Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att övervaka utvecklingen av morfologiska förändringar över tid i livmodern i en inducerbar musmodell av endometriecancer med hjälp av ultraljudsavbildning med korrelation till grova och histologiska förändringar.
Abstract
Livmodercancer kan studeras hos möss på grund av enkel hantering och genetisk manipulation i dessa modeller. Dessa studier är emellertid ofta begränsade till att bedöma patologi efter slakt hos djur som avlivas vid flera tidpunkter i olika kohorter, vilket ökar antalet möss som behövs för en studie. Bildande möss i longitudinella studier kan spåra sjukdomsprogressionen hos enskilda djur, vilket minskar antalet möss som behövs. Framsteg inom ultraljudsteknik har möjliggjort detektering av förändringar på mikrometernivå i vävnader. Ultraljud har använts för att studera follikelmognad i äggstockar och xenografttillväxt men har inte tillämpats på morfologiska förändringar i livmodern hos möss. Detta protokoll undersöker sammanställningen av patologi med in vivo-avbildningsjämförelser i en inducerad endometriecancermusmodell. De egenskaper som observerades av ultraljud överensstämde med graden av förändring som ses av grov patologi och histologi. Ultraljud visade sig vara mycket prediktivt för den observerade patologin, vilket stöder införlivandet av ultraljud i longitudinella studier av livmodersjukdomar som cancer hos möss.
Introduction
Möss är fortfarande en av de viktigaste djurmodellerna för reproduktionsstörningar 1,2,3. Det finns flera genetiskt modifierade eller inducerade gnagarmodeller av äggstocks- och livmodercancer. Dessa studier förlitar sig vanligtvis på flera kohorter som avlivas vid olika tidpunkter för att fånga longitudinella trender i morfologiska och patologiska förändringar. Detta förhindrar möjligheten att förvärva kontinuerliga data om cancerutveckling i en enskild mus. Dessutom, utan att känna till det individuella mussjukdomsprogressionstillståndet, baseras interventionsstudier på förutbestämda tidpunkter och genomsnittliga fynd från tidigare kohorter snarare än individuella tröskelvärden för detektion av progression i ett specifikt djur 4,5. Därför behövs avbildningsmetoder som möjliggör longitudinell bedömning i levande djur för att underlätta prekliniska modeller för testning av nya läkemedel eller föreningar och påskynda förståelsen av patobiologi samtidigt som noggrannheten och reproducerbarheten ökar6.
Ultraljud (US) är en tilltalande metod för longitudinell övervakning av mus livmodercancer progression eftersom det är relativt enkelt och billigt jämfört med andra avbildningsmetoder, är lätt att utföra och kan ha anmärkningsvärd upplösning 6,7. Denna icke-invasiva modalitet kan fånga funktioner till mikronskalan hos vakna möss eller med möss under kort sedering med hjälp av en 5-10 minuters undersökning. Ultraljudsmikroskopi har validerats som en metod för att mäta musäggstocksfollikelutveckling 8 och tillväxten av implanterad eller inducerad neoplasi 9,10,11. Högfrekvent US har också använts för perkutana intrauterina injektioner12 och observera råtta livmoderförändring under estrus cykeln13. Högfrekvent US kan användas med möss som hålls på specialiserade stationära plattformar med hjälp av ett skensystem för att hålla givaren / sonden för att fånga högupplösta bilder med standardiserad position och tryck; Denna utrustning är dock inte tillgänglig på alla institutioner. Handhållna givarskanningsmetoder kan användas med mindre dedikerad utrustning och användas för både klinisk diagnostik och forskningsapplikationer på möss.
Frågan kvarstår om amerikansk avbildning med handhållna, högfrekventa sonder kan användas för att övervaka utvecklingen av livmodercancer under flera veckor. I likhet med tarmarna är gnagarens livmoder en tunnväggig, smal struktur som är mycket mobil i buken och gränsar till flera vävnadsdjup, vilket gör avbildning mer utmanande än med relativt orörliga organ som njurarna. Denna studie syftade till att fastställa korrelationen mellan vävnader observerade med ultraljud och histopatologi, definiera landmärken för att lokalisera livmodern hos mössen och bestämma genomförbarheten av den longitudinella bedömningen av endometriecancer. Denna studie presenterar data som visar en kvalitativ överensstämmelse mellan utseendet på livmoder avbildad av USA och histopatologi, samt seriell avbildning av möss under flera veckor. Dessa resultat indikerar att handhållen USA kan användas för att övervaka utvecklingen av endometriecancer hos möss, vilket skapar en möjlighet att samla in individuella longitudinella musdata för att studera livmodercancer utan behov av dedikerad utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer och experiment med möss utfördes enligt protokoll som godkänts av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. För alla procedurer användes lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive handskar och engångsisoleringsrockar. Försiktighetsåtgärder vidtogs vid hantering av vassa föremål, som kastades korrekt i behållare för vassa föremål i röda lådor omedelbart efter användning. Se materialtabellen för detaljer om allt material och utrustning som används i detta protokoll.
1. Induktion av endometriecancer hos iPAD (inducerbar Pten, Arid1a dubbel deletion) möss med doxycyklin
- Behåll 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten transgena möss (iPAD) med dubbel deletion (figur 1) på en blandad genetisk bakgrund (129S, BALB/C, C57BL/6), som tidigare beskrivits14.
- Samla in ultraljudsbilder (2D) av äggstockarna, äggledaren och livmodern hos varje mus före doxycyklinbehandling.
- Ge uteslutande doxycyklininnehållande mus chow dieter (doxycyklinhyklat vid 625 mg / kg foder) till kvinnliga iPAD-möss i minst 2 veckor med början vid 7-8 veckors ålder för att inducera gendeletion.
2. Installation av utrustning
- Slå på värmedynan och täck med en ren absorberande dyna (måltemperatur: 38 °C).
- Bekräfta att isofluranförångaren ochO2-tanken är tillräckligt fyllda. Fyll på och byt ut om innehållet är lågt.
- Anslut induktionskammaren, noskonen och rensningssystemet till förångaren.
- Ställ in ultraljudsmaskinen.
- Välj en givare (sond) med ett intervall på 32-56 MHz eller upp till 70 MHz för avbildning av livmodern respektive äggstocken.
- Anslut sonden och slå på maskinen.
- Efter systemstart, använd kontrollpanelen för att logga in med användaruppgifterna och komma åt startskärmen.
- Från startskärmen, gå till fliken Program och välj Musläge (liten) buk.
- Klicka på Scan för att återgå till startskärmen och vänta tills en levande bild visas.
- Välj B-läge från alternativen i den vänstra verktygsfältet.
- Klicka på Fler kontroller för att visa ytterligare verktyg för bildförfining, till exempel bildförstärkning och djup, eller för att justera inställningarna för klippupptagning, till exempel antalet bilder per sekund.
- När bildinställningarna har valts återgår du till startskärmen genom att klicka på Skanna.
- Slå på O2-tanken , rikta flödet till induktionskammaren och ställ in flödeshastigheten på 1 l/min.
3. Förberedelse av möss för ultraljudsscreening, inklusive hårborttagning
- Placera en mus i induktionskammaren. Ställ in isofluranförångaren på 2%-3% vol/vol för induktion av anestesi.
- Bestäm lämpligt anestesidjup genom brist på respons på tånypa och en andningsfrekvens runt 1-2 andetag / s.
- Applicera sterilt oftalmiskt smörjmedel på varje öga. Ta bort pälsen från ryggen och ventrummet mellan det sista revbenet och bäckenet med klippare av lämplig storlek.
- Applicera ett tunt lager hårborttagningskräm på de ventrala och dorsala regionerna som ska avbildas (om det behövs).
- Placera musen tillbaka i induktionskammaren i cirka 3-5 minuter för att bibehålla lämpligt anestesidjup medan hårborttagningskrämen arbetar för att ta bort håret. Efter ≤4 minuter, torka försiktigt bort krämen med en ren fuktig pappershandduk.
OBS: Längre exponering för hårborttagningskräm är irriterande och kan orsaka hudskador.
4. Intraperitoneal injektion av vätska för att öka kontrasten mellan organ
- Värm en 3-10 ml spruta fylld med steril isoton vätskelösning (t.ex. steril 0,9% NaCl eller lakterad Ringers-lösning) till 35-40 °C genom att placera den mellan en värmedyna och en absorberande dyna i flera minuter. Placera en flaska ultraljudsgel på värmedynan om maskinen inte har en varmare.
- För en 20-25 g mus, injicera 1-2 ml lösning i bukhålan.
- Säkra musen med skrubben i ena handen och exponera ventrummet.
- Håll musen i en ~ 20 ° vinkel, med näsan pekad mot golvet för att rikta organen kranialt på grund av tyngdkraften.
- Använd en liten mätnål (25 G, 5/8 i längd, tuberkulinspruta), punktera genom huden och bukväggen i bukens kaudala högra kvadrant.
- Före injektion av vätskor, för att undvika injektion i kärlen eller mag-tarmkanalen, dra tillbaka med minimalt tryck. Om blod eller annat material kommer in i sprutan, ta bort nålen. Använd en ny nål och spruta och försök igen i en något annorlunda position.
- Om musen vaknar under injektionerna, placera den tillbaka i den lilla induktionskammaren för anestesi med 2% -3% vol / vol isofluran.
5. Ultraljudsavbildning från dorsal metod
- Placera musen i ventral liggande liggande på den absorberande dynan över en värmedyna (figur 2A-C).
- Placera en gnagarkon ordentligt över musens näsa och nosparti. Behåll anestesidjupet med isofluran som levereras genom noskonen vid 1%-2% vol/vol i 100%O2. Applicera sterilt oftalmiskt smörjmedel, efter behov, på varje öga.
- Övervaka musen för en regelbunden andningsfrekvens (1-2 / s) och brist på tåklämrespons för att indikera om anestesin behöver justeras.
- Placera en liten mängd (~ 0,5-1 ml) förvärmd ultraljudsgel abaxial (lateral) till ryggraden på vardera sidan av den bedövade musen, mellan det sista revbenet och bäckenet.
- Sätt en liten mängd gel på ultraljudssonden.
- Placera sonden parallellt med ryggkotorna med sondens framsida på kranialsidan. Ett indikatormärke finns på sondhuvudet för att indikera rätt sondorientering. Anteckna dag, tid, djur-ID, sondorientering och djursida (höger, vänster, dorsal, ventral) för varje ny uppsättning bilder som samlas in.
- Med en mus i ventral liggande (dorsumhud som vidrör sonden), skanna långsamt området för njurens landmärke (figur 2B och figur 3). Med njuren i sikte, dra sonden caudal för att hitta äggstocken - en något hyperechoisk oval till rund struktur (figur 4A, B) inom en mycket hyperechoic ovarian fettkudde som gränsar kranio-ventralt av njuren och dorso-lateralt av dorsala bukväggen.
OBS: Tryck caudalt och lateralt till äggstocken kan rikta äggstocken närmare bukväggen och bort från tarmens slingor. Äggstocken är anatomiskt placerad upp mot den dorsala bukväggen, bara ventral och lateral till de epaxiella musklerna och caudal till njuren. - Justera signalförstärkningen med skjutreglaget längst ner på kontrollskärmen för att förbättra bildkontrasten.
- För att förbättra avbildningen av njurarna, applicera tryck med ett finger på den kontralaterala buken. Variera trycket och vinkeln från direkt parallellt med ryggraden till ~ 20 ° ventral.
- När organet av intresse är i sikte, samla in en video genom att klicka på Spara klipp eller Starta inspelning och sedan Stoppa inspelning när du är klar för att behålla bilder med ett förinställt antal ramar.
- Spara enstaka bildrutor från antingen en livebild eller inspelning med knappen Spara bildruta .
- För att avbilda livmodern, dra sonden kaudalt tills äggstocken är i den mest kraniala aspekten av synfältet. Variera sondtrycket och vinkeln tills livmodern är i sikte.
- Upprepa video- och ramsamling för varje organ av intresse.
- Hitta livmodern som löper längsgående längs den dorsala bukväggen med den laterala benmuskulaturen också i sikte (figur 4B).
OBS: Livmoderstorleken och lumendiametern kan variera med fasen av estrus och sjukdomstillstånd. - Övervaka vävnaden för peristaltisk rörelse för att skilja tarmslingorna från livmoderns stationära horn.
6. Samla bilder från ett ventralt tillvägagångssätt
- Placera musen i ryggmärgen och kontrollera att ögonsmörjningen är tillräcklig och att nospartiet sitter ordentligt i noskonen (figur 2A).
- Applicera en liten mängd (~ 0,5-1 ml) förvärmd ultraljudsgel på den ventrala buken och applicera sonden vid mittlinjen precis kranial av pubis för att lokalisera blåsan som ett hypoechoiskt landmärke (Figur 5).
OBS: Om blåsan är för stor och döljer livmoderavbildningen, kan försiktigt tryck placeras på underlivet för att uttrycka urin. - Dra sonden lateralt till urinblåsan för att hitta livmoderhornen. Applicera lätt digitalt tryck från en eller båda sidor av musen för att föra hornen in i synfältet. Håll sonden vinkelrätt mot musen och skanna båda sidor av buken för att fånga tvärgående vyer (tvärsnitt) av båda hornen. Rotera sonden för att fånga sagittala vyer.
- Efter ultraljudet, torka musen ren av gel med en pappershandduk och sätt tillbaka den i buret för att återhämta sig. Möss är helt vakna på 2-5 min. När det är helt vaken och ambulerande, återför musen till djurrummet.
OBS: En värmedyna på låg värme kan placeras under buren för att värma buret för återhämtning. - Vid den experimentella eller humana slutpunkten, avliva musen. Helst avliva musen i hemburet för att minska stressen; Alternativt kan du placera musen i en ren kammare. Leverera trycksatt CO2 med en förskjutningshastighet på 10% -30% av kammarvolymen per minut. Efter cirka 5 minuter utan synlig andning, verifiera döden genom cervikal dislokation. Fortsätt med bukobduktion för tumörskörd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten dubbel deletion (iPAD) transgena möss bibehölls på en blandad genetisk bakgrund (129S, BALB/C, C57BL/6), som tidigare beskrivits14. Mössen matades alla med ett doxycyklinfoder i 2 veckor för att inducera Cre-rekombinas. I tidigare arbete av vår grupp doserades doxycyklin genom sondmatning14; Men i den här aktuella studien fungerade doxycyklinmatningsinduktionsmetoden effektivt och minskade sondmatningsstressen för mössen. Det är viktigt att kontrollera att administreringsmetoden för doxycyklin är tillräcklig för att inducera Cre-rekombinasuttrycket som behövs för att skära ut DNA för tumörsuppressorer (Arid1a och Pten) i Pax8-uttryckande celler, såsom livmodern. Immunhistokemi med antikroppar riktade mot ARID1a och pTEN14 användes för att kontrollera om adekvat tumörsuppressorproteinförlust uppnåddes i livmoderepitelcellerna jämfört med den närliggande stromavävnaden, vilket ses i figur 6. Schemat för musmodellen och tumörsuppressoruttrycksregleringen presenteras i figur 1.
Efter 2 veckors doxycyklin förändrades livmodern inte signifikant i storlek jämfört med kontroller eller samma mus som avbildades före administrering av doxycyklin. Men under de närmaste 2-6 veckorna efter doxycyklin visade ultraljud att mössen utvecklade en rad livmoderpatologier, som började med hyperplasi och utvecklades till adenokarcinom. Figur 7A,B visar amerikanska bilder av en mus livmoder med tidiga patologiska förändringar ses efter 3 veckors doxycyklinbehandling. Figur 7C,D visar den grova patologin och histopatologin för samma livmoder som avbildas i figur 7A,B efter att musen avlivades omedelbart efter avbildning vid 3 veckor. Den mindre (men dilaterade) tunnväggiga livmodern och tidig endometriehyperplasi med bevarande av distinkt lumen (central hyperekoisk livmodervätska) kan observeras. Hos möss som avlivades vid senare tidpunkter var livmodern mycket större, hade en mindre lumen och hade en förtjockad vägg (figur 8 och figur 9). Exempel på dilaterade lumen och subtila förändringar i hyperplastiskt endometrium jämförs med tät vävnad och nodulär cancertillväxt i livmodern i figur 8 och figur 9. Ultraljudet och grovbilderna överensstämde mycket med varandra för alla representerade möss. Figur 9 visar flera livmoderbilder från samma mus i en tidskursstudie och visar de morfologiska förändringar som observerats under 6 veckor när adenokarcinom utvecklades. Figur 5 visar ett ventralt tillvägagångssätt med tvärsnitt av livmoderhornen intill hypoekoblåsan.
För att förbättra kontrasten i buken förbättrade injektion av saltlösning i bukhålan direkt före avbildning visualiseringen av bukorganen, inklusive livmodern och äggstockarna. Figur 3 visar ultraljudsjämförelser från samma mus före och efter injektionen av 1 ml saltlösning. Med saltlösning fanns det ett ökat hypoekoiskt utrymme (svart) mellan organen som gjorde det möjligt för njure, fettkudde, äggstock, livmoderhorn, tarmar och mjälte att lättare individualiseras från varandra. I alla andra figurer som presenteras här gjordes saltlösningsinjektioner före avbildning för att förbättra bildens klarhet.
Sammantaget visar detta protokoll att denna inducerbara musmodell utvecklar adenokarcinom under en 6-veckorsperiod och kan övervakas med ultraljud för att upprätta en baslinje och observera morfologiska förändringar i livmodern när cancern utvecklas. Här visas att icke-invasivt ultraljud gör det möjligt för livmoderhornen i en mus att utvärderas seriellt under flera veckor med bilder som förutsäger de faktiska livmoderpatologiska förändringarna.
Figur 1: Strategi för generering av Pax8-Cre inducerbara dubbla KO-transgena möss. (A) Den konstitutiva produktionen av en omvänd tetracyklinkontrollerad transaktivator (rtTA) i Pax8-uttryckande livmoderepitelceller resulterar i inducerbar aktivering av Cre-rekombinas i närvaro av tetracyklin, eller dess analoga doxycyklin, genom bindning till tetracyklinresponselement (TRE). Flokplatser belägna uppströms och nedströms exon 8 (Arid1a) och exon 5 (Pten) är föremål för Cre-rekombinas. Cre-riktad radering av exon 8 i Arid1a resulterar i en frameshift-mutation och ett tidigt stoppkodon (s.Gly809Hisfs*6). Cre-riktad radering av exon 5 i Pten resulterar i en frameshift-mutation (s.Val85Glyfs*14). (B) Pax8-rtTA-musen uttrycker en omvänd tetracyklinkontrollerad transaktivator (rtTA) under kontroll av Pax8-promotorn. Denna mus korsas med TetO-Cre-musen som uttrycker Cre-rekombinas på ett tetracyklinberoende sätt. Avkomman från denna korsning uttrycker ett tetracyklinaktiverat Cre-rekombinas specifikt för Pax8-uttryckande livmoderepitelceller (Pax8-Cre-transaktivator). (C) Arid1a flox/flox-möss på 129S1-bakgrunden korsades med Pten-flox/flox-floken på BALB/C-bakgrunden (stam C;129S4-Ptentm1Hwu/J) för att generera Arid1a-flox/flox/Pten-flox/ flox-transrespondermusen. (D) Pax8-Cre-transaktivatormusen korsas med en Arid1a flox/flox/Ptenflox/flox Transresponder-mus. Avkomman från denna korsning resulterar i en transgen murin modell med en doxycyklininducerbar Arid1a och Pten-deletion (iPAD) specifik för livmoderepitelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förfarande vid avbildning . (A) En sövd mus med buk- och ryggpälsen avlägsnad med en klippare och hårborttagningskräm. Musen hålls på inhalationsmedel isoflurananestesi via en noskon och placeras på en värmedyna täckt med en absorberande dyna. (B) En liten mängd förvärmd ultraljudsgel placeras över det intressanta området på musen och på sonden. Här är musen i ventral liggande, och sonden är korrekt placerad för att lokalisera njuren, det anatomiska landmärket direkt kranialt till äggstocken. (C) I dorsal liggande kan sonden manipuleras manuellt för att först hitta landmärken som urinblåsan för att hitta den ungefärliga platsen för livmoderhornen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förbättrad synlighet och organdefinition genom injektion av saltlösning. (A) Bild av en njure och slingor i mag-tarmkanalen (nere till vänster) före IP-injektionen av 1,5 ml uppvärmd, steril saltlösning. Den vänstra sidan av bilden är kranial till njuren. (B) Bild av njuren efter saltlösningsinjektionen, som visar ökat (hypoekoiskt utrymme, svart) mellan organen. För båda bilderna, när det gäller orienteringen, är musen dorsal yta uppåt och kranial till caudal är vänster till höger. (C,D) Den markerade röda sektionen visar njurmärken i 2D-bilderna som presenteras i A och B. Bilderna togs med en MS550-givare. Skalstreck = 2 mm i varje bild. Förkortningar: GI kanal = mag-tarmkanalen; IP = intraperitoneal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Reproduktionsorgan med landmärken . (A) Äggstocken (pilen) ligger omedelbart kaudal till njurens kaudala pol. (B) Livmoderhornet (smal pil) är djupt och börjar kranialt till dorsala musklerna i den proximala bakbenet (pilspets), med äggstocken också i sikte (större pil). Skalstänger = 2 mm. För alla bilder, när det gäller orientering, är musen dorsal yta uppåt och kranial till caudal är vänster till höger. Bilderna togs med en MS550-givare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Livmoderhorn och urinblåsa avbildade från dorsal liggande. Ultraljudsbilder från två möss före cancerinduktion. (A) Blåsans lumen är synlig som en hypoekoisk, äggformad struktur med en hyperekoisk slemhinna. Båda livmoderhornen är synliga tillsammans, med gränserna för var och en spårad i ljusblått. (B) Samma vy i en annan mus med en mycket fylligare blåsa. För båda bilderna, när det gäller orientering, är musen ventral yta uppåt och bilden till vänster är musen kvar. Gränserna för varje livmoderhorn är ritade i ljusblått, med områden angivna i de närliggande textrutorna (MS550-givare). Skalstänger = 3 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Exempel på H&E och immunhistokemi av delar av livmodern 6 veckor efter induktion i en iPAD-mus. (A) Representativ H&E för iPAD-musens livmodervävnad. (B) Representativ ARID1a immunhistokemi. Färgningen visar en förlust av Arid1a som är specifik för kärnorna i Pax8-uttryckande livmoderepitelceller (svart pil), med retention av Arid1a i kärnorna i livmoderstromaceller (vit pil). c) Representativ pTEN-immunhistokemi. Färgningen visar en förlust av pTEN i cytoplasman hos Pax 8-uttryckande livmoderepitelceller (svart pil), med retention av pTEN i cytoplasman hos livmoderstromaceller (vit pil). Detaljerade IHC-metoder har tidigare publicerats14. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: iPAD = inducerbar Pten, Arid1a dubbel radering; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Exempel på ultraljudsbilder från möss med tidiga förändringar i patologi. (A,B) Antemortem ultraljudsbild av en livmoder fylld med livmodervätska som är naturligt hyperekoisk De smala pilarna indikerar livmoderns hypoekoiska, dilaterade lumen. Pilspetsen indikerar det förtjockade området på livmoderväggen. (C) Bruttobild av hela livmodern från musen avbildad i B. Den vita asterisken är ungefär på samma plats som den som avbildas i A. (D) I samma mus bearbetades livmodern och färgades med H&E. Histologisektionen visar förtjockning av livmoderväggen på grund av endometriehyperplasi; Exempelområdet indikeras med en pilspets. För alla amerikanska bilder, när det gäller orientering, är musen dorsal yta uppåt och kranial till caudal är vänster till höger (MS550-givare). Skalstänger = (A,B) 3 mm; d) 500 μm. Förkortningar: US = ultraljud; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Mångfald av livmoderpatologi synlig av ultraljud . (A) En livmoder med hyperplasi och vätskedistension som orsakar luminal dilatation till en diameter av ~ 2,5 mm. (B) En andra livmoder med hyperplasi som är utspänd i högre grad. (C) En livmoder som är både dilaterad och fylld med en mjukvävnadsmassa. Skalstänger = 3 mm. För alla bilder är pilarna på livmoderhornets ventrala sida, och när det gäller bildorienteringen är musen dorsal yta uppåt och kranial till caudal är vänster till höger (MS550-givare). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Förändringar i livmoderns neoplastiska utveckling över tid i en mus. (A) Ultraljudsbild av en iPAD-mus som visar njuren (bredare pil), äggstocken (kaudal till njure) och livmodern (smal pil), med benmuskeln också synlig (pilspets), fångad vid tre tidpunkter: efter att musen startades på en doxycyklindiet (vecka 0), och sedan igen efter 5 veckor och 6 veckor. Doxycyklin inducerade Cre-uttryck med tumörsuppressorförlust, vilket främjar endometriecancer över tiden. (B) Samma ultraljudsbilder som A men med livmoderhornet markerat i rött. (C) Bruttobilder av livmodern in situ (smal pil) från 6 veckors tidpunkt; Vävnaden ses från den ventrala ytan. (D) Samma livmoder som i C dissekerad ex vivo; Vävnaden ses från den ventrala ytan. (E) Histologi av livmodermassan (H&E-fläck), vilket indikerar adenokarcinom från detta exempel. För A och B, när det gäller orientering, är musen dorsal yta uppåt och kranial till caudal är vänster till höger (MS550-givare). Skalstreck = (A,B, de två första bilderna i varje rad) 1 mm; (A,B, tredje bilden) 2 mm; (E) 500 μm. Förkortningar: iPAD = inducerbar Pten, Arid1a dubbel radering; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll undersöker användbarheten av ultraljud för att bedöma livmodermorfologiska förändringar i progressionen av adenokarcinom i livmodern hos möss. I denna studie, genom att följa induktionen av endometriecancer hos möss i längdriktningen, visade sig de anatomiska detaljerna detekterade med ultraljud vara indikatorer på grov och histologisk patologi. Detta öppnar dörren för användning av longitudinella studier med mindre antal möss som övervakas med ultraljud vid flera tidpunkter för att följa utvecklingen av livmodercancer hos möss. Denna longitudinella detektion åstadkoms med hjälp av en handhållen sond och utan användning av ultraljudsutrustning för järnvägssystemet. De högfrekventa prober (givare) som används är allmänt tillgängliga, vilket gör detta tillvägagångssätt reproducerbart vid flera institutioner över hela världen. Kritiska steg i protokollet inkluderar att använda rätt sond för den upplösningsnivå som krävs för experimentet och förbereda musen för avbildning före ultraljudet.
Kritiska steg för att förbereda musen är att ta bort allt hår från studieområdena och injicera vätska i bukhålan. Päls kvar på huden kan leda till att bubblor fångas i ultraljudsgelen, vilket kan producera artefakter i bilderna; Därför bör man se till att ta bort håret jämnt över studieområdet. Hårborttagningskräm valdes som metod för hårborttagning eftersom den tar bort pälsen jämnt över huden. Skada på huden kan uppstå om krämen lämnas på huden under en alltför lång tid (>3-4 min). Hos möss som är mer känsliga för hårborttagningskräm bör krämen endast lämnas på huden i 1-2 minuter för att ta bort håret. Därefter ska musen torkas med en serie våta pappershanddukar för att helt ta bort grädden. När allt hår har tagits bort från studieområdet injiceras sterila, varma isotoniska vätskor i intraperitonealhålan för att öka kontrasten och hjälpa till att definiera gränserna för bukorganen. I denna studie var injektion av 1-2 ml vätska tillräcklig för att differentiera äggstocken, äggledaren och livmoderhornen. Vätskan absorberas gradvis, och det är bäst att injicera omedelbart före avbildning. Möss blir snabbt hypoterma under isoflurananestesi. Detta kan förhindras genom att injicera varm saltlösning (förvaras i sprutor på en värmedyna) och genom att även placera musen på en värmedyna och förvärma ultraljudsgelen när det är möjligt. Bildsessioner med erfarna sonografer körs vid 5-10 min / mus, och med denna korta tid inträffade inte signifikant hypotermi. Vid behov kan upp till ytterligare 2 ml saltlösning injiceras i buken för större separation av organen.
De metoder som beskrivs här är avsedda att vara lätt reproducerbara utan specialutrustning utöver ultraljudsmaskinen och sonden/sonderna. I den presenterade metoden manipuleras sonden manuellt hela tiden utan hjälp från ett järnvägssystem. Denna manuella metod är snabbare och ger stor flexibilitet i vinklarna och trycket som appliceras för att markera små funktioner. Manuell styrning av sonderna över buken och användning av givare med lägre upplösning kan begränsa kvaliteten på enskilda bilder som tas jämfört med bilder från en givare som är fäst på skensystemet4. Ett skensystem skulle vara användbart för injektioner i livmodern (i foster) eller intrakardiella injektioner när mer stabilitet behövs. Det finns dock en avvägning när det gäller minimal manipulationstid och ökad tillgänglighet för det stora utbudet av institutioner som saknar specialiserade ultraljudsanläggningar. Framgången med denna förenklade metod exemplifierar hur ultraljud kan användas för en rad studier. Den föreslagna metoden är väl lämpad för att fånga longitudinella vävnadsförändringar i livmodercancermodeller utan krav på dedikerad utrustning och kan tillämpas på andra progressiva sjukdomsmodeller. Manuell manipulation av mössen under avbildning kan öka variationen i exakt vävnadsdjup och plats, men för studier som inte förlitar sig på dessa faktorer är bildkvaliteten tillräcklig för att upptäcka patologiska förändringar.
Det är viktigt att spara videor under bildbehandling; Senare på användarens arbetsstation kan videorna stoppas vid vilken ram som helst som är representativ för anatomin som behöver fångas och mätas. Bilder av organen kan mätas (diameter, omkrets eller längd) (Figur 5, livmoderhornets tvärsnitt uppmätt) och tumörområdet kan beräknas. Videor, mer än enstaka ramar, underlättar identifieringen av organ i större anatomiska sammanhang. Videor är också användbara för att bestämma rörelsen i tunntarmen och tjocktarmen, vilket kan hjälpa till att skilja tarmarna från livmodern. Att få högkvalitativa bilder beror också på förtrogenhet med musanatomi. För att avbilda den rörliga livmodern jämfört med att avbilda mer stationära vävnader (t.ex. en implanterad xenografttumör, äggstockar), har den manuella metoden fördelen att skanna och följa livmoderhornen från proximal till distal. Under skanning kan gradvis justering av handvinklarna användas för att följa hornet. MS550-sonden användes för all avbildning i denna studie och är att föredra för livmodern jämfört med MS700-sonden med högre upplösning, vilket är bättre för äggstockarna. Arbete med MS700 för att avbilda mussköldkörteln har nyligen publicerats, vilket visar den höga upplösningen som är möjlig i andra vävnader15. Handhållen sondavbildning är till hjälp på grund av de varierande graderna av vävnadsdjup i livmodern mellan äggstocken och urinblåsan. I detta arbete hjälpte förflyttning mellan lätt igenkännliga anatomiska landmärken, såsom njuren och den proximala bakbensanatomin, att fånga jämförbara bilder över de olika tidpunkterna när man avbildar livmodern från dorsal aspekt på kroppen.
Denna högupplösta ultraljudsmetod för att följa de anatomiska förändringarna i livmodern över tid under tumörgenesen är överlägsen de nuvarande metoderna som involverar avlivning av djur från flera kohorter vid olika tidpunkter. Ultraljud förfinar modellen och minskar antalet möss som behövs för experimentet, vilket minskar kostnader och tid. Viktigt är att denna metod gör det möjligt att följa sjukdomsprogression på individnivå, vilket kan leda till insikter som maskeras i studier beroende på kohorter som offras efter tidpunkt snarare än sjukdomsstadium. På grund av sin icke-invasiva natur har ultraljud hos möss många potentiella tillämpningar för forskning inom livmoder- eller äggstockscancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för finansiering från NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, postdoktoralt utbildningsprogram 5T32OD011089 och Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Projektet finansierades också delvis av subventioner för löpande utgifter till privata institutioner för högre utbildning från Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
