Summary
Dit protocol beschrijft een methodologie om de functie van mechanisch geactiveerde ionkanalen in inheemse urotheliale cellen te beoordelen met behulp van de fluorescerende Ca2+ sensor GCaMP5G.
Abstract
Mechanisch geactiveerde ionkanalen zijn biologische transducers die mechanische stimuli zoals rek- of schuifkrachten omzetten in elektrische en biochemische signalen. Bij zoogdieren zijn mechanisch geactiveerde kanalen essentieel voor de detectie van externe en interne stimuli in processen die zo divers zijn als tastsensatie, gehoor, volumeregulatie van rode bloedcellen, basale bloeddrukregulatie en het gevoel van volheid van de urineblaas. Hoewel de functie van mechanisch geactiveerde ionkanalen uitgebreid is bestudeerd in de in vitro setting met behulp van de patch-clamp-techniek, blijft het beoordelen van hun functie in hun oorspronkelijke omgeving een moeilijke taak, vaak vanwege beperkte toegang tot de expressieplaatsen van deze kanalen (bijv. Afferente terminals, Merkel-cellen, baroreceptoren en niertubuli) of moeilijkheden bij het toepassen van de patch-clamp-techniek (bijv. de apicale oppervlakken van urotheliale paraplucellen). Dit protocol beschrijft een procedure om mechanisch opgewekte Ca 2+ transiënten te beoordelen met behulp van de fluorescerende sensor GCaMP5G in een ex vivo urotheliaal preparaat, een techniek die gemakkelijk kan worden aangepast voor de studie van mechanisch opgewekte Ca2+ gebeurtenissen in andere inheemse weefselpreparaten.
Introduction
Epitheelcellen in de urinewegen worden onderworpen aan mechanische krachten terwijl het urinefiltraat door de nefronen reist en urine uit het nierbekken wordt gepompt en door de urineleiders reist om in de urineblaas te worden opgeslagen. Het is al lang bekend dat mechanische krachten (bijv. schuifspanning en rek) uitgeoefend door vloeistoffen op de epitheelcellen die de urinewegen bekleden, de reabsorptie van eiwit in de proximale tubulus en van opgeloste stoffen in het distale nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 reguleren, 12,13, evenals de opslag van urine in de urineblaas en mictie14,15,16,17.
De omzetting van mechanische stimuli in elektrische en biochemische signalen, een proces dat mechanotransductie wordt genoemd, wordt gemedieerd door eiwitten die reageren op de vervorming van cellulaire structuren of de bijbehorende extracellulaire matrix 18,19,20,21. Mechanisch geactiveerde ionkanalen zijn uniek in de zin dat ze overgaan van een gesloten toestand naar een open permeabele toestand als reactie op veranderingen in membraanspanning, druk of schuifspanning 18,19,20,21,22. Daarnaast kunnen Ca 2+ transiënten worden geïnitieerd door integrine-gemedieerde mechanotransductie of door activering van mechanoresponsieve adhesiesystemen bij cel-cel juncties23,24,25,26. De ionkanaalfunctie wordt meestal beoordeeld met de patch-clamp-techniek, waarbij een gigaohm-afdichting wordt gevormd tussen het celmembraan en de patchpipet27. Cellen in diepe weefsellagen met een dichte extracellulaire matrix (bijv. Niertubuli) of omgeven door een fysieke barrière (bijv. Glycocalyx) zijn echter moeilijk toegankelijk met een glazen micropipette. Evenzo kunnen cellen die zijn ingebed of die integraal deel uitmaken van weefsels met een slechte mechanische stabiliteit (bijvoorbeeld het urothelium) niet gemakkelijk worden bestudeerd met de patch-clamp-techniek. Omdat veel mechanisch geactiveerde ionkanalen doorlaatbaar zijn voor Ca 2+, is een alternatieve benadering om hun activiteit te beoordelen door middel van fluorescerende microscopie met behulp van een Ca2+-gevoelige kleurstof of genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECIs) zoals GCaMP. Recente inspanningen op het gebied van eiwittechnologie hebben het dynamische bereik, de gevoeligheid en de respons van GECI's28,29,30 aanzienlijk verhoogd en de vooruitgang in de genetica heeft hun expressie in specifieke celpopulaties mogelijk gemaakt, waardoor ze bij uitstek geschikt zijn om mechanotransductie te bestuderen.
Het urothelium, het gestratificeerde epitheel dat het binnenste van de urineblaas bedekt, functioneert als een barrière, voorkomt de diffusie van urine-opgeloste stoffen in het blaasinterstitium, maar functioneert ook als een transducer, die de volheid van de blaas waarneemt en deze gebeurtenissen communiceert met de onderliggende zenuwen en spieren16. Eerdere studies hebben aangetoond dat de communicatie tussen het urotheel en onderliggende weefsels de mechanisch geactiveerde ionkanalen Piezo1 en Piezo231 vereist. Om mechanisch geïnduceerde Ca 2+ transiënten in urotheliale cellen te beoordelen, werd een nieuwe techniek ontwikkeld die adenovirale genoverdracht gebruikt om de Ca2+ sensor GCaMP5G in urotheliale cellen tot expressie te brengen. Deze techniek maakt gebruik van een mucosale plaatvoorbereiding die gemakkelijke toegang biedt tot de buitenste paraplucellaag en een computerondersteund systeem voor de gelijktijdige mechanische stimulatie van individuele cellen met een gesloten glazen micropipette en registratie van veranderingen in fluorescentie in de loop van de tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De verzorging en behandeling van de dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Vrouwelijke, 2-4 maanden oude C57Bl / 6J-muizen werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden commercieel verkregen (zie Tabel van Materialen).
1. Montage en installatie van apparatuur
- Voer Ca2+ beeldvorming uit met een rechtopstaande microscoop die is uitgerust met een camera met hoge resolutie en een stabiele lichtbron (zie materiaaltabel).
- Verkrijg de beelden met een microscoopcompatibele software die directe bediening van de camera, lichtbron en piëzo-actuator mogelijk maakt via een digitaal USB-I/O-apparaat (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Figuur 1 geeft een schema weer van de opstelling. GCaMP5G heeft een piekexcitatiegolflengte van 470 nm en een piekemissiegolflengte van 497 nm28. Gebruik een filterkubus die geschikt is voor GCaMP5G-beeldvorming.
- Verkrijg de beelden met een microscoopcompatibele software die directe bediening van de camera, lichtbron en piëzo-actuator mogelijk maakt via een digitaal USB-I/O-apparaat (zie Materiaaltabel).
- Gebruik voor de stimulatie van individuele urotheelcellen in het blaasslijmvliespreparaat (zie stap 2) een piëzo-elektrische actuator die wordt bestuurd door een piëzocontroller met één kanaal met open lus (zie materiaaltabel). Monteer de piëzo-elektrische actuator in een micromanipulator.
- Monteer de glazen micropipetten in een pipethouder die op de piëzo-elektrische actuator is bevestigd (figuur 1). Bedien de piëzocontroller op afstand met een analoge/digitale converter die wordt bestuurd door een elektrofysiologisch data-acquisitie- en analyseprogramma (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Een externe trigger, in de vorm van een transistor-transistor logica (TTL) signaal geïnitieerd door de beeldvormingssoftware, wordt gebruikt om het stimulatieprotocol te activeren in de elektrofysiologische data-acquisitie- en analysesoftware die de piëzo-elektrische actuator beweegt (figuur 1).
- Monteer de glazen micropipetten in een pipethouder die op de piëzo-elektrische actuator is bevestigd (figuur 1). Bedien de piëzocontroller op afstand met een analoge/digitale converter die wordt bestuurd door een elektrofysiologisch data-acquisitie- en analyseprogramma (zie Materiaaltabel).
- Zorg ervoor dat de beeldbewerkingssoftware (zie materiaaltabel) is gekoppeld aan het digitale I/O-apparaat. Configureer een digitaal uitgangskanaal in het digitale USB-I/O-apparaat om het TTL-signaal af te leveren aan de analoge/digitale converter, die het protocol initieert in de elektrofysiologische software die de piëzo-elektrische actuator beweegt.
- Gebruik een kabel om de Start BNC-poort in de analoge/digitale converter aan te sluiten op de aarde (GND) en een schroefaansluiting in het digitale USB-I/O-apparaat.
- Stel het opnameprotocol in de beeldbewerkingssoftware in.
OPMERKING: In de volgende stappen wordt beschreven hoe u een protocol genereert dat een TTL-signaal verzendt en begint met het verzamelen van afbeeldingen met opgegeven tijdsintervallen.- Stel het acquisitieprotocol in de beeldbewerkingssoftware in door op Experiment Manager te klikken en Nieuw experiment te selecteren. Er wordt een nieuw venster geopend.
- Selecteer het pictogram Time Lapse Loop en sleep het naar het nieuw geopende venster; Stel het aantal cycli in op 2 en het interval op de snelste instelling die is toegestaan in de installatie.
- Selecteer in het pictogram Transmitted Shutter/Manual Shutter het pictogram NI USB-6501 en sleep het naar het Time Lapse Loop-venster en stel vervolgens de NI USB-6501 in als gesloten. Sleep een extra NI USB-6501 van de Transmitted Shutter/Manual Shutter naar het Time Lapse Loop-venster en stel deze in als geopend. Om de twee NI USB-6501-pictogrammen aan te sluiten, sleept u de pijlpunt aan de zijkant van het NI USB-6501 gesloten pictogram en trekt u eraan totdat het het NI USB-6501 open pictogram raakt. Er verschijnt een lijn die beide pictogrammen met elkaar verbindt.
- Sleep een andere time-lapse-lus naar het venster Experimentbeheer en verbind deze met de eerste door aan de pijlpunt te trekken. Stel de parameters voor het opnemen in. Stel het aantal cycli van de nieuwe Time Lapse Loop in op 2400.
- Sleep het GFP-filter vanuit het pictogram Beeldacquisitie naar de onlangs geopende Time Lapse Loop en stel de belichtingstijd in op 100 ms.
- Stel het camerabeeldtype in op 8-bits, de resolutie op 576 x 576 (Binning 4 x 4), de pixelklok op 480 MHz en Hot pixel-correctie op standaard.
OPMERKING: De parameters kunnen worden aangepast afhankelijk van het expressieniveau van de fluorescentiesensor, de gevoeligheid van de camera en de configuratie van de instelling.
- Stel de Lab Bench in de elektrofysiologiesoftware in (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Hiermee wordt het uitgangssignaal in mV van de analoge/digitale converter gedefinieerd.- Ga naar het menu Configureren in de elektrofysiologische software en selecteer Lab Bench. Selecteer in het resulterende venster Uitgangssignalen de optie Analoog uit #1, druk op signaal toevoegen en geef het een naam (bijvoorbeeld "Piëzo"). Stel de signaaleenheid in op mV en de schaalfactor (mV/V) op 1.
- Genereer een stimulatieprotocol in de elektrofysiologische software volgens de onderstaande stappen.
- Als u een nieuw stimulatieprotocol wilt genereren in de elektrofysiologiesoftware, gaat u naar het menu-item Verkrijgen en selecteert u Nieuw protocol.
- Stel de modus/snelheid in op episodische stimulatie, run/trial op 1, sweep/run op 1 en sweepduur (s) op 150.
- Selecteer in het menu Uitgangen kanaal #1 Piezo als Analoog uit.
- Stel in het menu Trigger de trigger in op Digitizer Start Input en Internal Timer.
- Selecteer in het menu Golfvorm kanaal #1 en Analoge golfvorm met tijdperken. Stel stap A in op stap, eerste niveau op 0, deltaniveau op 0, eerste duur op 10000 en deltaduur op 0.
- Stel stap B in op stap, eerste niveau op 10, deltaniveau op 0, eerste duur op 1000 en deltaduur op 0. Stel stap C in op stap, eerste niveau op 0, deltaniveau op 0, eerste duur op 130000 en deltaduur op 0.
- Sla het protocol op en noem het stimulatieprotocol.
- Gebruik een BNC-kabel om analoge uitgang #1 in de analoge/digitale converter aan te sluiten op de EXT-ingang aan de voorkant van de eenkanaals open-loop piëzocontroller (zie materiaaltabel).
- Fabriceer glazen micropipetten voor de mechanische stimulatie van paraplucellen uit capillaire glazen buizen volgens de onderstaande stappen.
- Plaats het capillaire glas in een trekker (zie Materiaaltabel) en pas het aan met de capillaire bevestigingsknoppen.
- Plaats de verwarmingseenheid op de volledige hoogte. Stel de eerste schuifregelaar voor de eindpositie van de trekker in op 5.
- Zet de eerste verwarmingsknop op 76,7 en de tweede knop op 52,7.
- Trek in twee stappen aan het glazen capillair door op de startknop te drukken.
- Sluit de punt van de micropipette met een microforge (zie Materiaaltabel) met de instelknop van de kachel ingesteld op 60.
OPMERKING: Voor het huidige protocol is de uiteindelijke diameter van de micropipetpunt die wordt gebruikt voor het prikken van individuele cellen ~ 1-3 μm.
- Controleer of de stimulerende micropipette de afstand beweegt die is opgegeven in het stimulatieprotocol.
OPMERKING: De volgende stappen zijn om ervoor te zorgen dat 12,5 s na het initiëren van het stimulatieprotocol in de elektrofysiologische software een spanningspuls met een duur van 1 s wordt gegenereerd, waardoor de piëzo-elektrische actuator 20 μm beweegt.- Monteer een micropipette in de houder en bevestig deze aan de piëzo-elektrische actuator.
- Plaats de piëzo-elektrische actuator en de bijgevoegde micropipette evenwijdig aan het midden van de microscooptrap en binnen het gezichtsveld.
- Focus op de punt van de pipet en immobiliseer de piëzo-elektrische montagestang (zie Materiaaltabel) met tape. Pas onder heldere veldverlichting de cameraparameters aan om een duidelijk beeld van de pipetpunt te krijgen.
- Open het stimulatieprotocol in de elektrofysiologische software en stel het in om af te spelen.
OPMERKING: Het elektrofysiologieprotocol start pas als het TTL-signaal dat door de beeldvormingssoftware wordt verzonden, is ontvangen. - Druk vanuit Experiment Manager in de beeldbewerkingssoftware op Start om gegevensverzameling te starten.
OPMERKING: Dit activeert het protocol in de elektrofysiologische software, die de piëzo-elektrische actuator aandrijft. Het protocol in de beeldvormingssoftware genereert een bestand met de afbeeldingen van het experiment.
- Controleer de afstand die door de pipet wordt afgelegd aan de hand van de onderstaande stappen.
- Als u de afstand wilt meten die de pipet tijdens het stimulatieprotocol heeft afgelegd, selecteert u het item Tellen en meten in de beeldbewerkingssoftware.
- Selecteer in het menu Meten de optie Meting en ROI en er verschijnt een nieuw venster onder het filmvenster.
- Kies in het menu Meten de willekeurige lijn.
- Teken in het filmvenster een willekeurige lijn die begint bij de punt van de pipet. Houd er rekening mee dat het einde van de willekeurige regel later wordt aangepast.
- Klik met de rechtermuisknop op de willekeurige regel om de lijn om te zetten in een interessegebied (ROI), dat zichtbaar is in alle filmframes.
- Inspecteer de film en pas het einde van de willekeurige lijn (ROI) aan op de uiteindelijke positie die door de pipet wordt afgelegd als reactie op de stimulus.
OPMERKING: De afstand die de pipet in μm aflegt, wordt weergegeven in het venster Meting en ROI . Het stimulatieprotocol kan worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker.
2. In situ transductie en isolatie van het blaasslijmvlies
- Transduceer vrouwelijke muizenblazen in situ met een adenovirus dat codeert voor het cDNA van CGaMP5G volgens de procedure beschreven in het virustransductieprotocol31.
- Bij het transduceren van urotheliale cellen voor Ca2+ beeldvormingsexperimenten, injecteer de blazen met 50 μL van de oplossing die 2 x 107 infectieuze virale deeltjes (IVP) bevat.
OPMERKING: Deze techniek heeft de neiging om de expressie van CGaMP5G te beperken tot de paraplucellaag. Als alternatief kunnen experimenten worden uitgevoerd met urineblazen die zijn geoogst van transgene muizen die CGaMP5G tot expressie brengen in urotheliale cellen (d.w.z. GCaMP5G-expressie aangedreven door een uroplakin-2-promotor) of een ander celtype van belang.
- Bij het transduceren van urotheliale cellen voor Ca2+ beeldvormingsexperimenten, injecteer de blazen met 50 μL van de oplossing die 2 x 107 infectieuze virale deeltjes (IVP) bevat.
- 24-72 h na transductie, euthanaseer de muizen door CO 2-verstikking en voer een thoracotomie uit door de borstholte met een schaar te openen om de longen te laten instorten.
- Canuleer de urethra met een katheter van 24 G. Stel de blaas bloot door een abdominale incisie van ~ 1,5 cm door de huid en spieren en gebruik een 6,0-hechting (zie materiaaltabel) om de katheter aan de urethra te bevestigen.
- Oogst de blaas en urethra32 en breng deze aan op een siliconenrubberen houderkussen (zie materiaaltabel) badend in een opnameoplossing met (in mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 glucose, 10 HEPES, pH 7,4 en opgeborreld met 100% O2 (figuur 2A).
- Scheid het blaasslijmvlies van de onderliggende spierlaag met een fijne tang naar aanleiding van eerder gepubliceerde rapporten32 (figuur 2B).
- Snijd het blaasslijmvlies open en speld het vast met het urotheel naar boven gericht naar een siliconenelastomeer inzetstuk in de bodem van een weefselgekweekte schaal met een diameter van 35 mm (figuur 2C).
3. Mechanische stimulatie van individuele urotheliale cellen en Ca2+ beeldvorming
- Monteer de weefselgekweekte schaal met het vastgepinde blaasslijmvlies in het microscoopstadium uitgerust met een kweekschaalincubator met resistieve verwarmingselementen (figuur 2E). Perfuseer (volgens de instructies van de fabrikant, zie materiaaltabel) de celkweekschaal continu met een snelheid van 1,7 ml/min met opnameoplossing verwarmd tot ~37 °C met een in-line verwarming.
- Houd de temperatuur van de incubator en oplossingen van de weefselschotel op ~ 37 °C met een tweekanaals bipolair temperatuurregelaarmodel (zie materiaaltabel). Breng het weefsel in de kamer in evenwicht met continue perfusie gedurende ten minste 15 minuten voordat verdere experimentele procedures worden uitgevoerd.
- Om mechanisch geïnduceerde Ca2+ transiënten te registreren, dompelt u de micropipette onder in de oplossing die het vastgepinde blaasslijmvlies in de weefselschaal baadt. Verplaats de micropipette naar het midden van het veld met behulp van een scanobjectief met lage vergroting (4x) met behulp van heldere veldverlichting.
- Beweeg de micropipet in de buurt van het oppervlak van het urotheelweefsel door de micromanipulator coördinerend in het verticale vlak te bewegen en de focus aan te passen.
- Schakel het objectief om naar een objectief met een hogere vergroting (20x) dat geschikt is voor immunofluorescentie met een hoog numeriek diafragma (NA).
- Stel de micromanipulator in op Fijn en verplaats de micropipet in de buurt van de bovenkant van de doelcel.
- Wijzig het gezichtsveld in camera en druk op Live in de beeldbewerkingssoftware.
OPMERKING: Hiermee moet de gereflecteerde sluiter worden ingeschakeld en moet het fluorescerende signaal dat wordt uitgezonden door het weefsel in de computer kunnen worden waargenomen. - Pas de focus aan om de bovenkant van de cel te visualiseren en pas indien nodig de positie van de pipet aan.
- Open het stimulatieprotocol in de elektrofysiologische software en stel het in om af te spelen.
OPMERKING: Het protocol in de elektrofysiologische software start pas als het TTL-signaal dat door de beeldvormingssoftware wordt verzonden, is ontvangen. - Druk vanuit Experiment Manager in de beeldbewerkingssoftware op Start om gegevensverzameling te starten. Dit activeert het protocol in de elektrofysiologische software, die de piëzo-elektrische actuator aanstuurt en een bestand genereert met de afbeeldingen van het experiment. Het stimulatieprotocol kan worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker.
4. Data-analyse
- Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd door de onderstaande stappen te volgen.
- Open het afbeeldingsbestand in de beeldbewerkingssoftware en selecteer het venster Tellen en meten . Selecteer het gereedschap veelhoek en teken een ROI op de grenzen van de cel die is geprikt.
- Ga naar het venster Meting, selecteer Intensiteitsprofiel, stel de meting in op Over tijd, Resultaten op Gemiddeld, Achtergrondaftrek op geen en druk vervolgens op Uitvoeren. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit wordt in de loop van de tijd berekend (figuur 3).
- Als u de intensiteitsprofielgegevens wilt exporteren, klikt u op het Excel-pictogram in het venster Resultaten intensiteitsprofiel. Hiermee kan de gebruiker de doelmap en bestandsnaam kiezen en de gegevens opslaan in een .xlsx-indeling.
- Voer data-analyse uit met behulp van wetenschappelijke grafische en data-analysesoftware (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De amplitude van de Ca2+ piek die wordt opgeroepen door prikken wordt uitgedrukt als de verandering in fluorescentie-intensiteit (ΔF / F), waarbij F de fluorescentie-intensiteit van GCaMP5G op tijdstip 0 is en ΔF het verschil tussen de fluorescentie-intensiteitsmaxima en de basale op tijdstip 0. Het verval van de Ca2+ respons kan ook worden berekend (niet weergegeven).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het huidige protocol beschrijft een techniek om mechanisch opgewekte Ca 2+ transiënten in paraplucellen te beoordelen met behulp van de fluorescerende Ca2+ sensor GCaMP5G. Adenovirale transductie werd gebruikt om GCaMP5G tot expressie te brengen in urotheliale cellen vanwege de hoge efficiëntie en omdat het een verhoogd expressieniveau produceert. Fluorescerende beelden van gekleurde cryosecties van een getransduceerde blaas zijn weergegeven in figuur 2D. Voor deze experimenten is de GCaMP5G-expressie het hoogst in de paraplucellaag. Een reeks representatieve beelden die zijn vastgelegd tijdens een experiment waarbij een paraplucel werd geprikt, wordt weergegeven in figuur 3A. De eerste afbeelding in figuur 3A toont een fluorescerend beeld van de stimulerende pipet op de bovenkant van een paraplucel van een blaasslijmvlies dat GCaMP5G tot expressie brengt. Mechanische stimulatie van de paraplucel die GCaMP5G tot expressie brengt, veroorzaakt een vervorming (zie afbeelding figuur 3A bij 12,5 s), gevolgd door een snelle toename van de fluorescentie-emissie (zie afbeelding figuur 3A bij 13,5 s). De verandering in fluorescentie werd uitgezet als functie van de tijd (figuur 3B). Zoals eerder gemeld31, roept porren een Ca2 + -respons op in de meeste paraplucellen die zijn getest in blazen van controle- en wildtype muizen die zijn getransduceerd met GCaMP5G. Het verwijderen van Piezo1 en Piezo2 uit paraplucellen verminderde de piekamplitude van de Ca2+ respons31. Bij het vergelijken van het effect van verschillende behandelingen of genetische achtergronden op mechanisch opgewekte Ca2+ responsen, is het essentieel om de experimentele omstandigheden te standaardiseren, waaronder transductie van de blaas, montage van het weefsel, grootte van de punt van de pipet die wordt gebruikt voor inkeping, mechanische stimulusduur en amplitude, en beeldvormingscondities.
Figuur 1: Experimentele opstelling om mechano-geactiveerde Ca2+ transiënten in urotheliale cellen te registreren. De rig bestaat uit een rechtopstaande microscoop, tl-lichtbron, excitatie- en emissiefilters en een CMOS-camera. De beeldvormingssoftware bestuurt het systeem. Een piëzo-elektrische actuator die wordt bestuurd door een piëzocontroller met één kanaal met open lus wordt gebruikt om de porkende micropipette te verplaatsen. Glazen micropipetten worden gemonteerd in een pipethouder die op de piëzo-elektrische actuator is bevestigd. De piëzo-elektrische actuator en bijbehorende micropipette zijn gemonteerd op een micromanipulator (niet afgebeeld). De piëzo open-loop controller wordt op afstand bediend door een analoog/digitale converter en elektrofysiologische software. Een opnameprotocol in de beeldvormingssoftware levert een TTL-signaal via een digitaal I/O-apparaat en initieert het stimulatieprotocol in de elektrofysiologische software die de piëzo-elektrische en vervolgens beeldopname regelt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie en montage van het blaasslijmvlies voor Ca2+ beeldvorming. (A) Mucosale plaatvoorbereiding met een aangehechte katheter. Het blaasslijmvlies werd met een fijne tang van de onderliggende spierlaag gestript. (B) Vergrote afbeelding van het gestripte blaasslijmvlies weergegeven in paneel (A). (C) Het slijmvlies werd vastgepind met het urotheel naar boven gericht met 0,15 mm insectenpennen op een siliconen elastomeer inzetstuk. (D) Confocale immunofluorescentiedoorsnedebeelden van het slijmvliesplaatpreparaat gekleurd met een antilichaam tegen GFP en een secundair ezelantikonijn geconjugeerd antilichaam (groen), rhodamine-falloidine (rood) en DAPI (blauw). Het blaasslijmvliespreparaat omvat een deel van de lamina propria (LP). Pijlen geven de locatie van de paraplucellaag (Ub) aan. Schaalbalken = 50 μm. (E) Foto van de experimentele opstelling. a, lijnverwarming; b, piëzo-elektrische actuator; c, verwarmingselementen en regelaar; d, pipethouder en micropipet; e, mucosale plaat bevestigd aan de siliconen insert in een weefselgekweekte schaal en schotelincubator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Registratie en analyse van mechano-geactiveerde Ca2+ transiënten in urotheliale cellen. (A) Opeenvolging van fluorescerende beelden die op verschillende tijdstippen in de loop van een experiment zijn vastgelegd. Merk op dat mechanische stimulatie van de paraplucel een vervorming veroorzaakt, gevolgd door een snelle toename van de emissie van GCaMP5G (pijl). De randen van de gestimuleerde cel (ROI) zijn rood gemarkeerd. (B) Verandering in fluorescentie-intensiteit (ΔF/F) in de loop van de tijd voor acht onafhankelijke mechanisch gestimuleerde cellen in een blaasslijmvliespreparaat van een controlemuis. De tijd van inspringing (12,5 s) wordt aangegeven met een blauwe pijl. De gegevens in (B) zijn gewijzigd ten opzichte van Dalghi et al.31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle organismen, en schijnbaar de meeste celtypen, drukken ionkanalen uit die reageren op mechanische stimuli 20,33,34,35,36,37. De functie van deze mechanisch geactiveerde kanalen is voornamelijk beoordeeld met de patch-clamp techniek. Vanwege toegankelijkheidsproblemen zijn patchklemstudies van mechanisch geactiveerde ionkanalen echter grotendeels beperkt gebleven tot gedissocieerde cellen en cellijnen. Omdat veel mechanisch geactiveerde ionkanalen doorlaatbaar zijn voor Ca2+, hebben we gebruik gemaakt van recente ontwikkelingen in microscopie, biosensing en micromanipulatie om een beeldvormingsmethode te ontwikkelen om de functie van mechanisch geactiveerde kanalen in een ex vivo urotheliaal preparaat te beoordelen. In dit protocol worden urotheliale cellen getransduceerd met een adenovirus dat codeert voor GCaMP5G. Adenovirale vectoren zijn bij uitstek geschikt voor het bestuderen van Ca 2+ signalering in het urotheel omdat ze een hoge transductiesnelheid en hoge expressieniveaus van GCaMP5G in urotheliale cellen bieden (figuur 2D). Onder deze omstandigheden is de achtergrondfluorescentie relatief laag. Als adenovirale transductie wordt gebruikt om een genetisch gecodeerde Ca2 + -sensor tot expressie te brengen, moet speciale nadruk worden gelegd op het optimaliseren van de omstandigheden, zodat alleen de cellen van belang de sensor uitdrukken. Als alternatief kan expressie van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECIs) worden bereikt door muizen te kruisen met een floxed transgen dat codeert voor het eiwit van belang (bijv. GCaMP5G) en muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen onder controle van een geschikte promotor. Deze aanpak vereist geen chirurgische procedures en heeft het voordeel dat het gerichte expressie en zelfs niveaus van expressie van eiwitten in cellen die Cre-recombinase tot expressie brengen, biedt.
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een rechtopstaande breedveldmicroscoop om mechanisch geactiveerde Ca2+ transiënten in paraplucellen te beoordelen, gestimuleerd met een gesloten vuurgepolijste micropipette. De methode kan worden aangepast om mechanotransductie in diepere lagen van het urotheel of zelfs cellen in de lamina propria te bestuderen met een rechtopstaande confocale of tweefotonenmicroscoop. Het gebruik van een confocale microscoop kan de nodige resolutie bieden om subcellulaire veranderingen in intracellulair Ca2 + te definiëren die optreden als reactie op mechanische stimulatie. Dit protocol maakt gebruik van een gesloten, vuurgepolijste micropipette om individuele paraplucellen te prikken. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een micropipette voor stimulatie is dat de mechanische verstoring die op het weefsel wordt uitgeoefend van voorbijgaande aard is en beperkt is tot de cel van belang en het omliggende gebied. Terwijl celreksystemen kunnen worden gebruikt om cellen die op PDMS-membranen worden gekweekt mechanisch te stimuleren, belemmeren inherente beperkingen het gebruik van dergelijke apparaten voor beeldvormingsexperimenten met ex vivo preparaten. Deze beperkingen omvatten uitdagingen bij het monteren en in beeld brengen van een muizenblaas en, gezien de gevouwen aard van het blaasslijmvlies, problemen bij het behouden van de focus op de cellen van belang tijdens het uitrekken van het weefsel.
Het protocol voor het meten van mechanisch geactiveerde Ca2+ transiënten in urotheliale preparaten heeft enkele beperkingen. Ten eerste bevat de rig relatief dure componenten en de assemblage en installatie vereisen expertise met microscopen, micromanipulatoren, analoog-digitale converters en relatief gespecialiseerde software. Net als patch-clamping vereist deze techniek dat de onderzoeker leert hoe hij een micromanipulator moet gebruiken en glazen micropipetten moet maken voor mechanische stimulatie. In tegenstelling tot de patch-clamp-techniek, waarbij een hoge weerstandsafdichting tussen de pipet en het membraan wordt gevormd, is de hier beschreven procedure voor het meten van mechanisch geactiveerde Ca2+ transiënten relatief eenvoudig en vereist de onderzoeker alleen dat hij de stimulerende pipet dicht bij het oppervlak van de te stimuleren cel plaatst. Daarom kan een getrainde onderzoeker mogelijk de reactie op het prikken van 8-10 cellen in 1 uur beoordelen, wat ondenkbaar is met patch-clamp-techniek.
Gezien het belang dat mechanisch geactiveerde ionkanalen hebben in de normale lichaamsfunctie en ziektetoestanden, zijn nieuwe methoden nodig om deze kanalen in hun oorspronkelijke omgeving te bestuderen. Zoals beschreven in dit protocol, kunnen beeldvormingsmethoden uniek inzicht bieden in hoe deze kanalen veranderingen in hun omgeving waarnemen en fysiologische reacties genereren. Gezien de toegankelijkheid van het slijmvliesoppervlak van de buis- of zakvormige organen, kan de hier beschreven methode worden aangepast om mechanotransductie in andere omgevingen te bestuderen, waaronder de darm, urogenitale tractus, bloedvaten, enz. Het bestuderen van mechanische reacties in het lichaam kan dus in grote lijnen nuttig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01DK119183 (aan G.A. en M.D.C.) en S10OD028596 (aan G.A.) en door de Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores van het Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A.
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al.
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J.
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
