعر Ca2+ GCaMP5G في خلايا الظهارة البولية. تستخدم هذه التقنية إعداد ورقة مخاطية توفر وصولا سهلا إلى طبقة الخلايا المظلة الخارجية ونظام بمساعدة الكمبيوتر للتحفيز الميكانيكي المتزامن للخلايا الفردية باستخدام ماصة زجاجية مغلقة وتسجيل التغيرات في التألق بمرور الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ رعاية الحيوانات والتعامل معها وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. تم استخدام إناث الفئران C57Bl / 6J البالغة من العمر 2-4 أشهر في الدراسة الحالية. تم الحصول على الفئران تجاريا (انظر جدول المواد).
1. تجميع المعدات وإعدادها
- قم بإجراء تصوير Ca2+ باستخدام مجهر عمودي مزود بكاميرا عالية الدقة ومصدر ضوء ثابت (انظر جدول المواد).
- احصل على الصور باستخدام برنامج متوافق مع المجهر يسمح بالتحكم المباشر في الكاميرا ومصدر الضوء ومشغل بيزو عبر جهاز إدخال / إخراج رقمي USB (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يمثل الشكل 1 مخططا للإعداد. GCaMP5G له طول موجي ذروة إثارة يبلغ 470 نانومتر وطول موجة انبعاث ذروة يبلغ 497 نانومتر28. استخدم مكعب مرشح مناسب لتصوير GCaMP5G.
- احصل على الصور باستخدام برنامج متوافق مع المجهر يسمح بالتحكم المباشر في الكاميرا ومصدر الضوء ومشغل بيزو عبر جهاز إدخال / إخراج رقمي USB (انظر جدول المواد).
- لتحفيز خلايا الظهارة البولية الفردية في تحضير الغشاء المخاطي للمثانة (انظر الخطوة 2) ، استخدم مشغل كهرضغطية يتم التحكم فيه بواسطة وحدة تحكم بيزو مفتوحة الحلقة أحادية القناة (انظر جدول المواد). قم بتركيب المحرك الكهرضغطية في مناور دقيق.
- قم بتركيب الماصات الزجاجية الدقيقة في حامل ماصة مثبت على المشغل الكهرضغطية (الشكل 1). قم بتشغيل وحدة التحكم بيزو عن بعد بواسطة محول تناظري / رقمي يتم التحكم فيه بواسطة برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية وتحليلها (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتم استخدام مشغل خارجي ، في شكل إشارة منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) التي بدأها برنامج التصوير ، لتشغيل بروتوكول التحفيز في برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية وتحليلها الذي يحرك المشغل الكهرضغطية (الشكل 1).
- قم بتركيب الماصات الزجاجية الدقيقة في حامل ماصة مثبت على المشغل الكهرضغطية (الشكل 1). قم بتشغيل وحدة التحكم بيزو عن بعد بواسطة محول تناظري / رقمي يتم التحكم فيه بواسطة برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية وتحليلها (انظر جدول المواد).
- تأكد من أن برنامج التصوير (انظر جدول المواد) يتفاعل مع جهاز الإدخال/الإخراج الرقمي. قم بتكوين قناة إخراج رقمية في جهاز الإدخال / الإخراج الرقمي USB لتوصيل إشارة TTL إلى المحول التناظري / الرقمي ، والذي سيبدأ البروتوكول في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية الذي يحرك المشغل الكهرضغطية.
- استخدم كبلا لتوصيل منفذ Start BNC في المحول التناظري/الرقمي بالأرض (GND) وطرف لولبي في جهاز الإدخال/الإخراج الرقمي USB.
- قم بإعداد بروتوكول التسجيل في برنامج التصوير.
ملاحظة: تصف الخطوات التالية كيفية إنشاء بروتوكول يرسل إشارة TTL ويبدأ في تجميع الصور على فترات زمنية محددة.- قم بإعداد بروتوكول الاستحواذ في برنامج التصوير بالنقر فوق مدير التجربة وتحديد تجربة جديدة. سيتم فتح نافذة جديدة.
- حدد الرمز حلقة الفاصل الزمني واسحبه إلى النافذة المفتوحة حديثا ؛ اضبط عدد الدورات على 2 والفاصل الزمني على أسرع إعداد مسموح به في الإعداد.
- من أيقونة الغالق المرسل / الغالق اليدوي ، حدد الرمز NI USB-6501 واسحبه إلى نافذة حلقة الفاصل الزمني ، ثم اضبط NI USB-6501 على أنه مغلق. اسحب NI USB-6501 إضافيا من الغالق المرسل/الغالق اليدوي إلى نافذة حلقة الفاصل الزمني واضبطه على أنه مفتوح. لتوصيل رمزي NI USB-6501 ، اسحب رأس السهم الموجود على جانب الرمز المغلق NI USB-6501 واسحب حتى يلامس رمز NI USB-6501 المفتوح. سيظهر خط يربط كلا الرمزين.
- اسحب حلقة الفاصل الزمني الأخرى إلى نافذة "إدارة التجارب" وقم بتوصيلها بالحلقة الأولى عن طريق سحب رأس السهم. اضبط المعلمات للتسجيل. اضبط عدد دورات حلقة الفاصل الزمني الجديدة على 2400.
- من أيقونة الحصول على الصور ، اسحب مرشح GFP إلى حلقة الفاصل الزمني التي تم فتحها مؤخرا واضبط وقت التعرض على 100 مللي ثانية.
- اضبط نوع صورة الكاميرا على 8 بت، والدقة على 576 × 576 (Binning 4 × 4)، وساعة البكسل على 480 ميجاهرتز، وتصحيح البكسل الساخن على قياسي.
ملاحظة: يمكن ضبط المعلمات وفقا لمستوى تعبير مستشعر الفلورسنت وحساسية الكاميرا وتكوين الإعداد.
- قم بإعداد مقعد المختبر في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية (انظر جدول المواد).
ملاحظة: سيحدد هذا إشارة الخرج بالمللي فولت للمحول التناظري / الرقمي.- انتقل إلى قائمة التكوين في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية وحدد Lab Bench. في نافذة إشارات الإخراج الناتجة ، حدد Analog Out # 1 ، واضغط على إضافة إشارة ، وقم بتسميتها (على سبيل المثال ، "Piezo"). اضبط وحدة الإشارة على mV وعامل المقياس (mV / V) على 1.
- قم بإنشاء بروتوكول تحفيز في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية باتباع الخطوات أدناه.
- لإنشاء بروتوكول تحفيز جديد في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية ، انتقل إلى عنصر القائمة اكتساب وحدد بروتوكول جديد.
- اضبط الوضع / المعدل على التحفيز العرضي ، والتشغيل / التجربة على 1 ، والاكتساح / التشغيل إلى 1 ، ومدة (مدد) الاجتياح على 150.
- في قائمة المخرجات ، حدد القناة # 1 Piezo كمخرج تناظري.
- في قائمة المشغل ، اضبط المشغل على إدخال بدء التحويل الرقمي والمؤقت الداخلي.
- في قائمة الشكل الموجي ، حدد القناة #1 والشكل الموجي التناظري مع الحقبات. قم بتعيين الخطوة A إلى الخطوة ، والمستوى الأول إلى 0 ، ومستوى دلتا إلى 0 ، والمدة الأولى إلى 10000 ، ومدة دلتا إلى 0.
- اضبط الخطوة B على الخطوة ، والمستوى الأول على 10 ، ومستوى دلتا على 0 ، والمدة الأولى على 1000 ، ومدة دلتا على 0. قم بتعيين الخطوة C إلى الخطوة ، والمستوى الأول إلى 0 ، ومستوى دلتا إلى 0 ، والمدة الأولى إلى 130000 ، ومدة دلتا إلى 0.
- احفظ البروتوكول وقم بتسميته بروتوكول التحفيز.
- استخدم كبل BNC لتوصيل الإخراج التناظري # 1 في المحول التناظري / الرقمي بإدخال EXT في مقدمة وحدة التحكم بيزو أحادية الحلقة المفتوحة الحلقة (انظر جدول المواد).
- تصنيع ماصات زجاجية دقيقة للتحفيز الميكانيكي للخلايا المظلية من الأنابيب الزجاجية الشعرية باتباع الخطوات أدناه.
- ضع الزجاج الشعري في مجتذب (انظر جدول المواد) واضبطه باستخدام مقابض الاحتفاظ الشعرية.
- ضع وحدة السخان على ارتفاعها الكامل. اضبط منزلق موضع إنهاء السحب الأول للمجتذب على 5.
- اضبط مقبض السخان الأول على 76.7 والمقبض الثاني على 52.7.
- اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية في خطوتين بالضغط على زر البدء.
- أغلق طرف الماصة الدقيقة باستخدام microforge (انظر جدول المواد) مع ضبط مقبض ضبط السخان على 60.
ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الحالي ، فإن القطر النهائي لطرف الماصة الدقيقة المستخدم في دس الخلايا الفردية هو ~ 1-3 ميكرومتر.
- تحقق من أن الماصة الدقيقة المحفزة تحرك المسافة المحددة في بروتوكول التحفيز.
ملاحظة: الخطوات التالية هي التأكد من أنه بعد 12.5 ثانية من بدء بروتوكول التحفيز في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية ، يتم إنشاء نبضة جهد لمدة 1 ثانية ، مما يجعل المحرك الكهرضغطية يتحرك 20 ميكرومتر.- قم بتركيب ماصة صغيرة في الحامل وإرفاقها بالمشغل الكهرضغطية.
- ضع المشغل الكهرضغطية والماصة الدقيقة المرفقة بالتوازي مع مركز مرحلة المجهر وداخل منطقة الرؤية.
- ركز على طرف الماصة وشل حركة قضيب التثبيت الكهرضغطية (انظر جدول المواد) بشريط لاصق. تحت إضاءة المجال الساطع ، اضبط معلمات الكاميرا للحصول على صورة واضحة لطرف الماصة.
- افتح بروتوكول التحفيز في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية واضبطه على التشغيل.
ملاحظة: لن يبدأ بروتوكول الفيزيولوجيا الكهربية حتى يتم استقبال إشارة TTL المرسلة من برنامج التصوير. - من مدير التجارب في برنامج التصوير، اضغط على Start لبدء الحصول على البيانات.
ملاحظة: سيؤدي هذا إلى تشغيل البروتوكول في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية ، والذي سيقود المشغل الكهرضغطية. سيقوم البروتوكول الموجود في برنامج التصوير بإنشاء ملف يحتوي على صور التجربة.
- تحقق من المسافة التي قطعتها الماصة باتباع الخطوات أدناه.
- لقياس المسافة التي تقطعها الماصة أثناء بروتوكول التحفيز ، حدد عنصر العد والقياس في برنامج التصوير.
- من قائمة القياس ، حدد خيار القياس وعائد الاستثمار ، وستظهر نافذة جديدة أسفل نافذة الفيلم.
- من قائمة القياس ، اختر الخط التعسفي.
- في نافذة الفيلم ، ارسم خطا تعسفيا يبدأ من طرف الماصة. لاحظ أنه سيتم تعديل نهاية الخط التعسفي لاحقا.
- انقر بزر الماوس الأيمن على الخط التعسفي لتحويل الخط إلى منطقة اهتمام (ROI) ، والتي ستكون مرئية في جميع إطارات الأفلام.
- افحص الفيلم واضبط نهاية الخط التعسفي (ROI) على الموضع النهائي الذي قطعته الماصة استجابة للحافز.
ملاحظة: ستظهر المسافة التي تقطعها الماصة بالميكرومتر في نافذة القياس وعائد الاستثمار . يمكن تعديل بروتوكول التحفيز وفقا لاحتياجات المستخدم.
2. نقل في الموقع وعزل الغشاء المخاطي المثانة
- قم بتحويل مثانات الفئران الأنثوية في الموقع باستخدام فيروس غدي يشفر cDNA ل CGaMP5G وفقا للإجراء الموضح في بروتوكول نقل الفيروس31.
- عند تحويل خلايا الظهارة البولية لتجارب التصوير Ca2+ ، قم بغرس المثانة ب 50 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على 2 × 107 جزيئات فيروسية معدية (IVP).
ملاحظة: تميل هذه التقنية إلى تقييد تعبير CGaMP5G بطبقة الخلية المظلية. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تجارب على المثانة البولية التي يتم حصادها من الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن CGaMP5G في خلايا الظهارة البولية (أي تعبير GCaMP5G مدفوعا بمروج uroplakin-2) أو أي نوع آخر من الخلايا ذات الأهمية.
- عند تحويل خلايا الظهارة البولية لتجارب التصوير Ca2+ ، قم بغرس المثانة ب 50 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على 2 × 107 جزيئات فيروسية معدية (IVP).
- 24-72 ساعة بعد التنبيغ ، القتل الرحيم للفئران عن طريق الاختناق CO2 وإجراء بضع الصدر عن طريق فتح تجويف الصدر بمقص للتسبب في انهيار الرئتين.
- قم بإحليل البول باستخدام قسطرة 24 جرام. فضح المثانة عن طريق شق في البطن من ~ 1.5 سم من خلال الجلد والعضلات ، واستخدام خياطة 6.0 (انظر جدول المواد) لتأمين القسطرة إلى مجرى البول.
- احصد المثانة والإحليل32 وألصقها على وسادة حامل من مطاط السيليكون (انظر جدول المواد) مغمورة بمحلول تسجيل يحتوي (بالملليمتر): 135 كلوريد الصوديوم ، 5.0 كيلو كلوريد ، 1 MgCl 2 ، 2.5 CaCl 2 ، 10 جلوكوز ، 10 HEPES ، درجة الحموضة 7.4 ، وفقاعات مع 100٪ O 2 (الشكل 2A).
- افصل الغشاء المخاطي للمثانة عن الطبقة العضلية الأساسية بالملقط الدقيق بعد التقارير المنشورة سابقا32 (الشكل 2 ب).
- اقطع الغشاء المخاطي للمثانة وقم بتثبيته بحيث تكون الظهارة البولية متجهة لأعلى مع إدخال مطاط صناعي من السيليكون في قاع طبق مستزرع بالأنسجة بقطر 35 مم (الشكل 2C).
3. التحفيز الميكانيكي لخلايا الظهارة البولية الفردية وتصوير Ca2+
- قم بتركيب الطبق المستزرع بالأنسجة مع الغشاء المخاطي للمثانة المثبت في مرحلة المجهر المجهز بحاضنة أطباق استزراع مع عناصر تسخين مقاومة (الشكل 2E). Perfuse (باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، انظر جدول المواد) طبق زراعة الخلايا بشكل مستمر بمعدل 1.7 مل / دقيقة مع محلول تسجيل دافئ عند ~ 37 °C مع سخان في الخط.
- حافظ على درجة حرارة حاضنة أطباق الأنسجة والمحاليل عند ~ 37 °C باستخدام نموذج تحكم في درجة الحرارة ثنائي القطب ثنائي القناة (انظر جدول المواد). قم بموازنة الأنسجة في الغرفة مع التروية المستمرة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إجراء المزيد من الإجراءات التجريبية.
- لتسجيل عابرات Ca2+ المستحثة ميكانيكيا ، اغمر الماصة الدقيقة في المحلول الذي يغمر الغشاء المخاطي للمثانة المثبت في طبق الأنسجة. انقل الماصة الدقيقة إلى مركز الحقل بمساعدة هدف مسح منخفض التكبير (4x) باستخدام إضاءة المجال الساطع.
- حرك الماصة الدقيقة بالقرب من سطح نسيج الظهارة البولية عن طريق تحريك المعالج الدقيق بشكل منسق في المستوى الرأسي وضبط التركيز.
- قم بتبديل الهدف إلى هدف ذو تكبير أعلى (20x) مناسب للتألق المناعي بفتحة عددية عالية (NA).
- اضبط المعالج الدقيق على Fine وحرك الماصة الدقيقة بالقرب من أعلى الخلية المستهدفة.
- قم بتغيير مجال الرؤية إلى الكاميرا واضغط على Live في برنامج التصوير.
ملاحظة: يجب أن يؤدي هذا إلى تشغيل الغالق المنعكس والسماح بمراقبة إشارة الفلورسنت المنبعثة من الأنسجة في الكمبيوتر. - اضبط التركيز لتصور الجزء العلوي من الخلية واضبط موضع الماصة إذا لزم الأمر.
- افتح بروتوكول التحفيز في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية واضبطه على التشغيل.
ملاحظة: لن يبدأ البروتوكول الموجود في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية حتى يتم استقبال إشارة TTL المرسلة من برنامج التصوير. - من مدير التجارب في برنامج التصوير، اضغط على Start لبدء الحصول على البيانات. سيؤدي ذلك إلى تشغيل البروتوكول في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية ، والذي سيقود المشغل الكهرضغطية ويولد ملفا بصور التجربة. يمكن تعديل بروتوكول التحفيز وفقا لاحتياجات المستخدم.
4. تحليل البيانات
- حدد شدة التألق بمرور الوقت باتباع الخطوات أدناه.
- افتح ملف الصورة في برنامج التصوير وحدد نافذة العد والقياس . حدد أداة المضلع وارسم عائد استثمار على حدود الخلية التي تم طعنها.
- انتقل إلى نافذة القياس ، وحدد ملف تعريف الكثافة ، واضبط القياس على بمرور الوقت ، والنتائج إلى متوسط ، وطرح الخلفية إلى لا شيء ، ثم اضغط على تنفيذ. سيتم حساب متوسط شدة التألق بمرور الوقت (الشكل 3).
- لتصدير بيانات ملف تعريف الكثافة ، انقر فوق رمز Excel في نافذة نتائج ملف تعريف الكثافة. سيسمح هذا للمستخدم باختيار المجلد الوجهة واسم الملف وحفظ البيانات بتنسيق .xlsx.
- إجراء تحليل البيانات باستخدام الرسوم البيانية العلمية وبرامج تحليل البيانات (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتم التعبير عن سعة قمة Ca2+ التي أثارها الوخز على أنها التغير في شدة التألق (ΔF / F) ، حيث F هي شدة مضان GCaMP5G في الوقت 0 ، و ΔF هو الفرق بين شدة التألق القصوى والقاعدية في الوقت 0. يمكن أيضا حساب اضمحلال استجابة Ca2+ (غير معروض).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف البروتوكول الحالي تقنية لتقييم عابرات Ca 2+ المستحثة ميكانيكيا في الخلايا المظلة باستخدام مستشعر Ca2+ الفلوري GCaMP5G. تم استخدام نقل الفيروس الغدي للتعبير عن GCaMP5G في خلايا الظهارة البولية بسبب كفاءته العالية ولأنه ينتج مستوى مرتفعا من التعبير. يوضح الشكل 2 د صورا فلورية للمقاطع البردية الملطخة من المثانة المستحثة. بالنسبة لهذه التجارب ، يكون تعبير GCaMP5G أعلى في طبقة الخلية المظلية. يوضح الشكل 3 أ سلسلة من الصور التمثيلية التي تم التقاطها أثناء تجربة تم فيها وخز خلية مظلة. توضح الصورة الأولى في الشكل 3 أ منظرا فلوريا للماصة المحفزة الموضوعة أعلى خلية مظلة للغشاء المخاطي للمثانة تعبر عن GCaMP5G. يؤدي التحفيز الميكانيكي للخلية المظلة التي تعبر عن GCaMP5G إلى تشوه (انظر الشكل 3A عند 12.5 ثانية) ، تليها زيادة سريعة في انبعاث التألق (انظر الشكل 3A عند 13.5 ثانية). تم رسم التغير في التألق كدالة للوقت (الشكل 3 ب). كما ورد سابقا31 ، يثير الوخز استجابة Ca2 + في معظم الخلايا المظلة التي تم اختبارها في المثانة من السيطرة والفئران من النوع البري التي تم تحويلها باستخدام GCaMP5G. أدى حذف Piezo1 و Piezo2 من الخلايا المظلة إلى تقليل سعة الذروة لاستجابة Ca2+ 31. عند مقارنة تأثير العلاجات المختلفة أو الخلفيات الجينية على استجابات Ca2+ المستحثة ميكانيكيا ، من الضروري توحيد الظروف التجريبية ، بما في ذلك نقل المثانة ، وتركيب الأنسجة ، وحجم طرف الماصة المستخدمة في المسافة البادئة ، ومدة التحفيز الميكانيكي وسعته ، وظروف التصوير.
الشكل 1: الإعداد التجريبي لتسجيل عابرات الكالسيوم2+ المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية. تتكون الحفارة من مجهر عمودي ومصدر ضوء فلورسنت ومرشحات إثارة وانبعاث وكاميرا CMOS. يتحكم برنامج التصوير في النظام. يتم استخدام مشغل كهرضغطية يتم التحكم فيه بواسطة وحدة تحكم بيزو مفتوحة الحلقة أحادية القناة لتحريك الماصة الدقيقة. يتم تثبيت الماصات الزجاجية الدقيقة في حامل ماصة مثبت على المشغل الكهرضغطية. يتم تثبيت المشغل الكهرضغطية والماصة الدقيقة المرتبطة به على مناور دقيق (غير معروض). يتم تشغيل وحدة التحكم ذات الحلقة المفتوحة بيزو عن بعد بواسطة محول تناظري / رقمي وبرنامج الفيزيولوجيا الكهربية. يوفر بروتوكول التسجيل في برنامج التصوير إشارة TTL عبر جهاز إدخال / إخراج رقمي ، وهذا يبدأ بروتوكول التحفيز في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية الذي يتحكم في الكهرضغطية ، وبالتالي التقاط الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عزل وتركيب الغشاء المخاطي للمثانة لتصوير الكالسيوم2+ . (أ) تحضير الصفيحة المخاطية مع قسطرة مرفقة. تم تجريد الغشاء المخاطي للمثانة من الطبقة العضلية الأساسية بالملقط الدقيق. (ب) صورة مكبرة للغشاء المخاطي للمثانة المجردة موضحة في اللوحة (أ). (ج) ثبت الغشاء المخاطي بحيث تكون الظهارة البولية متجهة لأعلى بدبابيس حشرة 0.15 مم إلى ملحق مطاطي من السيليكون. (د) صور المقطع العرضي للتألق المناعي متحد البؤر لتحضير الصفيحة المخاطية الملطخة بجسم مضاد ضد GFP وجسم مضاد مقترن للحمار الثانوي (أخضر) ، ورودامين فالويدين (أحمر) ، و DAPI (أزرق). يتضمن إعداد الغشاء المخاطي للمثانة جزءا من الصفيحة المخصوصة (LP). تشير الأسهم إلى موقع طبقة الخلية المظلة (Ub). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (ه) صورة للإعداد التجريبي. أ ، سخان في الخط ؛ ب ، المحرك الكهرضغطية ؛ ج ، عناصر سخان ووحدة تحكم ؛ د ، حامل ماصة وميكروبيت ؛ ه ، ورقة الغشاء المخاطي تعلق على إدراج سيليكون في طبق الأنسجة المزروعة وحاضنة الطبق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تسجيل وتحليل عابرات Ca2+ المنشطة ميكانيكيا في خلايا الظهارة البولية. أ: تتابع الصور الفلورية الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة أثناء سير التجربة. لاحظ أن التحفيز الميكانيكي للخلية المظلة يسبب تشوها تليها زيادة سريعة في انبعاث GCaMP5G (السهم). يتم تمييز حدود الخلية المحفزة (ROI) باللون الأحمر. (ب) التغير في شدة التألق (ΔF/F) بمرور الوقت لثماني خلايا مستقلة مستحثة ميكانيكيا في تحضير الغشاء المخاطي للمثانة من فأر التحكم. يتم تمييز وقت المسافة البادئة (12.5 ثانية) بسهم أزرق. تم تعديل البيانات الواردة في (B) من Dalghi et al.31. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جميع الكائنات الحية ، وعلى ما يبدو معظم أنواع الخلايا ، تعبر عن القنوات الأيونية التي تستجيب للمنبهات الميكانيكية20،33،34،35،36،37. تم تقييم وظيفة هذه القنوات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا في الغالب باستخدام تقنية مشبك التصحيح. ومع ذلك ، نظرا لمشكلات إمكانية الوصول ، اقتصرت دراسات المشبك التصحيحي للقنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا إلى حد كبير على الخلايا وخطوط الخلايا المنفصلة. نظرا لأن العديد من القنوات الأيونية التي يتم تنشيطها ميكانيكيا قابلة للنفاذ إلى Ca2+ ، فقد استفدنا من التطورات الحديثة في الفحص المجهري والاستشعار الحيوي والمعالجة الدقيقة لتطوير طريقة تصوير لتقييم وظيفة القنوات المنشطة ميكانيكيا في تحضير ظهارة البول خارج الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، يتم تحويل خلايا الظهارة البولية بتشفير الفيروس الغدي ل GCaMP5G. تعتبر النواقل الفيروسية الغدية مناسبة بشكل مثالي لدراسة إشارات Ca 2+ في الظهارة البولية لأنها توفر معدلا مرتفعا من التنبيغ ومستويات عالية من التعبير عن GCaMP5G في خلايا الظهارة البولية (الشكل 2D). في ظل هذه الظروف ، يكون مضان الخلفية منخفضا نسبيا. إذا تم استخدام نقل الفيروس الغدي للتعبير عن مستشعر Ca2+ المشفر وراثيا ، فيجب التركيز بشكل خاص على تحسين الظروف ، بحيث تعبر الخلايا ذات الاهتمام فقط عن المستشعر. كبديل ، يمكن تحقيق التعبير عن مؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا (GECIs) عن طريق عبور الفئران التي تحمل ترميز جين التحوير المتخبط للبروتين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، GCaMP5G) والفئران التي تعبر عن Cre recombinase تحت سيطرة مروج مناسب. لا يتطلب هذا النهج إجراءات جراحية وله ميزة توفير التعبير المستهدف وحتى مستويات التعبير عن البروتينات في الخلايا التي تعبر عن Cre recombinase.
يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مجهرا واسع المجال مستقيما لتقييم عابري Ca2+ المنشطين ميكانيكيا في الخلايا المظلة المحفزة باستخدام ماصة دقيقة مغلقة مصقولة بالنار. يمكن تكييف الطريقة لدراسة النقل الميكانيكي في الطبقات العميقة من الظهارة البولية أو حتى الخلايا في الصفيحة المخصوصة باستخدام مجهر متحد البؤر أو ثنائي الفوتون. قد يوفر استخدام المجهر متحد البؤر الدقة اللازمة لتحديد التغيرات تحت الخلوية في Ca2+ داخل الخلايا التي تحدث استجابة للتحفيز الميكانيكي. يستخدم هذا البروتوكول ماصة دقيقة مغلقة مصقولة بالنار لكزة خلايا مظلة فردية. الميزة الرئيسية لاستخدام الماصة الدقيقة للتحفيز هي أن الاضطراب الميكانيكي الذي يمارس على الأنسجة عابر ويقتصر على الخلية ذات الاهتمام والمنطقة المحيطة بها. في حين يمكن استخدام أنظمة تمدد الخلايا لتحفيز الخلايا المزروعة على أغشية PDMS ميكانيكيا ، فإن القيود المتأصلة تعيق استخدام هذه الأجهزة لتجارب التصوير مع الاستعدادات خارج الجسم الحي . تشمل هذه القيود تحديات في تركيب وتصوير مثانة الفأر ، ونظرا للطبيعة المطوية للغشاء المخاطي للمثانة ، صعوبات في الحفاظ على التركيز على الخلايا ذات الاهتمام أثناء تمديد الأنسجة.
يحتوي بروتوكول قياس عابرات Ca2+ المنشطة ميكانيكيا في مستحضرات الظهارة البولية على بعض القيود. أولا ، تشتمل الحفارة على مكونات باهظة الثمن نسبيا ، ويتطلب تجميعها وإعدادها خبرة في المجاهر ، وأجهزة المناولة الدقيقة ، والمحولات التناظرية الرقمية ، والبرامج المتخصصة نسبيا. مثل تثبيت التصحيح ، تتطلب هذه التقنية من الباحث تعلم كيفية استخدام micromanipulator وصنع micropipettes الزجاج للتحفيز الميكانيكي. ومع ذلك ، على عكس تقنية المشبك الرقعي ، والتي تتضمن تشكيل ختم عالي المقاومة بين الماصة والغشاء ، فإن الإجراء الموصوف هنا لقياس عابري Ca2+ المنشطين ميكانيكيا بسيط نسبيا ولا يتطلب سوى الباحث وضع الماصة التحفيزية بالقرب من سطح الخلية المراد تحفيزها. لذلك ، يمكن للمحقق المدرب تقييم الاستجابة لدس 8-10 خلايا في ساعة واحدة ، وهو أمر لا يمكن تصوره باستخدام تقنية المشبك الرقعة.
نظرا لأهمية القنوات الأيونية المنشطة ميكانيكيا في وظائف الجسم الطبيعية وحالات المرض ، هناك حاجة إلى طرق جديدة لدراسة هذه القنوات في بيئتها الأصلية. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يمكن أن توفر طرق التصوير نظرة ثاقبة فريدة حول كيفية استشعار هذه القنوات للتغيرات في بيئتها وتوليد استجابات فسيولوجية. نظرا لإمكانية الوصول إلى السطح المخاطي للأعضاء على شكل أنبوب أو كيس ، يمكن تكييف الطريقة الموصوفة هنا لدراسة النقل الميكانيكي في أماكن أخرى ، بما في ذلك الأمعاء والجهاز البولي التناسلي والأوعية الدموية ، إلخ. وبالتالي ، قد تكون دراسة الاستجابات الميكانيكية في الجسم مفيدة على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) و S10OD028596 (إلى GA) ومن قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات الحية النموذجية لتصوير الكلى من مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A.
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al.
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J.
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
