Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att bedöma funktionen hos mekaniskt aktiverade jonkanaler i inhemska urotelceller med hjälp av den fluorescerande Ca2+ sensorn GCaMP5G.
Abstract
Mekaniskt aktiverade jonkanaler är biologiska givare som omvandlar mekaniska stimuli såsom sträck- eller skjuvkrafter till elektriska och biokemiska signaler. Hos däggdjur är mekaniskt aktiverade kanaler väsentliga för detektering av yttre och inre stimuli i processer så olika som beröringskänsla, hörsel, volymreglering av röda blodkroppar, basal blodtrycksreglering och känslan av urinblåsans fullhet. Medan funktionen hos mekaniskt aktiverade jonkanaler har studerats utförligt i in vitro-inställningen med hjälp av patch-clamp-tekniken, är det fortfarande en svår uppgift att bedöma deras funktion i sin ursprungliga miljö, ofta på grund av begränsad tillgång till uttrycksställena för dessa kanaler (t.ex. afferenta terminaler, Merkelceller, baroreceptorer och njurtubuli) eller svårigheter att tillämpa patch-clamp-tekniken (t.ex. de apikala ytorna av uroteliala paraplyceller). Detta protokoll beskriver ett förfarande för att bedöma mekaniskt framkallade Ca 2+ transienter med hjälp av den fluorescerande sensorn GCaMP5G i ett ex vivo urotelialt preparat, en teknik som lätt kan anpassas för studier av mekaniskt framkallade Ca2+ händelser i andra naturliga vävnadspreparat.
Introduction
Epitelceller i urinvägarna utsätts för mekaniska krafter när urinfiltratet färdas genom nefronerna, och urin pumpas ut ur njurbäckenet och färdas genom urinledarna för att lagras i urinblåsan. Det har länge erkänts att mekaniska krafter (t.ex. skjuvspänning och sträckning) som utövas av vätskor på epitelcellerna som kantar urinvägarna reglerar reabsorptionen av protein i den proximala tubuli och av lösta ämnen i den distala nefronen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, samt lagring av urin i urinblåsan och urinering14,15,16,17.
Omvandlingen av mekaniska stimuli till elektriska och biokemiska signaler, en process som kallas mekanotransduktion, medieras av proteiner som svarar på deformationen av cellulära strukturer eller den associerade extracellulära matrisen 18,19,20,21. Mekaniskt aktiverade jonkanaler är unika i den meningen att de övergår från ett slutet tillstånd till ett öppet permeabelt tillstånd som svar på förändringar i membranspänning, tryck eller skjuvspänning 18,19,20,21,22. Dessutom kan Ca 2+ transienter initieras genom integrinmedierad mekanotransduktion eller genom aktivering av mekanoresponsiva adhesionssystem vid cell-cellkorsningar23,24,25,26. Jonkanalens funktion bedöms vanligtvis med patch-clamp-tekniken, vilket innebär bildandet av en gigaohmtätning mellan cellmembranet och patchpipetten27. Celler som ligger i djupa vävnadsskikt med en tät extracellulär matris (t.ex. njurtubuli) eller omgiven av en fysisk barriär (t.ex. glykokalyx) är emellertid svåra att komma åt med en glasmikropipett. På samma sätt kan celler inbäddade eller som är integrerade delar av vävnader med dålig mekanisk stabilitet (t.ex. urotelet) inte lätt studeras med patch-clamp-tekniken. Eftersom många mekaniskt aktiverade jonkanaler är permeabla för Ca2+, är ett alternativt tillvägagångssätt att bedöma deras aktivitet med fluorescerande mikroskopi med hjälp av ett Ca2 + -känsligt färgämne eller genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) såsom GCaMP. Nya ansträngningar inom proteinteknik har avsevärt ökat det dynamiska omfånget, känsligheten och svaret hos GECIs28,29,30, och framsteg inom genetik har möjliggjort deras uttryck i specifika cellpopulationer, vilket gör dem idealiska för att studera mekanotransduktion.
Urotelet, det stratifierade epitelet som täcker urinblåsans inre, fungerar som en barriär, förhindrar diffusion av urinlösta ämnen i urinblåsans interstitium, men fungerar också som en givare, känner av blåsans fullhet och kommunicerar dessa händelser till de underliggande nerverna och muskulaturen16. Tidigare studier har visat att kommunikationen mellan urotelet och underliggande vävnader kräver de mekaniskt aktiverade jonkanalerna Piezo1 och Piezo231. För att bedöma mekaniskt inducerade Ca 2+ transienter i urotelceller utvecklades en ny teknik som beskrivs som använder adenoviral genöverföring för att uttrycka Ca2+ sensorn GCaMP5G i urotelceller. Denna teknik använder en slemhinneberedning som ger enkel åtkomst till det yttersta paraplycellskiktet och ett datorassisterat system för samtidig mekanisk stimulering av enskilda celler med en sluten glasmikropipett och registrering av förändringar i fluorescens över tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vård och hantering av djuren utfördes i enlighet med University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Kvinnliga, 2-4 månader gamla C57Bl / 6J-möss användes för den aktuella studien. Mössen erhölls kommersiellt (se materialförteckning).
1. Montering och installation av utrustning
- Utför Ca2+ avbildning med upprätt mikroskop utrustat med högupplöst kamera och stabil ljuskälla (se Materialförteckning).
- Hämta bilderna med en mikroskopkompatibel programvara som tillåter direkt kontroll av kameran, ljuskällan och piezoställdonet via en digital USB-I / O-enhet (se materialförteckning).
OBS: Figur 1 representerar en schematisk bild av installationen. GCaMP5G har en toppexcitationsvåglängd på 470 nm och en toppemissionsvåglängd på 497 nm28. Använd en filterkub som är lämplig för GCaMP5G-avbildning.
- Hämta bilderna med en mikroskopkompatibel programvara som tillåter direkt kontroll av kameran, ljuskällan och piezoställdonet via en digital USB-I / O-enhet (se materialförteckning).
- För stimulering av enskilda urotelceller i blåsans slemhinneberedning (se steg 2), använd ett piezoelektriskt ställdon som styrs av en enkanalig piezoregulator med öppen slinga (se materialtabell). Montera det piezoelektriska ställdonet i en mikromanipulator.
- Montera mikropipetter av glas i en pipetthållare fäst vid det piezoelektriska ställdonet (figur 1). Fjärrstyr piezostyrenheten med en analog/digital omvandlare som styrs av ett elektrofysiologiskt datainsamlings- och analysprogram (se Materialförteckning).
OBS: En extern utlösare, i form av en transistor-transistorlogik (TTL) -signal initierad av bildprogramvaran, används för att utlösa stimuleringsprotokollet i elektrofysiologins datainsamlings- och analysprogramvara som flyttar det piezoelektriska ställdonet (figur 1).
- Montera mikropipetter av glas i en pipetthållare fäst vid det piezoelektriska ställdonet (figur 1). Fjärrstyr piezostyrenheten med en analog/digital omvandlare som styrs av ett elektrofysiologiskt datainsamlings- och analysprogram (se Materialförteckning).
- Kontrollera att bildåtergivningsprogrammet (se Materialförteckning) har ett gränssnitt mot den digitala I/O-enheten. Konfigurera en digital utgångskanal i den digitala USB-I/O-enheten för att leverera TTL-signalen till den analoga/digitala omvandlaren, som initierar protokollet i elektrofysiologiprogramvaran som flyttar det piezoelektriska ställdonet.
- Använd en kabel för att ansluta Start BNC-porten i den analoga/digitala omvandlaren till marken (GND) och en skruvterminal i den digitala USB-I/O-enheten.
- Ställ in inspelningsprotokollet i bildhanteringsprogrammet.
Följande steg beskriver hur du genererar ett protokoll som skickar en TTL-signal och börjar samla in bilder vid angivna tidsintervall.- Ställ in insamlingsprotokollet i bildhanteringsprogrammet genom att klicka på Experiment Manager och välja Nytt experiment. Ett nytt fönster öppnas.
- Välj ikonen Time Lapse Loop och dra den till det nyöppnade fönstret; Ställ in antalet cykler på 2 och intervallet på den snabbaste inställningen som tillåts i inställningarna.
- Från ikonen Överförd slutare / manuell slutare, välj ikonen NI USB-6501 och dra den till fönstret Time Lapse Loop och ställ sedan in NI USB-6501 som stängd. Dra ytterligare en NI USB-6501 från den överförda slutaren/manuella slutaren till fönstret Time Lapse Loop och ställ in den som öppen. För att ansluta de två NI USB-6501-ikonerna, dra pilspetsen på sidan av NI USB-6501 stängd ikon och dra tills den rör vid NI USB-6501 öppen ikon. En linje som förbinder båda ikonerna visas.
- Dra en annan Time Lapse Loop till Experiment Manager-fönstret och anslut den till den första genom att dra pilspetsen. Ställ in parametrarna för inspelning. Ställ in antalet cykler för den nya Time Lapse Loop till 2400.
- Dra GFP-filtret från ikonen Bildförvärv till den nyligen öppnade Time Lapse Loop och ställ in exponeringstiden till 100 ms.
- Ställ in kamerans bildtyp på 8-bitars, upplösning på 576 x 576 (Binning 4 x 4), pixelklocka på 480 MHz och Hot pixel-korrigering på standard.
OBS: Parametrarna kan justeras beroende på uttrycksnivån för den fluorescerande sensorn, kamerans känslighet och inställningskonfiguration.
- Ställ in labbbänken i elektrofysiologiprogramvaran (se Materialförteckning).
OBS: Detta definierar utsignalen i mV för den analoga / digitala omvandlaren.- Gå till menyn Konfigurera i elektrofysiologiprogramvaran och välj Lab Bench. I det resulterande fönstret Utsignaler väljer du Analog Out #1, trycker på Lägg till signal och namnger den (t.ex. "Piezo"). Ställ in signalenheten på mV och skalfaktorn (mV/V) på 1.
- Skapa ett stimuleringsprotokoll i elektrofysiologiprogramvaran genom att följa stegen nedan.
- För att generera ett nytt stimuleringsprotokoll i elektrofysiologiprogramvaran, gå till menyalternativet Hämta och välj Nytt protokoll.
- Ställ in läge/hastighet på episodisk stimulering, Kör/försök på 1, Svep/Kör på 1 och Svep varaktighet (er) på 150.
- I menyn Utdata väljer du kanal #1 Piezo som Analog ut.
- I menyn Utlösare ställer du in utlösaren på Digitizer Start Input och Internal Timer.
- I vågformsmenyn väljer du kanal #1 och analog vågform med epoker. Ställ in Steg A på Steg, Första nivån på 0, Deltanivå på 0, Första varaktighet på 10000 och Deltavaraktighet på 0.
- Ställ in Steg B på Steg, Första nivån på 10, Deltanivå på 0, Första varaktighet på 1000 och Deltavaraktighet på 0. Ställ in Steg C på Steg, Första nivån på 0, Deltanivå på 0, Första varaktighet på 130000 och Deltavaraktighet på 0.
- Spara protokollet och ge det namnet Stimuleringsprotokoll.
- Använd en BNC-kabel för att ansluta analog utgång #1 i den analoga/digitala omvandlaren till EXT INPUT på framsidan av den enkanaliga piezokontrollen med öppen slinga (se Materialförteckning).
- Tillverka glasmikropipetter för mekanisk stimulering av paraplyceller från kapillärglasrör enligt stegen nedan.
- Placera kapillärglaset i en avdragare (se Materialtabell) och justera det med kapillärlåsknapparna.
- Placera värmeenheten i full höjd. Justera avdragarens första reglage för dragavslutningsläge till 5.
- Ställ in den första värmeratten på 76,7 och den andra ratten på 52,7.
- Dra glaskapillären i två steg genom att trycka på startknappen.
- Stäng spetsen på mikropipetten med en mikrosmedja (se Materialtabell) med värmejusteringsknappen inställd på 60.
OBS: För detta protokoll är den slutliga diametern på mikropipettspetsen som används för att peta enskilda celler ~ 1-3 μm.
- Kontrollera att den stimulerande mikropipetten rör sig det avstånd som anges i stimuleringsprotokollet.
OBS: Följande steg är att säkerställa att 12,5 s efter initiering av stimuleringsprotokollet i elektrofysiologiprogramvaran genereras en spänningspuls med en varaktighet av 1 s, vilket gör att det piezoelektriska ställdonet rör sig 20 μm.- Montera en mikropipett i hållaren och fäst den på det piezoelektriska ställdonet.
- Placera det piezoelektriska ställdonet och den bifogade mikropipetten parallellt med mitten av mikroskopsteget och inom synfältet.
- Fokusera på pipettens spets och immobilisera den piezoelektriska monteringsstången (se Materialtabell) med tejp. Under ljusfältsbelysning, justera kameraparametrarna för att få en tydlig bild av pipettspetsen.
- Öppna stimuleringsprotokollet i elektrofysiologiprogrammet och ställ in det på att spela.
OBS: Elektrofysiologiprotokollet startar inte förrän TTL-signalen som skickas från bildprogramvaran tas emot. - Från Experiment Manager i bildhanteringsprogrammet trycker du på Start för att starta datainsamlingen.
OBS: Detta kommer att utlösa protokollet i elektrofysiologiprogramvaran, som kommer att driva det piezoelektriska ställdonet. Protokollet i bildprogramvaran genererar en fil med bilderna av experimentet.
- Kontrollera pipettens tillryggalagda sträcka genom att följa stegen nedan.
- För att mäta pipettens tillryggalagda sträcka under stimuleringsprotokollet, välj alternativet Räkna och mät i bildbehandlingsprogrammet.
- På menyn Mät väljer du alternativet Mätning och avkastning så visas ett nytt fönster under filmfönstret.
- På menyn Mät väljer du den godtyckliga linjen.
- I filmfönstret ritar du en godtycklig linje som börjar vid pipettens spets. Observera att slutet på den godtyckliga raden kommer att justeras senare.
- Högerklicka på den godtyckliga linjen för att konvertera linjen till en intresseregion (ROI), som kommer att synas i alla filmramar.
- Inspektera filmen och justera änden av den godtyckliga linjen (ROI) till den slutliga positionen som pipetten reste som svar på stimulansen.
OBS: Pipettens tillryggalagda sträcka i μm visas i fönstret Mätning och ROI . Stimuleringsprotokollet kan modifieras enligt användarens behov.
2. In situ-transduktion och isolering av blåsans slemhinna
- Transducera kvinnliga musblåsor in situ med ett adenovirus som kodar för CGaMP5Gs cDNA enligt proceduren som beskrivs i virustransduktionsprotokollet31.
- Vid transducering av urotelceller för Ca2+ avbildningsexperiment, sätt in blåsorna med 50 μL av lösningen innehållande 2 x 107 infektiösa viruspartiklar (IVP).
OBS: Denna teknik tenderar att begränsa uttrycket av CGaMP5G till paraplycellskiktet. Alternativt kan experiment utföras med urinblåsor skördade från transgena möss som uttrycker CGaMP5G i urotelceller (dvs GCaMP5G-uttryck som drivs av en uroplakin-2-promotor) eller någon annan celltyp av intresse.
- Vid transducering av urotelceller för Ca2+ avbildningsexperiment, sätt in blåsorna med 50 μL av lösningen innehållande 2 x 107 infektiösa viruspartiklar (IVP).
- 24-72 h efter transduktion, avliva mössen genom CO 2-kvävning och utför en thorakotomi genom att öppna bröstkaviteten med sax för att få lungorna att kollapsa.
- Canulera urinröret med en 24 G kateter. Exponera urinblåsan genom ett buksnitt på ~ 1,5 cm genom huden och muskeln och använd en 6,0 sutur (se materialtabell) för att säkra katetern till urinröret.
- Skörda blåsan och urinröret 32 och fäst på en silikongummihållare (se materialtabell) badad i registreringslösning innehållande (i mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl2, 10 glukos, 10 HEPES, pH 7,4 och bubblas upp med 100%O2 (figur 2A).
- Separera blåsans slemhinna från det underliggande muskelskiktet med fina pincett enligt tidigare publicerade rapporter32 (figur 2B).
- Skär upp blåsans slemhinna och fäst den med urotelet uppåt mot en silikonelastomerinsats i botten av en 35 mm diameter vävnadsodlad skål (figur 2C).
3. Mekanisk stimulering av enskilda urotelceller och Ca2+ avbildning
- Montera den vävnadsodlade skålen med den fästa blåsans slemhinna i mikroskopstadiet utrustad med en odlingsskålinkubator med resistiva värmeelement (figur 2E). Perfusera (enligt tillverkarens instruktioner, se Materialförteckning) cellodlingsskålen kontinuerligt med en hastighet av 1,7 ml / min med inspelningslösning uppvärmd till ~ 37 ° C med en in-line värmare.
- Håll temperaturen på mjukpappersskålens inkubator och lösningar vid ~ 37 ° C med en tvåkanals bipolär temperaturregulatormodell (se materialtabell). Balansera vävnaden i kammaren med kontinuerlig perfusion i minst 15 minuter innan ytterligare experimentella procedurer utförs.
- För att registrera mekaniskt inducerade Ca2+ transienter, sänk ner mikropipetten i lösningen som badar den fästa blåsans slemhinna i vävnadsskålen. Flytta mikropipetten till mitten av fältet med hjälp av ett skanningsmål med låg förstoring (4x) med ljusfältsbelysning.
- Flytta mikropipetten nära ytan av urotelvävnaden genom att koordinera flytta mikromanipulatorn i vertikalplanet och justera fokus.
- Byt objektivet till ett med högre förstoring (20x) lämpligt för immunofluorescens med hög numerisk bländare (NA).
- Ställ in mikromanipulatorn på Fine och flytta mikropipetten nära toppen av målcellen.
- Ändra synfältet till kameran och tryck på Live i bildprogrammet.
OBS: Detta måste slå på den reflekterade slutaren och tillåta observation av den fluorescerande signalen som avges från vävnaden i datorn. - Justera fokus för att visualisera toppen av cellen och justera pipettens position om det behövs.
- Öppna stimuleringsprotokollet i elektrofysiologiprogrammet och ställ in det på att spela.
OBS: Protokollet i elektrofysiologiprogramvaran startar inte förrän TTL-signalen som skickas från bildhanteringsprogrammet tas emot. - Från Experiment Manager i bildhanteringsprogrammet trycker du på Start för att starta datainsamlingen. Detta kommer att utlösa protokollet i elektrofysiologiprogramvaran, som kommer att driva det piezoelektriska ställdonet och generera en fil med bilderna av experimentet. Stimuleringsprotokollet kan modifieras efter användarens behov.
4. Analys av data
- Kvantifiera fluorescensintensiteten över tid genom att följa stegen nedan.
- Öppna bildfilen i bildhanteringsprogrammet och välj fönstret Räkna och mät. Välj polygonverktyget och rita en ROI på gränserna för cellen som petades.
- Gå till fönstret Mät, välj Intensitetsprofil, ställ in mätningen på Över tid, Resultat till genomsnitt, Bakgrundssubtraktion till ingen och tryck sedan på Kör. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten beräknas över tid (figur 3).
- Om du vill exportera intensitetsprofildata klickar du på Excel-ikonen i fönstret Resultat för intensitetsprofil. Detta låter användaren välja målmapp och filnamn och spara data i ett .xlsx format.
- Utföra dataanalys med hjälp av vetenskaplig graf- och dataanalysprogramvara (se Materialförteckning).
OBS: Amplituden för Ca2+ -toppen som framkallas av petning uttrycks som förändringen i fluorescensintensitet (ΔF / F), där F är fluorescensintensiteten för GCaMP5G vid tiden 0 och ΔF är skillnaden mellan fluorescensintensitetsmaxima och basal vid tiden 0. Sönderfallet av Ca2+ -svaret kan också beräknas (visas inte).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver en teknik för att bedöma mekaniskt framkallade Ca 2+ transienter i paraplyceller med hjälp av den fluorescerande Ca2+ sensorn GCaMP5G. Adenoviral transduktion användes för att uttrycka GCaMP5G i urotelceller på grund av dess höga effektivitet och eftersom den ger en förhöjd uttrycksnivå. Fluorescerande bilder av färgade kryosektioner från en transducerad blåsa visas i figur 2D. För dessa experiment är GCaMP5G-uttrycket högst i paraplycellskiktet. En sekvens av representativa bilder som tagits under ett experiment där en paraplycell petades visas i figur 3A. Den första bilden i figur 3A visar en fluorescerande bild av den stimulerande pipetten placerad på toppen av en paraplycell i en blåsslemhinna som uttrycker GCaMP5G. Mekanisk stimulering av paraplycellen som uttrycker GCaMP5G orsakar en deformation (se bild 3A vid 12,5 s), följt av en snabb ökning av fluorescensemissionen (se bild 3A vid 13,5 s). Förändringen i fluorescens plottades som en funktion av tiden (figur 3B). Som rapporterats tidigare31 framkallar petning ett Ca2+ -svar i de flesta paraplyceller som testats i blåsor från kontroll- och vildtypsmöss transducerade med GCaMP5G. Radering av Piezo1 och Piezo2 från paraplyceller minskade toppamplituden för Ca2+ -svaret31. När man jämför effekten av olika behandlingar eller genetisk bakgrund på mekaniskt framkallade Ca2+ -svar är det viktigt att standardisera experimentella förhållanden, inklusive transduktion av urinblåsan, montering av vävnaden, storleken på pipettens spets som används för indragning, mekanisk stimulansvaraktighet och amplitud och avbildningsförhållanden.
Figur 1: Experimentell inställning för att registrera mekanoaktiverade Ca2+ transienter i urotelceller. Riggen består av ett upprätt mikroskop, fluorescerande ljuskälla, excitations- och emissionsfilter och en CMOS-kamera. Bildhanteringsprogramvaran styr systemet. Ett piezoelektriskt ställdon som styrs av en enkanals piezostyrenhet med öppen slinga används för att flytta den petande mikropipetten. Mikropipetter av glas är monterade i en pipetthållare fäst vid det piezoelektriska ställdonet. Det piezoelektriska ställdonet och tillhörande mikropipett är monterade på en mikromanipulator (visas inte). Piezo-styrenheten med öppen slinga fjärrstyrs av en analog/digital omvandlare och elektrofysiologiprogramvara. Ett inspelningsprotokoll i bildhanteringsprogramvaran levererar en TTL-signal via en digital I / O-enhet, och detta initierar stimuleringsprotokollet i elektrofysiologiprogramvaran som styr den piezoelektriska och därefter bildtagningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Isolering och montering av blåsans slemhinna för Ca2+ avbildning. a) Beredning av slemhinneskivor med en bifogad kateter. Blåsans slemhinna avlägsnades från det underliggande muskelskiktet med fina pincett. (B) Förstorad bild av den avskalade blåsslemhinnan som visas i panel (A). (C) Slemhinnan fästes med urotelet uppåt med 0,15 mm insektsstift till en silikonelastomerinsats. (D) Konfokala immunofluorescenstvärsnittsbilder av slemhinnans arkberedning färgad med en antikropp mot GFP och en sekundär åsna-antikaninkonjugerad antikropp (grön), rodamin-falloidin (röd) och DAPI (blå). Blåsans slemhinnepreparat innefattar en del av lamina propria (LP). Pilar anger placeringen av paraplycellskiktet (Ub). Skalstreck = 50 μm. (E) Fotografi av experimentuppställningen. a, in-line värmare; b, piezoelektriskt ställdon; c, värmeelement och styrenhet; d, pipetthållare och mikropipett; e, slemhinneplåt fäst vid silikoninsatsen i en vävnadsodlad maträtt och skålinkubator. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Registrering och analys av mekanoaktiverade Ca2+ transienter i urotelceller. (A) Sekvens av fluorescerande bilder tagna vid olika tidpunkter under ett experiment. Observera att mekanisk stimulering av paraplycellen orsakar en deformation följt av en snabb ökning av utsläppet av GCaMP5G (pil). Gränserna för den stimulerade cellen (ROI) är markerade med rött. (B) Förändring av fluorescensintensiteten (ΔF/F) över tid för åtta oberoende mekaniskt stimulerade celler i ett blåsans slemhinnepreparat från en kontrollmus. Indragningstiden (12,5 s) markeras med en blå pil. Uppgifterna i (B) har modifierats från Dalghi et al.31. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alla organismer, och till synes de flesta celltyper, uttrycker jonkanaler som svarar på mekaniska stimuli 20,33,34,35,36,37. Funktionen hos dessa mekaniskt aktiverade kanaler har huvudsakligen utvärderats med patch-clamp-tekniken. På grund av tillgänglighetsproblem har dock patch-clamp-studier av mekaniskt aktiverade jonkanaler i stort sett begränsats till dissocierade celler och cellinjer. Eftersom många mekaniskt aktiverade jonkanaler är permeabla för Ca2+, utnyttjade vi de senaste framstegen inom mikroskopi, biosensing och mikromanipulation för att utveckla en avbildningsmetod för att bedöma funktionen hos mekaniskt aktiverade kanaler i ett ex vivo urotelpreparat. I detta protokoll transduceras urotelceller med ett adenovirus som kodar för GCaMP5G. Adenovirala vektorer är idealiska för att studera Ca 2+ signalering i urotelet eftersom de ger en hög transduktionshastighet och höga uttrycksnivåer av GCaMP5G i urotelceller (figur 2D). Under dessa förhållanden är bakgrundsfluorescensen relativt låg. Om adenoviral transduktion används för att uttrycka en genetiskt kodad Ca2+ sensor, bör särskild vikt läggas vid att optimera förhållandena, så att endast cellerna av intresse uttrycker sensorn. Som ett alternativ kan uttryck av genetiskt kodadeCa2+ indikatorer (GECI) uppnås genom att korsa möss som bär en floxad transgen som kodar för proteinet av intresse (t.ex. GCaMP5G) och möss som uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av en lämplig promotor. Detta tillvägagångssätt kräver inte kirurgiska ingrepp och har fördelen att ge målinriktat uttryck och till och med nivåer av uttryck av proteiner i celler som uttrycker Cre-rekombinas.
Protokollet som beskrivs här använder ett upprätt bredfältsmikroskop för att bedöma mekaniskt aktiverade Ca2+ transienter i paraplyceller stimulerade med en sluten brandpolerad mikropipett. Metoden skulle kunna anpassas för att studera mekanotransduktion i djupare lager av urotelet eller till och med celler i lamina propria med ett upprätt konfokalt eller tvåfotonmikroskop. Användning av ett konfokalmikroskop kan ge den nödvändiga upplösningen för att definiera subcellulära förändringar i intracellulär Ca2+ som uppstår som svar på mekanisk stimulering. Detta protokoll använder en sluten eldpolerad mikropipett för att peta enskilda paraplyceller. Den största fördelen med att använda en mikropipett för stimulering är att den mekaniska störningen som utövas på vävnaden är övergående och begränsad till cellen av intresse och det omgivande området. Medan cellsträckningssystem kan användas för att mekaniskt stimulera celler som odlas på PDMS-membran, hindrar inneboende begränsningar användningen av sådana anordningar för avbildningsexperiment med ex vivo-preparat . Dessa begränsningar inkluderar utmaningar med montering och avbildning av en musblåsa och, med tanke på blåsans slemhinnas veckade natur, svårigheter att behålla fokus på cellerna av intresse medan man sträcker vävnaden.
Protokollet för att mäta mekaniskt aktiverade Ca2+ transienter i urotelpreparat har vissa begränsningar. För det första innehåller riggen relativt dyra komponenter, och dess montering och installation kräver expertis med mikroskop, mikromanipulatorer, analog-digitala omvandlare och relativt specialiserad programvara. Liksom patch-clamping kräver denna teknik att utredaren lär sig att använda en mikromanipulator och göra glasmikropipetter för mekanisk stimulering. Till skillnad från patch-clamp-tekniken, som involverar bildandet av en hög motståndstätning mellan pipetten och membranet, är proceduren som beskrivs här för att mäta mekaniskt aktiverade Ca2+ transienter relativt enkel och kräver endast att utredaren placerar den stimulerande pipetten nära ytan av cellen som ska stimuleras. Därför kan en utbildad utredare potentiellt bedöma svaret på petningen av 8-10 celler på 1 timme, vilket är otänkbart med patch-clamp-teknik.
Med tanke på den betydelse som mekaniskt aktiverade jonkanaler har för normal kroppsfunktion och sjukdomstillstånd behövs nya metoder för att studera dessa kanaler i sin ursprungliga miljö. Som beskrivs i detta protokoll kan avbildningsmetoder ge unik inblick i hur dessa kanaler känner av förändringar i sin miljö och genererar fysiologiska svar. Med tanke på tillgängligheten av slemhinnans yta i de rör- eller säckformade organen kan metoden som beskrivs här anpassas för att studera mekanotransduktion i andra miljöer, inklusive tarmen, urogenitala kanaler, blodkärl etc. Således kan studier av mekaniska reaktioner i kroppen vara allmänt användbara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01DK119183 (till GA och MDC) och S10OD028596 (till GA) och av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores vid Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A.
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al.
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J.
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
