Summary
Bu protokol, floresan Ca2+ sensörü GCaMP5G kullanılarak doğal ürotelyal hücrelerde mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevini değerlendirmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır.
Abstract
Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, gerilme veya kesme kuvvetleri gibi mekanik uyaranları elektriksel ve biyokimyasal sinyallere dönüştüren biyolojik dönüştürücülerdir. Memelilerde, mekanik olarak aktive edilmiş kanallar, dokunma hissi, işitme, kırmızı kan hücresi hacminin düzenlenmesi, bazal kan basıncı regülasyonu ve idrar kesesi dolgunluğu hissi gibi çeşitli süreçlerde dış ve iç uyaranların tespiti için gereklidir. Mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevi, yama-kelepçe tekniği kullanılarak in vitro ortamda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, doğal ortamlarındaki işlevlerini değerlendirmek, genellikle bu kanalların ekspresyon bölgelerine (örneğin, afferent terminaller, Merkel hücreleri, baroreseptörler ve böbrek tübülleri) sınırlı erişim veya yama kelepçesi tekniğinin uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle zor bir görev olmaya devam etmektedir. ürotelyal şemsiye hücrelerinin apikal yüzeyleri). Bu protokol, ex vivo ürotelyal preparatta floresan sensör GCaMP5G kullanılarak mekanik olarak uyarlanan Ca 2 + geçicileri değerlendirmek için bir prosedürü açıklamaktadır; bu, diğer doğal doku preparatlarında mekanik olarak uyarlanmış Ca2 + olaylarının incelenmesi için kolayca uyarlanabilecek bir tekniktir.
Introduction
İdrar yollarındaki epitel hücreleri, idrar filtrasyonu nefronlardan geçerken mekanik kuvvetlere maruz kalır ve idrar renal pelvisten dışarı pompalanır ve idrar kesesinde depolanacak üreterlerden geçer. İdrar yolunu kaplayan epitel hücreleri üzerindeki sıvılar tarafından uygulanan mekanik kuvvetlerin (örneğin, kesme stresi ve gerilmesi), proksimal tübüldeki proteinin ve distal nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11'deki çözünenlerin yeniden emilimini düzenlediği uzun zamandır bilinmektedir. 12,13, idrarın idrar kesesinde depolanması ve miksiyon14,15,16,17.
Mekanik uyaranların mekanik ve biyokimyasal sinyallere dönüştürülmesine, mekanotransdüksiyon olarak adlandırılan bir süreç, hücresel yapıların deformasyonuna veya ilişkili hücre dışı matrise yanıt veren proteinler aracılık eder 18,19,20,21. Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, membran gerilimi, basıncı veya kayma gerilmesindeki değişikliklere yanıt olarak kapalı bir durumdan açık geçirgen bir duruma geçmeleri anlamında benzersizdir 18,19,20,21,22. Ek olarak, Ca 2+ geçicileri integrin aracılı mekanotransdüksiyon veya hücre-hücre kavşaklarında mekanoduyarlı yapışma sistemlerinin aktivasyonu ile başlatılabilir23,24,25,26. İyon kanalı fonksiyonu genellikle hücre zarı ile yama pipeti27 arasında bir gigaohm conta oluşumunu içeren yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilir. Bununla birlikte, yoğun bir hücre dışı matrise (örneğin, böbrek tübülleri) sahip derin doku katmanlarında bulunan veya fiziksel bir bariyerle (örneğin, glikokaliks) çevrili hücrelere cam mikropipet ile erişmek zordur. Benzer şekilde, gömülü veya zayıf mekanik stabiliteye sahip dokuların ayrılmaz parçaları olan hücreler (örneğin, ürotelyum) yama-kelepçe tekniği ile kolayca çalışılamaz. Mekanik olarak aktive edilmiş birçok iyon kanalı Ca 2 + 'ya geçirgen olduğundan, alternatif bir yaklaşım, Ca2 + 'ya duyarlı bir boya veya GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) kullanarak floresan mikroskopi ile aktivitelerini değerlendirmektir. Protein mühendisliğindeki son çabalar, GECI'lerin28,29,30'unun dinamik aralığını, duyarlılığını ve tepkisini önemli ölçüde artırdı ve genetikteki ilerlemeler, belirli hücre popülasyonlarında ekspresyonlarına izin vererek onları mekanotransdüksiyonu incelemek için ideal hale getirdi.
İdrar kesesinin içini kaplayan tabakalı epitel olan ürotelyum, idrar solutlarının mesane interstisyumuna difüzyonunu önleyen bir bariyer olarak işlev görür, aynı zamanda bir dönüştürücü olarak işlev görür, mesane dolgunluğunu algılar ve bu olayları altta yatan sinirlere ve kas sistemineiletir16. Önceki çalışmalar, ürotelyum ve altta yatan dokular arasındaki iletişimin mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanalları Piezo1 ve Piezo231'i gerektirdiğini göstermiştir. Ürotelyal hücrelerde mekanik olarak indüklenen Ca 2+ geçicileri değerlendirmek için, ürotelyal hücrelerde Ca2+ sensörü GCaMP5G'yi eksprese etmek için adenoviral gen transferini kullanan yeni bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, en dıştaki şemsiye hücre tabakasına kolay erişim sağlayan bir mukozal tabaka preparatı ve kapalı bir cam mikropipet ile bireysel hücrelerin eşzamanlı mekanik uyarımı ve zaman içinde floresandaki değişikliklerin kaydedilmesi için bilgisayar destekli bir sistem kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanların bakımı ve bakımı, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada dişi, 2-4 aylık C57Bl/6J fareler kullanıldı. Fareler ticari olarak elde edildi (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Ekipman montajı ve kurulumu
- Yüksek çözünürlüklü bir kamera ve sabit bir ışık kaynağı ile donatılmış dik bir mikroskopla Ca2+ görüntüleme gerçekleştirin (bkz.
- Görüntüleri, bir USB dijital I/O cihazı aracılığıyla kameranın, ışık kaynağının ve piezo aktüatörünün doğrudan kontrolüne izin veren mikroskop uyumlu bir yazılımla elde edin (bkz.
NOT: Şekil 1 , kurulumun bir şemasını temsil eder. GCaMP5G, 470 nm pik uyarma dalga boyuna ve 497 nm28 pik emisyon dalga boyuna sahiptir. GCaMP5G görüntüleme için uygun bir filtre küpü kullanın.
- Görüntüleri, bir USB dijital I/O cihazı aracılığıyla kameranın, ışık kaynağının ve piezo aktüatörünün doğrudan kontrolüne izin veren mikroskop uyumlu bir yazılımla elde edin (bkz.
- Mesane mukozası preparasyonunda bireysel ürotelyal hücrelerin uyarılması için ( bkz. adım 2), tek kanallı açık döngülü piezo kontrolörü tarafından kontrol edilen bir piezoelektrik aktüatör kullanın (bkz. Piezoelektrik aktüatörü bir mikromanipülatöre monte edin.
- Cam mikropipetleri piezoelektrik aktüatöre yapıştırılmış bir pipet tutucuya monte edin (Şekil 1). Piezo kontrolörünü, bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz programı tarafından kontrol edilen bir analog / dijital dönüştürücü ile uzaktan çalıştırın (bkz.
NOT: Piezoelektrik aktüatörü hareket ettiren elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımında stimülasyon protokolünü tetiklemek için görüntüleme yazılımı tarafından başlatılan bir transistör-transistör mantığı (TTL) sinyali şeklinde harici bir tetikleyici kullanılır (Şekil 1).
- Cam mikropipetleri piezoelektrik aktüatöre yapıştırılmış bir pipet tutucuya monte edin (Şekil 1). Piezo kontrolörünü, bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz programı tarafından kontrol edilen bir analog / dijital dönüştürücü ile uzaktan çalıştırın (bkz.
- Görüntüleme yazılımının (bkz. Malzeme Tablosu) dijital G/Ç cihazıyla arayüz oluşturduğundan emin olun. TTL sinyalini analog/dijital dönüştürücüye iletmek için USB dijital G/Ç cihazında bir dijital çıkış kanalı yapılandırın, bu da piezoelektrik aktüatörü hareket ettiren elektrofizyoloji yazılımındaki protokolü başlatacaktır.
- Analog/dijital dönüştürücüdeki Start BNC bağlantı noktasını toprağa (GND) ve USB dijital G/Ç aygıtındaki vidalı terminali bağlamak için bir kablo kullanın.
- Görüntüleme yazılımında kayıt protokolünü ayarlayın.
NOT: Aşağıdaki adımlarda, TTL sinyali gönderecek ve belirtilen zaman aralıklarında görüntü toplamaya başlayacak bir protokolün nasıl oluşturulacağı açıklanmaktadır.- Deneme Yöneticisi'ne tıklayıp Yeni Deneme'yi seçerek görüntüleme yazılımında edinme protokolünü ayarlayın. Yeni bir pencere açılacaktır.
- Hızlandırılmış Döngü simgesini seçin ve yeni açılan pencereye sürükleyin; döngü sayısını 2'ye, aralığı ise kurulumda izin verilen en hızlı ayara ayarlayın.
- İletilen Deklanşör/Manuel Deklanşör simgesinden NI USB-6501 simgesini seçin ve Hızlandırılmış Döngü penceresine sürükleyin ve ardından NI USB-6501'i kapalı olarak ayarlayın. İletilen Deklanşör/Manuel Deklanşör'den Zaman Atlamalı Döngü penceresine ek bir NI USB-6501 sürükleyin ve açık olarak ayarlayın. İki NI USB-6501 simgesini bağlamak için NI USB-6501 kapalı simgesinin yanındaki ok ucunu sürükleyin ve NI USB-6501 açık simgesine dokunana kadar çekin. Her iki simgeyi birbirine bağlayan bir çizgi görünecektir.
- Başka bir Zaman Atlamalı Döngüyü Deneme Yöneticisi penceresine sürükleyin ve ok ucunu çekerek ilkine bağlayın. Kayıt parametrelerini ayarlayın. Yeni Hızlandırılmış Döngünün döngü sayısını 2400 olarak ayarlayın.
- Görüntü Alma simgesinden, GFP filtresini yakın zamanda açılan Hızlandırılmış Döngüye sürükleyin ve pozlama süresini 100 ms'ye ayarlayın.
- Kamera görüntü türünü 8 bit, çözünürlüğü 576 x 576 (Bölme 4 x 4), piksel saatini 480 MHz ve Sıcak piksel düzeltmesini standart olarak ayarlayın.
NOT: Parametreler, floresan sensörün ifade seviyesine, kamera hassasiyetine ve kurulum yapılandırmasına bağlı olarak ayarlanabilir.
- Elektrofizyoloji yazılımında Laboratuvar Tezgahını kurun (bkz.
NOT: Bu, çıkış sinyalini analog/dijital dönüştürücünün mV cinsinden tanımlayacaktır.- Elektrofizyoloji yazılımında Yapılandır menüsüne gidin ve Lab Bench'i seçin. Ortaya çıkan Çıkış Sinyalleri penceresinde, Analog Çıkış #1'i seçin, Sinyal ekle'ye basın ve adlandırın (örneğin, "Piezo"). Sinyal Birimi'ni mV'ye, Ölçek Faktörü'nü (mV/V) ise 1 olarak ayarlayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek elektrofizyoloji yazılımında bir stimülasyon protokolü oluşturun.
- Elektrofizyoloji yazılımında yeni bir stimülasyon protokolü oluşturmak için, Al menü öğesine gidin ve Yeni Protokol'ü seçin.
- Mod/Hız'ı epizodik stimülasyon, Çalıştır/Deneme ayarını 1, Süpür/Çalıştır'ı 1'e ve Süpürme Süresi'ni (süre)sini 150'ye ayarlayın.
- Çıkışlar menüsünde, Kanal #1 Piezo'yu Analog çıkış olarak seçin.
- Tetikleyici menüsünde, tetikleyiciyi Sayısallaştırıcı Başlangıç Girişi ve Dahili Zamanlayıcı olarak ayarlayın.
- Dalga Formu menüsünde, kanal #1 ve Analog Dalga Formu ile Epochs'u seçin. Adım A'yı Adım, Birinci Düzey 0, Delta düzeyi 0, İlk süre 10000 ve Delta süresini 0 olarak ayarlayın.
- Adım B'yi Adım, İlk düzey 10, Delta Düzeyi'ni 0, İlk Süre'yi 1000 ve Delta Süresi'ni 0 olarak ayarlayın. Adım C'yi Adım, İlk Düzey 0, Delta Düzeyi 0, İlk Süre 130000 ve Delta Süresi'ni 0 olarak ayarlayın.
- Protokolü kaydedin ve Stimülasyon protokolü olarak adlandırın.
- Analog/dijital dönüştürücüdeki Analog Çıkış #1'i, tek kanallı açık döngülü piezo denetleyicisinin önündeki EXT GİRİŞ'e bağlamak için bir BNC kablosu kullanın (bkz.
- Aşağıdaki adımları izleyerek kılcal cam borulardan şemsiye hücrelerinin mekanik olarak uyarılması için cam mikropipetler üretin.
- Kılcal camı bir çektirmeye yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve kılcal tutucu düğmelerle ayarlayın.
- Isıtıcı ünitesini tam yüksekliğinde konumlandırın. Çektirmenin ilk çekme sonlandırma konumu kaydırıcısını 5'e ayarlayın.
- İlk ısıtıcı düğmesini 76,7'ye ve ikinci düğmeyi 52,7'ye ayarlayın.
- Başlat düğmesine basarak cam kılcal damarı iki adımda çekin.
- Mikropipetin ucunu bir mikroforge ile kapatın (bkz. Malzeme Tablosu) ısıtıcı ayar düğmesi 60 olarak ayarlanmışken.
NOT: Mevcut protokol için, tek tek hücreleri dürtmek için kullanılan mikropipet ucunun son çapı ~ 1-3 μm'dir.
- Uyarıcı mikropipetin, stimülasyon protokolünde belirtilen mesafeyi hareket ettirdiğini doğrulayın.
NOT: Aşağıdaki adımlar, elektrofizyoloji yazılımında stimülasyon protokolünü başlattıktan sonra 12,5 s'nin, piezoelektrik aktüatörün 20 μm hareket etmesini sağlayarak 1 s süreli bir voltaj darbesinin üretilmesini sağlamaktır.- Tutucuya bir mikropipet takın ve piezoelektrik aktüatöre takın.
- Piezoelektrik aktüatörü ve bağlı mikropipeti mikroskop aşamasının merkezine paralel olarak ve görüş alanına yerleştirin.
- Pipetin ucuna odaklanın ve piezoelektrik montaj çubuğunu (bkz. Malzeme Tablosu) bantla hareketsiz hale getirin. Parlak alan aydınlatması altında, pipet ucunun net bir görüntüsünü elde etmek için kamera parametrelerini ayarlayın.
- Elektrofizyoloji yazılımındaki Stimülasyon protokolünü açın ve oynatacak şekilde ayarlayın.
NOT: Elektrofizyoloji protokolü, görüntüleme yazılımından gönderilen TTL sinyali alınana kadar başlamaz. - Veri toplamayı başlatmak için görüntüleme yazılımındaki Deneme Yöneticisi'nden Başlat'a basın.
NOT: Bu, piezoelektrik aktüatörü çalıştıracak olan elektrofizyoloji yazılımındaki protokolü tetikleyecektir. Görüntüleme yazılımındaki protokol, deneyin görüntülerini içeren bir dosya oluşturacaktır.
- Aşağıdaki adımları izleyerek pipetin kat ettiği mesafeyi doğrulayın.
- Stimülasyon protokolü sırasında pipetin kat ettiği mesafeyi ölçmek için, görüntüleme yazılımında Say ve Ölçün öğesini seçin.
- Hesaplama menüsünden, Ölçüm ve YG seçeneğini belirlediğinizde, film penceresinin altında yeni bir pencere açılır.
- Ölçü menüsünden, Rasgele Çizgi'yi seçin.
- Film penceresinde, pipetin ucundan başlayarak rastgele bir çizgi çizin. Rasgele satırın sonunun daha sonra ayarlanacağını unutmayın.
- Çizgiyi tüm film karelerinde görülebilecek bir ilgi alanına (ROI) dönüştürmek için rastgele çizgiye sağ tıklayın.
- Filmi inceleyin ve rastgele çizginin (ROI) ucunu, uyarana yanıt olarak pipet tarafından kat edilen son konuma ayarlayın.
NOT: Pipetin μm cinsinden kat ettiği mesafe Ölçüm ve YG penceresinde görünür. Stimülasyon protokolü kullanıcı ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.
2. Mesane mukozasının in situ transdüksiyonu ve izolasyonu
- Dişi fare mesanelerini, virüs transdüksiyon protokolü31'de açıklanan prosedüre göre CGaMP5G'nin cDNA'sını kodlayan bir adenovirüs ile yerinde dönüştürün.
- Ca 2 + görüntüleme deneyleri için ürotelyal hücreleri dönüştürürken, mesaneleri2 x 107 bulaşıcı viral partikül (IVP) içeren çözeltinin 50 μL'si ile aşılayın.
NOT: Bu teknik, CGaMP5G'nin ekspresyonunu şemsiye hücre katmanına kısıtlama eğilimindedir. Alternatif olarak, ürotelyal hücrelerde CGaMP5G'yi eksprese eden transgenik farelerden toplanan idrar keseleri (yani, bir üroplakin-2 promotoru tarafından tahrik edilen GCaMP5G ekspresyonu) veya başka herhangi bir hücre tipi ile deneyler yapılabilir.
- Ca 2 + görüntüleme deneyleri için ürotelyal hücreleri dönüştürürken, mesaneleri2 x 107 bulaşıcı viral partikül (IVP) içeren çözeltinin 50 μL'si ile aşılayın.
- Transdüksiyondan 24-72 saat sonra, fareleri CO2 boğulması ile ötenazi yapın ve akciğerlerin çökmesine neden olmak için göğüs boşluğunu makasla açarak torakotomi yapın.
- Üretrayı 24 G kateter ile kanüle edin. Mesaneyi, deri ve kas boyunca ~ 1.5 cm'lik bir karın kesisi ile maruz bırakın ve kateteri üretraya sabitlemek için 6.0 dikiş kullanın (bkz.
- Mesane ve üretra 32'yi toplayın ve aşağıdakileri içeren (mM cinsinden) kayıt çözeltisinde yıkanmış bir silikon kauçuk tutucu pedine yapıştırın (bkz. Malzeme Tablosu): 135 NaCl, 5.0 KCl, 1 MgCl 2,2.5 CaCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, pH 7.4 ve% 100O2 ile kabarcıklanmış (Şekil 2A).
- Mesane mukozasını, daha önce yayınlanmış raporlar32'yi takiben ince forseps ile altta yatan kas tabakasından ayırın (Şekil 2B).
- Mesane mukozasını kesin ve ürotelyum 35 mm çapında doku kültürlü bir kabın dibinde silikon elastomer bir eke bakacak şekilde sabitleyin (Şekil 2C).
3. Bireysel ürotelyal hücrelerin mekanik olarak uyarılması ve Ca2+ görüntüleme
- Doku kültürlü çanağı, rezistif ısıtma elemanlarına sahip bir kültür çanağı inkübatörü ile donatılmış mikroskop aşamasında sabitlenmiş mesane mukozası ile monte edin (Şekil 2E). Perfüze (üreticinin talimatlarını izleyerek, Malzeme Tablosuna bakınız) hücre kültürü kabı, sıralı bir ısıtıcı ile ~ 37 ° C'de ısıtılan kayıt çözeltisi ile sürekli olarak 1,7 mL / dak hızında bulunur.
- Çift kanallı bipolar sıcaklık kontrol cihazı modeli ile doku kabı inkübatörünün ve çözeltilerinin sıcaklığını ~ 37 ° C'de tutun (bkz. Daha fazla deneysel prosedür uygulamadan önce odadaki dokuyu en az 15 dakika boyunca sürekli perfüzyonla dengeleyin.
- Mekanik olarak indüklenen Ca2+ geçicileri kaydetmek için, mikropipeti doku kabındaki sabitlenmiş mesane mukozasını yıkayarak çözeltiye batırın. Parlak alan aydınlatması kullanarak düşük büyütmeli tarama hedefi (4x) yardımıyla mikropipeti alanın merkezine taşıyın.
- Mikropipeti, mikromanipülatörü dikey düzlemde koordineli olarak hareket ettirerek ve odağı ayarlayarak ürotelyal dokunun yüzeyine yakın bir yere hareket ettirin.
- Hedefi, yüksek sayısal açıklığa (NA) sahip immünofloresan için uygun, daha yüksek büyütmeli (20x) bir hedefe geçin.
- Mikromanipülatörü İnce olarak ayarlayın ve mikropipeti hedef hücrenin üst kısmına yakın bir yere getirin.
- Görüş alanını fotoğraf makinesi olarak değiştirin ve görüntüleme yazılımında Canlı yayına basın.
NOT: Bu, yansıyan deklanşörü açmalı ve bilgisayardaki dokudan yayılan floresan sinyalin gözlemlenmesine izin vermelidir. - Hücrenin üst kısmını görselleştirmek için odağı ayarlayın ve gerekirse pipetin konumunu ayarlayın.
- Elektrofizyoloji yazılımındaki Stimülasyon protokolünü açın ve oynatacak şekilde ayarlayın.
NOT: Elektrofizyoloji yazılımındaki protokol, görüntüleme yazılımından gönderilen TTL sinyali alınana kadar başlamaz. - Veri toplamayı başlatmak için görüntüleme yazılımındaki Deneme Yöneticisi'nden Başlat'a basın. Bu, piezoelektrik aktüatörü çalıştıracak ve deneyin görüntülerini içeren bir dosya oluşturacak olan elektrofizyoloji yazılımındaki protokolü tetikleyecektir. Stimülasyon protokolü kullanıcının ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.
4. Veri analizi
- Aşağıdaki adımları izleyerek zaman içindeki floresan yoğunluğunu ölçün.
- Görüntü dosyasını görüntüleme yazılımında açın ve Say ve Ölç penceresini seçin. Poligon aracını seçin ve dürtülen hücrenin sınırlarına bir yatırım getirisi çizin.
- Hesaplama penceresine gidin, Yoğunluk Profili'ni seçin, ölçümü Zaman içinde, Sonuçlar Ortalama, Arka Plan Çıkarma Hiçbiri olarak ayarlayın ve ardından Yürüt'e basın. Ortalama floresan yoğunluğu zaman içinde hesaplanacaktır (Şekil 3).
- Yoğunluk profili verilerini dışa aktarmak için, Yoğunluk Profili Sonuçları penceresindeki Excel simgesine tıklayın. Bu, kullanıcının hedef klasörü ve dosya adını seçmesine ve verileri .xlsx biçiminde kaydetmesine olanak tanır.
- Bilimsel grafik ve veri analizi yazılımı kullanarak veri analizi yapın (bkz.
NOT: Dürtme ile uyarılan Ca2+ zirvesinin genliği, floresan yoğunluğundaki (ΔF / F) değişim olarak ifade edilir; burada F, 0 zamanında GCaMP5G'nin floresan yoğunluğudur ve ΔF, floresan yoğunluğu maksimumu ile 0 zamanındaki bazal arasındaki farktır. Ca2+ yanıtının bozunumu da hesaplanabilir (gösterilmez).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mevcut protokol, floresan Ca 2+ sensörü GCaMP5G kullanılarak şemsiye hücrelerinde mekanik olarak uyarılan Ca2+ geçicileri değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır. Adenoviral transdüksiyon, ürotelyal hücrelerde GCaMP5G'yi yüksek etkinliği ve yüksek bir ekspresyon seviyesi üretmesi nedeniyle eksprese etmek için kullanıldı. Transdüktif bir mesaneden lekeli kriyoseksiyonların floresan görüntüleri Şekil 2D'de gösterilmiştir. Bu deneyler için, GCaMP5G ekspresyonu şemsiye hücre katmanında en yüksektir. Bir şemsiye hücrenin dürtüldüğü bir deney sırasında yakalanan temsili görüntülerin bir dizisi Şekil 3A'da gösterilmiştir. Şekil 3A'daki ilk görüntü, GCaMP5G'yi ifade eden bir mesane mukozasının şemsiye hücresinin üstüne yerleştirilmiş uyarıcı pipetin floresan bir görünümünü göstermektedir. GCaMP5G'yi ifade eden şemsiye hücrenin mekanik olarak uyarılması bir deformasyona neden olur (bkz. 12.5 s'de Şekil 3A), ardından floresan emisyonunda hızlı bir artış (bkz. resim Şekil 3A, 13.5 sn). Floresandaki değişim zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir (Şekil 3B). Daha önce31'de bildirildiği gibi, dürtme, mesanelerde kontrol ve GCaMP5G ile dönüştürülen vahşi tip farelerden test edilen çoğu şemsiye hücresinde Ca2 + yanıtını uyandırır. Piezo1 ve Piezo2'nin şemsiye hücrelerden silinmesi, Ca2+ yanıtı31'in tepe genliğini azalttı. Farklı tedavilerin veya genetik arka planların mekanik olarak uyarılmış Ca2+ yanıtları üzerindeki etkisini karşılaştırırken, mesanenin transdüksiyonu, dokunun montajı, girinti için kullanılan pipetin ucunun boyutu, mekanik uyaran süresi ve genliği ve görüntüleme koşulları dahil olmak üzere deneysel koşulları standartlaştırmak önemlidir.
Şekil 1: Ürotelyal hücrelerde mekano-aktive Ca2+ geçicilerini kaydetmek için deney düzeneği. Makine dik mikroskop, floresan ışık kaynağı, uyarma ve emisyon filtreleri ve CMOS kameradan oluşur. Görüntüleme yazılımı sistemi kontrol eder. Dürtme mikropipetini hareket ettirmek için tek kanallı açık döngülü piezo kontrolörü tarafından kontrol edilen bir piezoelektrik aktüatör kullanılır. Cam mikropipetler, piezoelektrik aktüatöre yapıştırılmış bir pipet tutucuya monte edilir. Piezoelektrik aktüatör ve ilgili mikropipet bir mikromanipülatöre monte edilmiştir (gösterilmemiştir). Piezo açık döngü kontrolörü, bir analog / dijital dönüştürücü ve elektrofizyoloji yazılımı tarafından uzaktan çalıştırılır. Görüntüleme yazılımındaki bir kayıt protokolü, dijital bir I / O cihazı aracılığıyla bir TTL sinyali gönderir ve bu, piezoelektrik ve daha sonra görüntü yakalamayı kontrol eden elektrofizyoloji yazılımındaki stimülasyon protokolünü başlatır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ca2+ görüntüleme için mesane mukozasının izolasyonu ve montajı. (A) Bağlı bir kateter ile mukozal tabaka hazırlama. Mesane mukozası altta yatan kas tabakasından ince forseps ile sıyrıldı. (B) Panel (A)'da gösterilen soyulmuş mesane mukozasının büyütülmüş görüntüsü. (C) Mukoza, ürotelyum 0.15 mm'lik böcek pimleri ile silikon elastomer bir eke bakacak şekilde sabitlendi. (D) GFP'ye karşı bir antikor ve ikincil bir eşek anti-tavşan konjuge antikoru (yeşil), rodamin-faloidin (kırmızı) ve DAPI (mavi) ile boyanmış mukozal tabaka preparatının konfokal immünofloresan kesit görüntüleri. Mesane mukozal preparatı, lamina propria'nın (LP) bir kısmını içerir. Oklar, şemsiye hücre katmanının (Ub) yerini gösterir. Ölçek çubukları = 50 μm. (E) Deney düzeneğinin fotoğrafı. a, sıralı ısıtıcı; b, piezoelektrik aktüatör; c, ısıtıcı elemanları ve kontrolör; d, pipet tutucu ve mikropipet; e, doku kültürlü bir çanak ve çanak inkübatöründe silikon eke tutturulmuş mukozal tabaka. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Ürotelyal hücrelerde mekano-aktive Ca2+ geçicilerinin kaydedilmesi ve analizi. (A) Bir deney sırasında farklı zaman noktalarında yakalanan floresan görüntülerin sırası. Şemsiye hücrenin mekanik olarak uyarılmasının bir deformasyona neden olduğunu ve ardından GCaMP5G (ok) emisyonunda hızlı bir artışa neden olduğunu unutmayın. Uyarılmış hücrenin (ROI) sınırları kırmızı renkle işaretlenmiştir. (B) Bir kontrol faresinden mesane mukozal preparatında mekanik olarak uyarılmış sekiz bağımsız hücre için floresan yoğunluğunda (ΔF / F) zamanla değişim. Girinti zamanı (12,5 sn) mavi bir okla işaretlenmiştir. (B)'deki veriler Dalghi ve ark.31'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm organizmalar ve görünüşte çoğu hücre tipi, mekanik uyaranlara cevap veren iyon kanallarını eksprese eder 20,33,34,35,36,37. Mekanik olarak aktive edilen bu kanalların işlevi ağırlıklı olarak yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, erişilebilirlik sorunları nedeniyle, mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının yama-kelepçe çalışmaları büyük ölçüde ayrışmış hücreler ve hücre hatları ile sınırlandırılmıştır. Mekanik olarak aktive edilmiş birçok iyon kanalı Ca2 + 'ya geçirgen olduğundan, ex vivo ürotelyal preparatta mekanik olarak aktive edilmiş kanalların işlevini değerlendirmek için bir görüntüleme yöntemi geliştirmek üzere mikroskopi, biyosensing ve mikromanipülasyondaki son gelişmelerden yararlandık. Bu protokolde, ürotelyal hücreler GCaMP5G için kodlanan bir adenovirüs ile dönüştürülür. Adenoviral vektörler, ürotelyal hücrelerde yüksek bir transdüksiyon oranı ve yüksek düzeyde GCaMP5G ekspresyonu sağladıkları için ürotelyumdaki Ca 2+ sinyalini incelemek için idealdir (Şekil 2D). Bu koşullar altında, arka plan floresansı nispeten düşüktür. Adenoviral transdüksiyon, genetik olarak kodlanmış bir Ca2+ sensörünü ifade etmek için kullanılıyorsa, koşulları optimize etmeye özel önem verilmelidir, böylece yalnızca ilgili hücreler sensörü ifade eder. Alternatif olarak, genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergelerinin (GECI'ler) ekspresyonu, ilgilenilen protein (örneğin, GCaMP5G) için kodlanmış bir transgen taşıyan fareleri ve Cre rekombinazı eksprese eden fareleri uygun bir promotorun kontrolü altında geçerek elde edilebilir. Bu yaklaşım cerrahi prosedürler gerektirmez ve Cre rekombinaz eksprese eden hücrelerde proteinlerin hedeflenen ekspresyonunu ve hatta ekspresyon seviyelerini sağlama avantajına sahiptir.
Burada açıklanan protokol, kapalı bir ateşle parlatılmış mikropipet ile uyarılan şemsiye hücrelerinde mekanik olarak aktive edilmiş Ca2 + geçicilerini değerlendirmek için dik bir geniş alan mikroskobu kullanır. Yöntem, ürotelyumun daha derin katmanlarında veya hatta lamina propriadaki hücrelerde mekanotransdüksiyonu dik bir konfokal veya iki foton mikroskobu ile incelemek için uyarlanabilir. Konfokal mikroskop kullanmak, mekanik stimülasyona yanıt olarak ortaya çıkan hücre içi Ca2 + 'daki hücre altı değişiklikleri tanımlamak için gerekli çözünürlüğü sağlayabilir. Bu protokol, tek tek şemsiye hücrelerini dürtmek için kapalı bir ateş cilalı mikropipet kullanır. Stimülasyon için bir mikropipet kullanmanın temel avantajı, dokuya uygulanan mekanik pertürbasyonun geçici olması ve ilgilenilen hücre ve çevresindeki alanla sınırlı olmasıdır. Hücre germe sistemleri, PDMS membranlarında yetişen hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılabilirken, doğal sınırlamalar, bu tür cihazların ex vivo preparatlarla görüntüleme deneyleri için kullanılmasını engellemektedir. Bu sınırlamalar, bir fare mesanesinin montajı ve görüntülenmesi ile ilgili zorlukları ve mesane mukozasının katlanmış doğası göz önüne alındığında, dokuyu gererken ilgilenilen hücrelere odaklanmayı sürdürmedeki zorlukları içerir.
Ürotelyal preparatlarda mekanik olarak aktive olmuş Ca2+ geçicileri ölçme protokolünün bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, makine nispeten pahalı bileşenler içerir ve montajı ve kurulumu mikroskoplar, mikromanipülatörler, analog-dijital dönüştürücüler ve nispeten özel yazılımlar konusunda uzmanlık gerektirir. Yama sıkıştırma gibi, bu teknik de araştırmacının bir mikromanipülatörün nasıl kullanılacağını ve mekanik stimülasyon için cam mikropipetlerin nasıl yapılacağını öğrenmesini gerektirir. Bununla birlikte, pipet ve membran arasında yüksek dirençli bir contanın oluşumunu içeren yama-kelepçe tekniğinin aksine, mekanik olarak aktive olmuş Ca2+ geçicileri ölçmek için burada açıklanan prosedür nispeten basittir ve sadece araştırmacının uyarıcı pipeti uyarılacak hücrenin yüzeyine yakın bir yere konumlandırmasını gerektirir. Bu nedenle, eğitimli bir araştırmacı, 1 saat içinde 8-10 hücrenin dürtülmesine verilen cevabı potansiyel olarak değerlendirebilir, bu da yama-kelepçe tekniği ile düşünülemez.
Mekanik olarak aktive olmuş iyon kanallarının normal vücut fonksiyonlarında ve hastalık durumlarında sahip olduğu önem göz önüne alındığında, bu kanalları doğal ortamlarında incelemek için yeni yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu protokolde açıklandığı gibi, görüntüleme yöntemleri, bu kanalların çevrelerindeki değişiklikleri nasıl algıladıklarına ve fizyolojik tepkiler ürettiklerine dair benzersiz bir fikir verebilir. Tüp veya kese şeklindeki organların mukozal yüzeyinin erişilebilirliği göz önüne alındığında, burada açıklanan yöntem, bağırsak, ürogenital sistem, kan damarları vb. dahil olmak üzere diğer ortamlarda mekanotransdüksiyonu incelemek için uyarlanabilir. Bu nedenle, vücuttaki mekanik tepkileri incelemek genel olarak yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, NIH hibeleri R01DK119183 (G.A. ve MDC'ye) ve S10OD028596 (GA'ya) ve Pittsburgh Böbrek Araştırma Merkezi'nin Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmaları Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri (P30DK079307) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A.
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al.
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J.
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
