Summary
Denne protokollen beskriver en metodikk for å vurdere funksjonen til mekanisk aktiverte ionekanaler i innfødte urotelceller ved bruk av den fluorescerende Ca2+ -sensoren GCaMP5G.
Abstract
Mekanisk aktiverte ionkanaler er biologiske transdusere som konverterer mekaniske stimuli som strekk- eller skjærkrefter til elektriske og biokjemiske signaler. Hos pattedyr er mekanisk aktiverte kanaler avgjørende for påvisning av eksterne og interne stimuli i prosesser så forskjellige som berøringsfølelse, hørsel, regulering av røde blodlegemer, basal blodtrykksregulering og følelsen av urinblærefylde. Mens funksjonen til mekanisk aktiverte ionkanaler har blitt grundig studert in vitro-innstillingen ved hjelp av patch-clamp-teknikken, er det fortsatt en vanskelig oppgave å vurdere deres funksjon i deres opprinnelige miljø, ofte på grunn av begrenset tilgang til ekspresjonsstedene til disse kanalene (f.eks. afferente terminaler, Merkel-celler, baroreceptorer og nyretubuli) eller vanskeligheter med å anvende patch-clamp-teknikken (f.eks. de apikale overflatene til urotelparaplyceller). Denne protokollen beskriver en prosedyre for å vurdere mekanisk fremkalte Ca 2+-transienter ved bruk av fluorescerende sensor GCaMP5G i et ex vivo urotelpreparat, en teknikk som lett kan tilpasses for studier av mekanisk fremkalte Ca2+-hendelser i andre innfødte vevspreparater.
Introduction
Epitelceller i urinveiene blir utsatt for mekaniske krefter når urinfiltratet beveger seg gjennom nefronene, og urinen pumpes ut av nyrebekkenet og beveger seg gjennom urinlederne som skal lagres i urinblæren. Det har lenge vært anerkjent at mekaniske krefter (f.eks. skjærspenning og strekk) som utøves av væsker på epitelcellene som strekker urinveiene, regulerer reabsorpsjonen av protein i proksimale tubuli og av løsemidler i distale nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, samt lagring av urin i urinblære og vannlating14,15,16,17.
Omdannelsen av mekaniske stimuli til elektriske og biokjemiske signaler, en prosess referert til som mekanotransduksjon, formidles av proteiner som reagerer på deformasjonen av cellulære strukturer eller den tilhørende ekstracellulære matrisen 18,19,20,21. Mekanisk aktiverte ionkanaler er unike i den forstand at de overgår fra en lukket tilstand til en åpen permeabel tilstand som svar på endringer i membranspenning, trykk eller skjærspenning 18,19,20,21,22. I tillegg kan Ca 2+-transienter initieres ved integrinmediert mekanotransduksjon eller ved aktivering av mekanoresponsive adhesjonssystemer ved celle-celle-kryss23,24,25,26. Ionkanalfunksjonen vurderes vanligvis med patch-clamp-teknikken, som innebærer dannelse av en gigaohm-tetning mellom cellemembranen og patchpipetten27. Imidlertid er celler som ligger i dype vevslag med en tett ekstracellulær matriks (f.eks. nyretubuli) eller omgitt av en fysisk barriere (f.eks. Glykokalyx) vanskelig tilgjengelige med en glassmikropipette. På samme måte kan celler som er innebygd eller som er integrerte deler av vev med dårlig mekanisk stabilitet (f.eks. Urotelet) ikke lett studeres med patch-clamp-teknikken. Fordi mange mekanisk aktiverte ionkanaler er gjennomtrengelige for Ca 2+, er en alternativ tilnærming å vurdere deres aktivitet ved fluorescerende mikroskopi ved hjelp av et Ca2+-følsomt fargestoff eller genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) som GCaMP. Nylige anstrengelser innen proteinteknikk har betydelig økt det dynamiske området, følsomheten og responsen til GECI28,29,30, og fremskritt innen genetikk har tillatt deres uttrykk i spesifikke cellepopulasjoner, noe som gjør dem ideelle til å studere mekanotransduksjon.
Urotelet, det stratifiserte epitelet som dekker det indre av urinblæren, fungerer som en barriere og forhindrer diffusjon av urinoppløsninger i blæreinterstitium, men fungerer også som transduser, registrerer blærefylde og kommuniserer disse hendelsene til underliggende nerver og muskulatur16. Tidligere studier har vist at kommunikasjonen mellom urotelet og underliggende vev krever de mekanisk aktiverte ionkanalene Piezo1 og Piezo231. For å vurdere mekanisk induserte Ca 2+-transienter i urotelceller, ble det utviklet en ny teknikk beskrevet som bruker adenoviral genoverføring for å uttrykke Ca2+-sensoren GCaMP5G i urotelceller. Denne teknikken benytter et slimhinnearkpreparat som gir enkel tilgang til det ytterste paraplycellelaget og et datamaskinassistert system for samtidig mekanisk stimulering av individuelle celler med en lukket glassmikropipette og registrering av endringer i fluorescens over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleie og håndtering av dyrene ble utført i samsvar med University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Hunn, 2-4 måneder gamle C57Bl/6J-mus ble brukt til denne studien. Musene ble oppnådd kommersielt (se materialtabell).
1. Montering og oppsett av utstyr
- Utfør Ca2+ avbildning med et oppreist mikroskop utstyrt med et høyoppløselig kamera og en stabil lyskilde (se Materialfortegnelse).
- Skaff bildene med en mikroskopkompatibel programvare som tillater direkte styring av kameraet, lyskilden og piezoaktuatoren via en USB digital I / O-enhet (se materialfortegnelsen).
MERK: Figur 1 representerer et skjema over oppsettet. GCaMP5G har en topp eksitasjonsbølgelengde på 470 nm og en topputslippsbølgelengde på 497 nm28. Bruk en filterkube som er egnet for GCaMP5G-bildebehandling.
- Skaff bildene med en mikroskopkompatibel programvare som tillater direkte styring av kameraet, lyskilden og piezoaktuatoren via en USB digital I / O-enhet (se materialfortegnelsen).
- For stimulering av individuelle urotelceller i blæreslimhinnepreparatet (se trinn 2), bruk en piezoelektrisk aktuator styrt av en enkanals piezokontroller med åpen sløyfe (se materialfortegnelse). Monter den piezoelektriske aktuatoren i en mikromanipulator.
- Monter glassmikropipettene i en pipetteholder festet til den piezoelektriske aktuatoren (figur 1). Fjernstyr piezokontrolleren med en analog/digital omformer styrt av et elektrofysiologisk datainnsamlings- og analyseprogram (se Materialfortegnelse).
MERK: En ekstern utløser, i form av et transistor-transistor-logikk (TTL) signal initiert av bildebehandlingsprogramvaren, brukes til å utløse stimuleringsprotokollen i elektrofysiologiens datainnsamlings- og analyseprogramvare som beveger den piezoelektriske aktuatoren (figur 1).
- Monter glassmikropipettene i en pipetteholder festet til den piezoelektriske aktuatoren (figur 1). Fjernstyr piezokontrolleren med en analog/digital omformer styrt av et elektrofysiologisk datainnsamlings- og analyseprogram (se Materialfortegnelse).
- Kontroller at bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse) har grensesnitt mot den digitale I/U-enheten. Konfigurer en digital utgangskanal i den digitale USB-I/O-enheten for å levere TTL-signalet til den analoge/digitale omformeren, som vil starte protokollen i elektrofysiologiprogramvaren som beveger den piezoelektriske aktuatoren.
- Bruk en kabel til å koble Start BNC-porten i den analoge/digitale omformeren til bakken (GND) og en skrueterminal i den digitale USB-I/O-enheten.
- Sett opp opptaksprotokollen i bildebehandlingsprogramvaren.
MERK: Følgende trinn beskriver hvordan du genererer en protokoll som sender et TTL-signal og begynner å samle inn bilder ved angitte tidsintervaller.- Konfigurer innhentingsprotokollen i bildebehandlingsprogramvaren ved å klikke på Experiment Manager og velge New Experiment. Et nytt vindu åpnes.
- Velg ikonet Time Lapse Loop og dra det til det nyåpnede vinduet; Sett antall sykluser til 2 og intervallet til den raskeste innstillingen som er tillatt i oppsettet.
- Fra ikonet Overført lukker / manuell lukker, velg ikonet NI USB-6501 og dra det inn i Time Lapse Loop-vinduet, og sett deretter NI USB-6501 som lukket. Dra en ekstra NI USB-6501 fra den overførte lukkeren / manuell lukker til tidsforløpssløyfevinduet og sett den som åpen. For å koble til de to NI USB-6501-ikonene, dra pilspissen på siden av NI USB-6501 lukket ikon og trekk til den berører NI USB-6501 åpne ikonet. En linje som forbinder begge ikonene vises.
- Dra en annen tidsforløpssløyfe til Experiment Manager-vinduet , og koble den til den første ved å dra i pilspissen. Angi parametrene for opptak. Sett antall sykluser i den nye tidsforløpssløyfen til 2400.
- Fra Image Acquisition-ikonet drar du GFP-filteret til den nylig åpnede Time Lapse Loop og setter eksponeringstiden til 100 ms.
- Sett kameraets bildetype til 8-biters, oppløsning til 576 x 576 (Binning 4 x 4), pikselklokke til 480 MHz og Hot pixel-korrigering til standard.
MERK: Parametrene kan justeres avhengig av uttrykksnivået til fluorescerende sensor, kamerafølsomhet og oppsettkonfigurasjon.
- Sett opp laboratoriebenken i elektrofysiologiprogramvaren (se Materialfortegnelse).
MERK: Dette vil definere utgangssignalet i mV til den analoge / digitale omformeren.- Gå til Konfigurer-menyen i elektrofysiologiprogramvaren og velg Labbenk. I det resulterende Output Signals-vinduet velger du Analog Out #1, trykker på Legg til signal og navngir det (f.eks. Sett signalenheten til mV og skaleringsfaktoren (mV/V) til 1.
- Generer en stimuleringsprotokoll i elektrofysiologiprogramvaren ved å følge trinnene nedenfor.
- For å generere en ny stimuleringsprotokoll i elektrofysiologiprogramvaren, gå til menypunktet Skaff og velg Ny protokoll.
- Sett Modus/Frekvens til Episodisk stimulering, Kjør/Forsøk til 1, Sveip/kjør til 1 og Sveip varighet(er) til 150.
- I Utganger-menyen velger du kanal #1 Piezo som Analog ut.
- I Trigger-menyen setter du utløseren til Digitizer Start Input og Internal Timer.
- I Bølgeform-menyen velger du kanal #1 og Analog bølgeform med Epoker. Sett trinn A til trinn, første nivå til 0, deltanivå til 0, første varighet til 10000 og deltavarighet til 0.
- Sett Trinn B til trinn, første nivå til 10, deltanivå til 0, første varighet til 1000 og deltavarighet til 0. Sett Trinn C til trinn, første nivå til 0, deltanivå til 0, første varighet til 130000 og deltavarighet til 0.
- Lagre protokollen og gi den navnet Stimuleringsprotokoll.
- Bruk en BNC-kabel til å koble analog utgang #1 i den analoge/digitale omformeren til EXT INPUT foran på den enkanals piezokontrolleren med åpen sløyfe (se materialfortegnelsen).
- Fremstill glassmikropipetter for mekanisk stimulering av paraplyceller fra kapillærglassrør ved å følge trinnene nedenfor.
- Plasser kapillærglasset i en avtrekker (se Materialfortegnelse) og juster det med kapillærholderknappene.
- Plasser varmeapparatet i full høyde. Juster den første glidebryteren for avslutningsposisjon på avtrekkeren til 5.
- Sett den første varmeknappen til 76,7 og den andre knappen til 52,7.
- Trekk glasskapillæren i to trinn ved å trykke på startknappen.
- Lukk spissen på mikropipetten med en mikroforge (se materialfortegnelse) med varmeapparatets justeringsknapp satt til 60.
MERK: For denne protokollen er den endelige diameteren på mikropipettespissen som brukes til å stikke individuelle celler ~1-3 μm.
- Kontroller at den stimulerende mikropipetten beveger avstanden som er angitt i stimuleringsprotokollen.
MERK: Følgende trinn er for å sikre at 12,5 s etter initiering av stimuleringsprotokollen i elektrofysiologiprogramvaren genereres en spenningspuls med en varighet på 1 s, slik at den piezoelektriske aktuatoren beveger seg 20 μm.- Monter en mikropipette i holderen og fest den til den piezoelektriske aktuatoren.
- Plasser den piezoelektriske aktuatoren og den vedlagte mikropipetten parallelt med midten av mikroskoptrinnet og innenfor synsområdet.
- Fokuser på pipettens spiss og immobiliser den piezoelektriske monteringsstangen (se materialfortegnelse) med tape. Under lys feltbelysning justerer du kameraparametrene for å få et klart bilde av pipettespissen.
- Åpne Stimulation-protokollen i elektrofysiologiprogramvaren og sett den til å spille.
MERK: Elektrofysiologiprotokollen starter ikke før TTL-signalet som sendes fra bildebehandlingsprogramvaren, er mottatt. - Fra Experiment Manager i bildebehandlingsprogramvaren trykker du på Start for å starte datainnsamlingen.
MERK: Dette vil utløse protokollen i elektrofysiologiprogramvaren, som vil drive den piezoelektriske aktuatoren. Protokollen i bildebehandlingsprogramvaren vil generere en fil med bildene av eksperimentet.
- Kontroller tilbakelagt distanse av pipetten ved å følge trinnene nedenfor.
- Hvis du vil måle avstanden pipetten har tilbakelagt under stimuleringsprotokollen, velger du elementet Count and Measure i bildebehandlingsprogramvaren.
- Fra Mål-menyen velger du alternativet Måling og avkastning, og et nytt vindu vises under filmvinduet.
- Fra Mål-menyen velger du Vilkårlig linje.
- I filmvinduet tegner du en vilkårlig linje som starter ved pipettens spiss. Merk at slutten av den vilkårlige linjen vil bli justert senere.
- Høyreklikk på den vilkårlige linjen for å konvertere linjen til en interesseregion (ROI), som vil være synlig i alle filmrammer.
- Inspiser filmen og juster enden av vilkårlig linje (ROI) til den endelige posisjonen som pipetten har reist som svar på stimulansen.
MERK: Avstanden pipetten har tilbakelagt i μm vises i vinduet Måling og avkastning . Stimuleringsprotokollen kan endres i henhold til brukerens behov.
2. In situ transduksjon og isolering av blæreslimhinnen
- Transduce kvinnelige museblærer in situ med et adenovirus som koder for cDNA av CGaMP5G i henhold til prosedyren beskrevet i virustransduksjonsprotokollen31.
- Ved transdusering av urotelceller for Ca2+ bildeeksperimenter, innpode blærene med 50 μL av løsningen inneholdende 2 x 107 infeksiøse viruspartikler (IVP).
MERK: Denne teknikken har en tendens til å begrense uttrykket av CGaMP5G til paraplycellelaget. Alternativt kan eksperimenter utføres med urinblærer høstet fra transgene mus som uttrykker CGaMP5G i urotelceller (dvs. GCaMP5G-uttrykk drevet av en uroplakin-2-promotor) eller en hvilken som helst annen celletype av interesse.
- Ved transdusering av urotelceller for Ca2+ bildeeksperimenter, innpode blærene med 50 μL av løsningen inneholdende 2 x 107 infeksiøse viruspartikler (IVP).
- 24-72 timer etter transduksjon, avlive musene ved CO2 -kvelning og utfør en torakotomi ved å åpne brysthulen med saks for å få lungene til å kollapse.
- Kok urinrøret med et 24 G kateter. Eksponer blæren med et abdominal snitt på ~ 1,5 cm gjennom huden og muskelen, og bruk en 6,0 sutur (se materialtabell) for å feste kateteret til urinrøret.
- Høst blæren og urinrøret 32 og fest den på en holderpute av silikongummi (se materialfortegnelsen) badet i opptaksoppløsning inneholdende (i mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl2, 10 glukose, 10 HEPES, pH 7,4 og boblet opp med 100 % O2 (figur 2A).
- Separer blæreslimhinnen fra underliggende muskellag med fin tang etter tidligere publiserte rapporter32 (figur 2B).
- Skjær opp blæreslimhinnen og fest den ned med urotelet vendt opp mot en silikonelastomerinnsats i bunnen av en 35 mm diameter vevsdyrket tallerken (figur 2C).
3. Mekanisk stimulering av individuelle urotelceller og Ca2+ avbildning
- Monter vevskultivskålen med den festede blæreslimhinnen i mikroskoptrinnet utstyrt med en kulturoppvaskinkubator med resistive varmeelementer (figur 2E). Perfus (i henhold til produsentens instruksjoner, se materialfortegnelse) cellekulturskålen kontinuerlig med en hastighet på 1,7 ml / min med opptaksoppløsning varmet opp ved ~ 37 ° C med en in-line varmeapparat.
- Oppretthold temperaturen på vevsparabolinkubatoren og løsningene ved ~37 °C med en tokanals bipolar temperaturregulatormodell (se materialfortegnelse). Balansere vevet i kammeret med kontinuerlig perfusjon i minst 15 minutter før du utfører ytterligere eksperimentelle prosedyrer.
- For å registrere mekanisk induserte Ca2+ transienter, senk mikropipetten i løsningen som bader den festede blæreslimhinnen i vevsfatet. Flytt mikropipetten til midten av feltet ved hjelp av et skanningsmål med lav forstørrelse (4x) ved hjelp av lys feltbelysning.
- Beveg mikropipetten nær overflaten av urotelvevet ved å bevege mikromanipulatoren koordinat i vertikalplanet og justere fokus.
- Bytt objektivet til et med høyere forstørrelse (20x) egnet for immunfluorescens med høy numerisk blenderåpning (NA).
- Sett mikromanipulatoren til Fine og flytt mikropipetten nær toppen av målcellen.
- Endre synsfeltet til kamera og trykk Live i bildebehandlingsprogramvaren.
MERK: Dette må slå på den reflekterte lukkeren og tillate observasjon av det fluorescerende signalet som sendes ut fra vevet i datamaskinen. - Juster fokus for å visualisere toppen av cellen og juster pipettens posisjon om nødvendig.
- Åpne Stimulation-protokollen i elektrofysiologiprogramvaren og sett den til å spille.
MERK: Protokollen i elektrofysiologiprogramvaren starter ikke før TTL-signalet som sendes fra bildebehandlingsprogramvaren, er mottatt. - Fra Experiment Manager i bildebehandlingsprogramvaren trykker du på Start for å starte datainnsamlingen. Dette vil utløse protokollen i elektrofysiologiprogramvaren, som vil drive den piezoelektriske aktuatoren og generere en fil med bildene av eksperimentet. Stimuleringsprotokollen kan endres i henhold til brukerens behov.
4. Dataanalyse
- Kvantifiser fluorescensintensiteten over tid ved å følge trinnene nedenfor.
- Åpne bildefilen i bildebehandlingsprogramvaren og velg vinduet Tell og mål . Velg polygonverktøyet og tegn en avkastning på grensene til cellen som ble stukket.
- Gå til målevinduet, velg Intensitetsprofil, sett målingen til Over tid, Resultater til gjennomsnitt, Bakgrunnssubtraksjon til ingen, og trykk deretter på Utfør. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet vil bli beregnet over tid (figur 3).
- For å eksportere intensitetsprofildataene, klikk på Excel-ikonet i vinduet Intensitetsprofilresultater . Dette lar brukeren velge målmappe og filnavn og lagre dataene i et .xlsx format.
- Utfør dataanalyse ved hjelp av vitenskapelig grafisk og dataanalyseprogramvare (se Materialliste).
MERK: Amplituden til Ca2+ -toppen fremkalt ved poking uttrykkes som endringen i fluorescensintensitet (ΔF / F), hvor F er fluorescensintensiteten til GCaMP5G på tidspunktet 0, og ΔF er forskjellen mellom fluorescensintensitetmaksima og basal på tidspunkt 0. Forfallet av Ca2+ responsen kan også beregnes (ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nåværende protokollen beskriver en teknikk for å vurdere mekanisk fremkalte Ca 2+-transienter i paraplyceller ved bruk av den fluorescerende Ca2+-sensoren GCaMP5G. Adenoviral transduksjon ble brukt til å uttrykke GCaMP5G i urotelceller på grunn av sin høye effektivitet og fordi den produserer et forhøyet ekspresjonsnivå. Fluorescerende bilder av fargede kryoseksjoner fra en transdusert blære er vist i figur 2D. For disse eksperimentene er GCaMP5G-uttrykket høyest i paraplycellelaget. En sekvens av representative bilder tatt under et eksperiment der en paraplycelle ble stukket, er vist i figur 3A. Det første bildet i figur 3A viser et fluorescerende bilde av den stimulerende pipetten plassert på toppen av en paraplycelle i en blæreslimhinne som uttrykker GCaMP5G. Mekanisk stimulering av paraplycellen som uttrykker GCaMP5G forårsaker en deformasjon (se bilde figur 3A ved 12,5 s), etterfulgt av en rask økning i fluorescensutslippet (se bilde figur 3A ved 13,5 s). Endringen i fluorescens ble plottet som en funksjon av tid (figur 3B). Som rapportert tidligere31, fremkaller poking en Ca2+ respons i de fleste paraplyceller testet i blærer fra kontroll og villtype mus transducert med GCaMP5G. Sletting av Piezo1 og Piezo2 fra paraplyceller reduserte toppamplituden til Ca2+ responsen31. Når man sammenligner effekten av ulike behandlinger eller genetisk bakgrunn på mekanisk fremkalte Ca2+ responser, er det viktig å standardisere de eksperimentelle forholdene, inkludert transduksjon av blæren, montering av vevet, størrelsen på pipettspissen som brukes til fordypning, mekanisk stimulusvarighet og amplitude og avbildningsforhold.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett for registrering av mekanoaktiverte Ca2+ -transienter i urotelceller. Riggen består av et stående mikroskop, fluorescerende lyskilde, eksitasjons- og utslippsfiltre og et CMOS-kamera. Bildebehandlingsprogramvaren styrer systemet. En piezoelektrisk aktuator styrt av en enkanals piezokontroller med åpen sløyfe brukes til å bevege den pokende mikropipetten. Glassmikropipetter er montert i en pipetteholder festet til den piezoelektriske aktuatoren. Den piezoelektriske aktuatoren og tilhørende mikropipett er montert på en mikromanipulator (ikke vist). Piezo open-loop-kontrolleren fjernstyres av en analog/digital omformer og programvare for elektrofysiologi. En opptaksprotokoll i bildebehandlingsprogramvaren leverer et TTL-signal via en digital I / O-enhet, og dette starter stimuleringsprotokollen i elektrofysiologiprogramvaren som styrer den piezoelektriske og senere bildeopptaket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Isolering og montering av blæreslimhinnen ved Ca2+ bildebehandling. (A) Slimhinneplatepreparat med vedlagt kateter. Blæreslimhinnen ble strippet fra det underliggende muskellaget med fin tang. (B) Forstørret bilde av den strippede blæreslimhinnen vist i panel (A). (C) Slimhinnen ble festet med urotelet vendt opp med 0,15 mm insektpinner til en silikonelastomerinnsats. (D) Konfokale immunfluorescenstverrsnittsbilder av slimhinneplatepreparatet farget med et antistoff mot GFP og et sekundært esel-antikaninkonjugert antistoff (grønn), rhodamin-falloidin (rød) og DAPI (blå). Blæreslimhinnepreparatet inneholder en del av lamina propria (LP). Pilene indikerer plasseringen av paraplycellelaget (Ub). Skalastenger = 50 μm. (E) Fotografi av eksperimentelt oppsett. a, in-line varmeapparat; b, piezoelektrisk aktuator; c, varmeelementer og kontroller; d, pipetteholder og mikropipette; e, slimhinneark festet til silikoninnsatsen i en vevsdyrket tallerken og oppvaskinkubator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Registrering og analyse av mekanoaktiverte Ca2+ -transienter i urotelceller. (A) Sekvens av fluorescerende bilder tatt på forskjellige tidspunkter i løpet av et eksperiment. Merk at mekanisk stimulering av paraplycellen forårsaker en deformasjon etterfulgt av en rask økning i utslipp av GCaMP5G (pil). Grensene til den stimulerte cellen (ROI) er markert med rødt. (B) Endring i fluorescensintensitet (ΔF / F) over tid for åtte uavhengige mekanisk stimulerte celler i et blæreslimhinnepreparat fra en kontrollmus. Innrykkstidspunktet (12,5 s) er merket med en blå pil. Dataene i (B) er modifisert fra Dalghi et al.31. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle organismer, og tilsynelatende de fleste celletyper, uttrykker ionekanaler som reagerer på mekaniske stimuli 20,33,34,35,36,37. Funksjonen til disse mekanisk aktiverte kanalene har blitt overveiende vurdert med patch-clamp-teknikken. På grunn av tilgjengelighetsproblemer har imidlertid patch-klemmestudier av mekanisk aktiverte ionkanaler i stor grad vært begrenset til dissosierte celler og cellelinjer. Siden mange mekanisk aktiverte ionekanaler er gjennomtrengelige for Ca2+, benyttet vi oss av de siste fremskrittene innen mikroskopi, biosensing og mikromanipulering for å utvikle en avbildningsmetode for å vurdere funksjonen til mekanisk aktiverte kanaler i et ex vivo urotelpreparat. I denne protokollen blir urotelceller transdusert med et adenovirus-koding for GCaMP5G. Adenovirale vektorer er ideelt egnet for å studere Ca 2+-signalering i urotelet, da de gir en høy transduksjonshastighet og høye ekspresjonsnivåer av GCaMP5G i urotelceller (figur 2D). Under disse forholdene er bakgrunnsfluorescens relativt lav. Hvis adenoviral transduksjon brukes til å uttrykke en genetisk kodet Ca2+ sensor, bør det legges spesiell vekt på å optimalisere forholdene, slik at bare cellene av interesse uttrykker sensoren. Som et alternativ kan ekspresjon av genetisk kodede Ca2+ indikatorer (GECI) oppnås ved å krysse mus som bærer et floxed transgen som koder for proteinet av interesse (f.eks. GCaMP5G) og mus som uttrykker Cre recombinase under kontroll av en egnet promotor. Denne tilnærmingen krever ikke kirurgiske prosedyrer og har fordelen av å gi målrettet ekspresjon og jevne ekspresjonsnivåer av proteiner i celler som uttrykker Cre recombinase.
Protokollen beskrevet her bruker et oppreist vidfeltmikroskop for å vurdere mekanisk aktiverte Ca2+ transienter i paraplyceller stimulert med en lukket brannpolert mikropipette. Metoden kan tilpasses for å studere mekanotransduksjon i dypere lag av urotelet eller til og med celler i lamina propria med et oppreist konfokal eller to-foton mikroskop. Ved hjelp av et konfokalmikroskop kan det gi den nødvendige oppløsningen for å definere subcellulære endringer i intracellulær Ca2 + som oppstår som respons på mekanisk stimulering. Denne protokollen bruker en lukket, brannpolert mikropipette for å peke på individuelle paraplyceller. Den største fordelen ved å bruke en mikropipette for stimulering er at den mekaniske forstyrrelsen som utøves på vevet, er forbigående og begrenset til cellen av interesse og omgivelsene. Mens cellestrekkingssystemer kan brukes til mekanisk å stimulere celler dyrket på PDMS-membraner, hindrer iboende begrensninger bruken av slike enheter for avbildningseksperimenter med ex vivo-preparater . Disse begrensningene inkluderer utfordringer med montering og avbildning av en museblære og, gitt blæreslimhinnens foldede natur, vanskeligheter med å opprettholde fokus på cellene av interesse mens du strekker vevet.
Protokollen for å måle mekanisk aktiverte Ca2+ -transienter i urotelpreparater har noen begrensninger. For det første inneholder riggen relativt dyre komponenter, og montering og oppsett krever kompetanse med mikroskoper, mikromanipulatorer, analog-digitale omformere og relativt spesialisert programvare. Som patch-klemming krever denne teknikken at etterforskeren lærer å bruke en mikromanipulator og lage glassmikropipetter for mekanisk stimulering. Imidlertid, i motsetning til patch-clamp-teknikken, som innebærer dannelse av en tetning med høy motstand mellom pipetten og membranen, er prosedyren beskrevet her for å måle mekanisk aktiverte Ca2+ transienter relativt enkel og krever bare at etterforskeren plasserer den stimulerende pipetten nær overflaten av cellen som skal stimuleres. Derfor kan en utdannet etterforsker potensielt vurdere responsen på poking av 8-10 celler på 1 time, noe som er utenkelig med patch-clamp teknikk.
Gitt betydningen som mekanisk aktiverte ionkanaler har i normale kroppsfunksjoner og sykdomstilstander, er det behov for nye metoder for å studere disse kanalene i sitt opprinnelige miljø. Som beskrevet i denne protokollen, kan avbildningsmetoder gi unik innsikt i hvordan disse kanalene registrerer endringer i miljøet og genererer fysiologiske responser. Gitt tilgjengeligheten av slimhinneoverflaten til de rør- eller sekkformede organene, kan metoden beskrevet her tilpasses for å studere mekanotransduksjon i andre innstillinger, inkludert tarmen, urogenitalkanalen, blodkar, etc. Dermed kan det være svært nyttig å studere mekaniske responser i kroppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01DK119183 (til GA og MDC) og S10OD028596 (til GA) og av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A.
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al.
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J.
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
