Summary
该协议描述了一种使用与大体和组织学变化相关的超声成像在子宫内膜癌诱导小鼠模型中监测子宫中形态变化随时间进展的方法。
Abstract
由于这些模型中易于处理和遗传操作，可以在小鼠中研究子宫癌。然而，这些研究通常仅限于评估在不同队列的多个时间点安乐死的动物的病理学死后，这增加了研究所需的小鼠数量。纵向研究中的小鼠成像可以跟踪个体动物的疾病进展，减少所需的小鼠数量。超声技术的进步使得检测组织中的微米级变化成为可能。超声已被用于研究卵巢中的卵泡成熟和异种移植物的生长，但尚未应用于小鼠子宫的形态变化。该协议检查了诱导子宫内膜癌小鼠模型中病理学与 体内 成像比较的并置。超声观察到的特征与大体病理学和组织学观察到的变化程度一致。发现超声波对观察到的病理具有高度预测性，支持将超声检查纳入子宫疾病（如小鼠癌症）的纵向研究中。
Introduction
小鼠仍然是生殖疾病最重要的动物模型之一1，2，3。卵巢癌和子宫癌有几种转基因或诱导的啮齿动物模型。这些研究通常依赖于在不同时间点安乐死的多个队列来捕捉形态和病理变化的纵向趋势。这阻止了在单个小鼠中获取有关癌症发展的连续数据的能力。此外，在不知道个体小鼠疾病进展状态的情况下，干预研究基于预定的时间点和先前队列的平均结果，而不是检测特定动物进展的个体阈值4，5。因此，需要允许对活体动物进行纵向评估的成像方法，以促进用于测试新药或化合物的临床前模型，并加速对病理生物学的理解，同时提高严谨性和可重复性6。
超声成像（US）是纵向监测小鼠子宫癌进展的一种有吸引力的方法，因为与其他成像方法相比，它相对简单且便宜，易于执行，并且可以具有显着的分辨率6，7。这种非侵入性方式可以在清醒小鼠或短暂镇静下的小鼠中使用5-10分钟的检查捕获微米级的特征。超声显微镜已被验证为测量小鼠卵巢卵泡发育8和植入或诱导的肿瘤生长的方法9，10，11。高频US也被用于经皮宫内注射12和观察大鼠子宫在发情周期的变化13。高频US可用于固定在专用固定平台上的小鼠，使用导轨系统固定换能器/探头，以捕获具有标准化位置和压力的高分辨率图像;但是，并非所有机构都提供此设备。手持式换能器扫描方法可以采用较少的专用设备，并用于小鼠的临床诊断和研究应用。
问题仍然是，使用手持式高频探头进行美国成像是否可以用于监测数周的子宫癌发展。与肠道类似，啮齿动物子宫是一种薄壁细长的结构，在腹部内非常移动，并且通过多个组织深度连续，这使得成像比相对不动的器官（如肾脏）更具挑战性。本研究旨在建立超声观察到的组织与组织病理学之间的相关性，确定定位小鼠子宫的标志，并确定子宫内膜癌纵向评估的可行性。这项研究提供的数据显示了US成像的子宫外观与组织病理学之间的定性对应关系，以及小鼠在几周内的连续成像。这些结果表明，手持式US可用于监测小鼠子宫内膜癌的发展，从而为收集单个小鼠纵向数据以研究子宫癌创造了机会，而无需专用设备。
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Protocol
所有涉及小鼠的程序和实验均按照约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。对于所有程序，都穿着适当的个人防护装备，包括手套和一次性隔离衣。处理锐器时采取了预防措施，使用后立即妥善处理在红箱锐器容器中。有关本协议中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1.用多西环素诱导iPAD小鼠（诱导 Pten，Arid1a 双缺失）子宫内膜癌
- 在混合遗传背景（129S，BALB / C，C57BL / 6）上维持10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten双缺失（iPAD）转基因小鼠（图1），如前所述14。
- 在多西环素治疗之前收集每只小鼠的卵巢、输卵管和子宫的基线超声 （2D） 图像。
- 从7-8周龄开始，向雌性iPAD小鼠提供仅含多西环素的小鼠食物日粮（625mg / kg饲料的盐酸多西环素）至少2周，以诱导基因缺失。
2. 设备设置
- 打开加热垫，并盖上干净的吸收垫（目标温度：38°C）。
- 确认异氟醚蒸发器和O2 罐已充分填充。如果内容物不足，请重新填充并更换。
- 将感应室、鼻锥和清除系统连接到蒸发器。
- 设置超声波机器。
- 选择范围为 32-56 MHz 或高达 70 MHz 的换能器（探头）分别用于子宫或卵巢成像。
- 连接探头，然后打开机器电源。
- 系统启动后，使用控制面板使用用户凭据登录并访问主屏幕。
- 在主屏幕中，转到 “应用程序 ”选项卡，然后选择 “鼠标（小）腹部模式”。
- 单击 扫描 返回主屏幕，然后等待显示实时图像。
- 从左侧工具栏上的选项中选择 B 模式。
- 单击 “更多控件 ”以查看用于图像细化的其他工具，例如图像增益和深度，或调整剪辑采集设置（例如每秒帧数）。
- 选择图像设置后，单击“ 扫描”返回主屏幕。
- 打开 O2 罐，将流量引导至感应室，并将流速设置为 1 L/min。
3.准备小鼠进行超声筛查，包括脱毛
- 将鼠标放在感应室中。将异氟醚蒸发器设置为2%-3%体积/体积以诱导麻醉。
- 通过对脚趾夹伤缺乏反应和呼吸频率约为 1-2 次呼吸/秒来确定适当的麻醉深度。
- 在每只眼睛上涂抹无菌眼科润滑剂。用适当大小的剪刀从最后一根肋骨和骨盆之间的背部和腹侧去除皮毛。
- 在要成像的腹侧和背部区域涂上一层薄薄的脱毛膏（如果需要）。
- 将鼠标放回诱导室约3-5分钟，以保持适当的麻醉深度，同时脱毛膏去除毛发。≤4分钟后，用干净的湿纸巾轻轻擦去面霜。
注意：长时间接触脱毛膏具有刺激性，并可能导致皮肤损伤。
4.腹腔注射液体以增加器官之间的对比度
- 将装有无菌等渗液体溶液（例如无菌 0.9% NaCl 或乳酸环状动脉瓣溶液）的 3-10 mL 注射器加热至 35-40 °C，将其置于加热垫和吸收垫之间几分钟。如果机器没有加热器，请将一瓶超声波凝胶放在加热垫上。
- 对于20-25g小鼠，将1-2mL溶液注入腹膜腔。
- 一只手抓住鼠标的肋骨，露出腹侧。
- 以~20°角握住鼠标，鼻子指向地板，以由于重力而颅骨地引导器官。
- 使用小规格针（25 G，5/8 英寸长，结核菌素注射器），穿刺腹部尾部右象限的皮肤和腹壁。
- 在注射液体之前，为避免注射到脉管系统或胃肠道，请以最小的压力拉回。如果血液或其他物质进入注射器，请取出针头。使用新的针头和注射器，然后在稍微不同的位置重试。
- 如果小鼠在注射过程中醒来，将其放回小诱导室中，用2%-3%vol/vol异氟醚麻醉。
5. 背侧入路超声成像
- 将鼠标置于加热垫上的吸收垫上的腹侧卧位（图2A-C）。
- 将啮齿动物鼻锥牢固地放在老鼠的鼻子和口吻上。用异氟醚在100%O 2中以1%-2%体积/体积通过鼻锥输送保持麻醉深度。根据需要在每只眼睛上涂抹无菌眼科润滑剂。
- 监测小鼠的正常呼吸频率（1-2 / s）和缺乏脚趾捏反应，以指示是否需要调整麻醉。
- 将少量（~0.5-1mL）预热的超声凝胶远轴（侧向）放在麻醉小鼠两侧的脊柱上，在最后一根肋骨和骨盆之间。
- 将少量凝胶放在超声探头上。
- 将探头平行于椎骨放置，探头的前部位于颅侧。探头上有一个指示标记，用于指示正确的探头方向。记录正在收集的每组新图像的日期、时间、动物 ID、探头方向和动物侧（右、左、背、腹）。
- 将小鼠置于腹侧卧位（背部皮肤接触探头），缓慢扫描肾脏标志的区域（图2B和图3）。在看到肾脏的情况下，拉动探头尾部以找到卵巢 - 一个非常高回声的卵巢脂肪垫内的轻微高回声椭圆形到圆形结构（图4A，B），该脂肪垫在颅腹侧与肾脏接壤，背侧与背腹壁接壤。
注意：尾部和卵巢外侧的压力可以使卵巢更靠近腹壁并远离肠袢。卵巢在解剖学上靠腹背壁，仅靠腹肌和外侧至外周肌，尾部至肾脏。 - 使用控制屏幕底部的滑块调整 信号增益 以提高图像对比度。
- 为了改善肾脏的成像，用手指对对侧腹部施加压力。改变压力和角度，从直接平行于脊柱到~20°腹侧。
- 查看感兴趣的器官后，通过单击“ 保存剪辑 ”或 “开始 录制”来收集视频，然后单击“完成后 停止录制 ”以将图像保留在预设的帧数上。
- 使用“保存帧”按钮保存实时图像或录制中的单个 帧 。
- 要对子宫进行成像，请向尾部拉动探头，直到卵巢位于视野的最颅面。改变探头压力和角度，直到子宫在视野中。
- 对每个感兴趣的器官重复视频和帧收集。
- 找到沿着背腹壁纵向运行的子宫，腿部外侧肌肉组织也在视野中（图4B）。
注意：子宫大小和管腔直径可能随发情期和疾病状态而变化。 - 监测组织的蠕动运动，以区分肠袢和子宫固定角。
6. 从腹侧方法收集图像
- 将鼠标放在背卧中，并检查眼睛润滑是否充分并且枪口牢固地位于鼻锥中（图2A）。
- 将少量（~0.5-1 mL）预热的超声凝胶涂在腹腹上，并将探头涂在耻骨颅骨的中线，以将膀胱定位为低回声标志（图5）。
注意：如果膀胱太大并且模糊了子宫成像，则可以在下腹部轻轻按压以挤出尿液。 - 将探头拉向膀胱侧面以找到子宫角。从鼠标的一侧或两侧施加轻微的数字压力，使喇叭进入视野。垂直于鼠标握住探头，扫描腹部两侧以捕获两个角的横向视图（横截面）。旋转探头以捕获矢状视图。
- 超声波检查后，用纸巾将鼠标擦拭干净凝胶，然后将其放回笼子中恢复。小鼠在2-5分钟内完全清醒。一旦它完全清醒并走动，将鼠标送回动物室。
注意：可以在笼子下面放置一个低火加热垫，以加热笼子以进行恢复。 - 在实验或人道终点，对小鼠实施安乐死。理想情况下，对家中笼子中的小鼠实施安乐死以减轻压力;或者，将鼠标放在干净的房间中。以每分钟腔室体积的 10%-30% 的置换率输送加压的 CO2 。在无可见呼吸约 5 分钟后，确认颈椎脱位死亡。进行腹部尸检以收获肿瘤。
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Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten 双缺失 （iPAD） 转基因小鼠维持在混合遗传背景 （129S， BALB/C， C57BL/6） 上，如前所述14.小鼠均饲喂多西环素饲料2周以诱导Cre重组酶。在我们小组以前的工作中，多西环素通过管饲法给药14;然而，在目前的研究中，多西环素饲料诱导方法有效地工作并降低了小鼠的管饲压力。重要的是要检查多西环素给药方法是否足以诱导Cre重组酶表达，以切除Pax8表达细胞（如子宫）中肿瘤抑制因子（Arid1a和Pten）的DNA。使用针对ARID1a和pTEN14的抗体进行免疫组织化学，以检查与邻近基质组织相比，子宫上皮细胞中是否实现了足够的肿瘤抑制蛋白损失，如图6所示。小鼠模型和肿瘤抑制表达调控的示意图如图1所示。
多西环素给药2周后，与对照组或多西环素给药前成像的相同小鼠相比，子宫大小没有显着变化。然而，在多西环素治疗后的2-6周内，超声显示小鼠出现了一系列子宫病变，从增生开始，发展为腺癌。图7A，B描绘了多西环素治疗3周后观察到早期病理变化的小鼠子宫的美国图像。图7C，D显示了图7A，B中成像的同一子宫的大体病理学和组织病理学，小鼠在3周成像后立即被安乐死。可以观察到较小（但扩张）的薄壁子宫和早期子宫内膜增生，保留明显的腔（中央高回声子宫液）。在较晚的时间点安乐死的小鼠中，子宫要大得多，管腔较小，壁厚（图8和图9）。将扩张的管腔和增生性子宫内膜的细微变化的例子与图8和图9中的子宫致密组织和结节癌生长进行比较。对于所有代表的小鼠，超声和大体图像彼此高度一致。图9显示了在时程研究中来自同一只小鼠的多个子宫图像，并展示了随着腺癌的发展，在6周内观察到的形态变化。图5显示了子宫角横截面与低回声膀胱相邻的腹侧入路。
为了增强腹部的对比度，在成像前直接将盐水注入腹腔改善了腹部器官（包括子宫和卵巢）的可视化。 图3 显示了同一小鼠在注射1mL盐水前后的超声比较。使用生理盐水时，器官之间的低回声空间（黑色）增加，使肾脏、脂肪垫、卵巢、子宫角、肠道和脾脏更容易彼此个体化。在这里介绍的所有其他图中，盐水注射是在成像前完成的，以提高图像清晰度。
综上所述，该协议表明，这种诱导小鼠模型在6周内发展为腺癌，并且可以通过超声监测以建立基线并随着癌症的发展观察子宫的形态变化。在这里，证明非侵入性超声允许在数周内连续评估小鼠的子宫角，图像可预测实际的子宫病理变化。
图1：Pax8-Cre诱导型双KO转基因小鼠的生成策略。 （A）在表达Pax8的子宫上皮细胞中产生反四环素控制的反式活化剂（rtTA）导致在四环素或其类似物多西环素存在下通过与四环素反应元件（TRE）结合诱导Cre重组酶的活化。位于外显子8（Arid1a）和外显子5（Pten）上游和下游的Flox位点被Cre重组酶靶向。Arid1a中外显子8的Cre靶向缺失导致移码突变和早期终止密码子（p.Gly809Hisfs*6）。Pten 中外显子 5 的 cre 靶向缺失导致移码突变 （p.Val85Glyfs*14）。（B）Pax8-rtTA小鼠在Pax8启动子的控制下表达反向四环素控制的反式激活剂（rtTA）。该小鼠与以四环素依赖性方式表达Cre重组酶的TetO-Cre小鼠杂交。来自该杂交的后代表达Pax8的子宫上皮细胞（Pax8-Cre反式激活剂）特异性的四环素（或多西环素）激活的Cre重组酶。（C）将129S1背景上的Arid1a flox/flox小鼠与BALB/C背景上的Pten flox/flox杂交（菌株C;129S4-Ptentm1Hwu/J），以产生Arid1a flox/flox/Pten flox/flox应答小鼠。（D）Pax8-Cre反式激活小鼠与Arid1a flox/flox/Pten flox/flox Transresponder小鼠杂交。来自这种杂交的后代导致具有强力霉素诱导的子宫上皮细胞特异性Arid1a和Pten缺失（iPAD）的转基因小鼠模型。请点击此处查看此图的大图。
图2：成像程序 。 （A）用剪刀和脱毛膏去除腹部和背毛的麻醉小鼠。通过鼻锥 将 小鼠维持在吸入剂异氟醚麻醉下，并放置在覆盖有吸收垫的加热垫上。（B）将少量预热的超声凝胶放置在小鼠和探针上的感兴趣区域上。在这里，小鼠处于腹侧卧位，并且探头正确放置以定位肾脏，即直接颅骨到卵巢的解剖标志。（C）在背卧中，可以手动操纵探头首先找到膀胱等地标，以便找到子宫角的大致位置。 请点击此处查看此图的大图。
图3：通过注射生理盐水改善能见度和器官定义 。 （A） 腹腔注射 1.5 mL 温热的无菌盐水之前的肾脏和胃肠道环（左下）的图像。图像的左侧位于肾脏的颅骨。（B）盐水注射后肾脏的图像，显示器官之间增加（低回声空间，黑色）。对于这两个图像，就方向而言，鼠标是背表面向上的，颅到尾的是从左到右的。（中，四）突出显示的红色部分显示了 A 和 B 中显示的 2D 图像中的肾脏标志物。图像是使用MS550传感器拍摄的。比例尺 = 每个图像中的 2 毫米。缩写：胃肠道=胃肠道;IP = 腹膜内。 请点击此处查看此图的大图。
图4：带有地标的生殖道 。 （A）卵巢（箭头）位于肾脏的尾部到尾部。（B）子宫角（窄箭头）很深，从颅骨到近端后肢（箭头）的背肌开始，卵巢也在视野中（较大的箭头）。比例尺 = 2 毫米。对于所有图像，就方向而言，鼠标是背表面向上的，颅到尾的是从左到右的。图像是使用MS550传感器拍摄的。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：从背卧位成像的子宫角和膀胱。 癌症诱导前两只小鼠的超声图像。（A）膀胱腔可见为低回声卵形结构，伴有高回声黏膜。两个子宫角一起可见，每个子宫角的边界都以浅蓝色描绘。（B）在另一只膀胱更饱满的小鼠中也有同样的观点。对于这两个图像，就方向而言，鼠标是腹面向上的，左边的图像是左边的鼠标。每个子宫角的边界以浅蓝色绘制，相邻文本框（MS550换能器）中给出区域。比例尺 = 3 mm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：iPAD小鼠诱导后6周子宫切片的H&E和免疫组织化学示例。 （A）iPAD小鼠子宫组织的代表性H&E。（B）具有代表性的ARID1a免疫组织化学。染色显示表达Pax8的子宫上皮细胞核特异性Arid1a丢失（黑色箭头），Arid1a保留在子宫基质细胞核中（白色箭头）。（C）具有代表性的pTEN免疫组织化学。染色显示表达Pax 8的子宫上皮细胞的细胞质中pTEN丢失（黑色箭头），pTEN保留在子宫基质细胞的细胞质中（白色箭头）。详细的IHC方法已发表14。比例尺 = 100 μm。缩写：iPAD = 诱导 Pten，Arid1a 双重删除;H&E = 苏木精和伊红。请点击此处查看此图的大图。
图7：来自具有早期病理变化的小鼠的超声图像示例 。 （A，B）充满自然高回声子宫液的子宫的生前超声图像 窄箭头表示子宫腔低回声、扩张。箭头表示子宫壁的增厚区域。（C） B中成像的小鼠整个子宫的粗略图像。白色星号与 A中成像的位置大致相同。（D）在同一只小鼠中，对子宫进行处理并用H&E染色。组织学切片显示子宫壁增厚，子宫内膜增生;示例区域用箭头表示。对于所有美国图像，就方向而言，鼠标的背面朝上，颅骨到尾部从左到右（MS550换能器）。比例尺 = （A，B） 3 毫米;（D） 500 微米。缩写：US = 超声波;H&E = 苏木精和伊红。 请点击此处查看此图的大图。
图8：超声可见的子宫病理多样性 。 （A）子宫增生和液体膨胀导致管腔扩张至~2.5mm直径。 （B）第二个子宫增生，扩张程度更大。（C）扩张并充满软组织肿块的子宫。比例尺 = 3 毫米。对于所有图像，箭头位于子宫角的腹侧，就图像方向而言，鼠标的背面朝上，颅尾从左到右（MS550换能器）。 请点击此处查看此图的大图。
图9：一只小鼠子宫肿瘤发展随时间的变化。 （A）iPAD鼠标的超声图像显示肾脏（较宽的箭头），卵巢（尾部到肾脏）和子宫（窄箭头），腿部肌肉也可见（箭头），在三个时间点捕获： 小鼠开始多西环素饮食后（第 0 周）， 然后在 5 周和 6 周后再次出现。多西环素诱导Cre表达伴肿瘤抑制因子丢失，随着时间的推移促进子宫内膜癌。（B）与 A 相同的超声图像，但子宫角以红色突出显示。（C）来自6周时间点的子宫 原位 （窄箭头）的大体图像;从腹面观察组织。（D）与 C 中相同的子宫离 体解剖;从腹面观察组织。（E）子宫肿块的组织学（H&E染色），表明本例中的腺癌。对于 A 和 B，就方向而言，鼠标的背面朝上，颅骨到尾部从左到右（MS550换能器）。比例尺 =（A，B，每行前两个图像）1 毫米;（A，B，第三张图片）2毫米;（E） 500微米。缩写：iPAD = 诱导 Pten，Arid1a 双重删除;H&E = 苏木精和伊红。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议检查了超声在评估小鼠子宫腺癌进展中的子宫形态变化的效用。在这项研究中，通过纵向跟踪小鼠子宫内膜癌的诱导，发现超声检测到的解剖细节是大体和组织病理学的指标。这为使用纵向研究打开了大门，在多个时间点通过超声监测较少数量的小鼠来跟踪小鼠子宫癌的进展。这种纵向检测是通过使用手持式探头完成的，无需使用轨道系统超声设备。使用的高频探头（换能器）广泛使用，使这种方法在全球多个机构中可重复使用。协议中的关键步骤包括使用正确的探针来达到实验所需的分辨率水平，并在超声之前准备小鼠进行成像。
准备小鼠的关键步骤是从研究区域去除所有毛发并将液体注入腹膜腔。留在皮肤上的皮毛会导致超声波凝胶中的气泡被捕获，从而在图像中产生伪影;因此，应注意在研究区域均匀地去除毛发。脱毛膏被选为脱毛的方法，因为它可以均匀地去除皮肤上的皮毛。如果乳霜在皮肤上停留时间过长（>3-4分钟），可能会对皮肤造成伤害。在对脱毛膏更敏感的小鼠中，乳膏只应在皮肤上停留1-2分钟以去除毛发。接下来，应用一系列湿纸巾擦拭鼠标以完全去除奶油。从研究区域去除所有毛发后，将无菌、温暖的等渗液体注入腹膜腔以增加对比度并有助于确定腹部器官的边界。在这项研究中，注射 1-2 mL 液体足以区分卵巢、输卵管和子宫角。液体逐渐吸收，最好在成像前立即注射。小鼠在异氟醚麻醉下迅速体温过低。这可以通过注射温盐水（储存在加热垫上的注射器中）以及将鼠标放在加热垫上并在可能的情况下预热超声凝胶来预防。与经验丰富的超声医师进行的成像会议以5-10分钟/小鼠的速度进行，并且在这么短的时间内，没有发生明显的体温过低。如果需要，可以将多达 2 mL 的盐水注射到腹部，以更好地分离器官。
此处描述的方法旨在易于重现，而无需超声机器和探头以外的专用设备。在所提出的方法中，探头在整个过程中都是手动操作的，而无需轨道系统的帮助。这种手动方法速度更快，并且在突出小特征的角度和压力方面提供了极大的灵活性。与固定在轨道系统上的换能器相比，手动将探头对准腹部并使用低分辨率换能器可能会限制所获取的任何单个图像的质量4。当需要更稳定时，轨道系统对于注射到子宫（胎儿）或心内注射很有用。然而，对于缺乏专业超声设施的广泛机构来说，在最短的操作时间和增加可及性方面存在权衡。这种简化方法的成功说明了如何将超声波用于一系列研究。所提出的方法非常适合捕获子宫癌模型中的纵向组织变化，而无需专用设备，并且可以应用于其他进行性疾病模型。在成像过程中手动操作小鼠可以增加确切组织深度和位置的变异性，但对于不依赖这些因素的研究，图像质量足以检测病理变化。
在成像过程中保存视频很重要;稍后在用户的工作站上，视频可以停止在代表需要捕获和测量的解剖结构的任何帧上。可以测量器官的图像（直径，周长或长度）（图5，测量子宫角横截面），并且可以计算肿瘤面积。视频比单帧更有助于在更大的解剖学背景下识别器官。视频对于确定小肠和大肠的运动也很有用，这有助于区分肠道和子宫。获得高质量的图像还取决于对小鼠解剖结构的熟悉程度。对于可移动子宫的成像与成像更多的静止组织（例如，植入的异种移植肿瘤，卵巢）相比，使用手动方法具有从近端到远端扫描和跟踪子宫角的优点。在扫描过程中，可以使用手部角度的逐渐调整来跟随喇叭。MS550探头用于本研究中的所有成像，与更高分辨率的MS700探头相比，MS550探头更适合子宫，后者对卵巢更好。最近发表了使用MS700对小鼠甲状腺进行成像的工作，展示了在其他组织中可能的高分辨率15。手持式探头成像很有帮助，因为卵巢和膀胱之间的子宫组织深度不同。在这项工作中，在易于识别的解剖标志（例如肾脏和近端后肢解剖结构）之间移动，有助于在从身体背面对子宫进行成像时捕获不同时间点的可比较图像。
这种高分辨率超声方法可以跟踪肿瘤发生过程中子宫随时间推移的解剖学变化，优于目前涉及在不同时间点对来自多个队列的动物实施安乐死的方法。超声波改进了模型并减少了实验所需的小鼠数量，从而降低了成本和时间。重要的是，这种方法允许在个体水平上跟踪疾病进展，这可能会导致在依赖于按时间点而不是疾病阶段牺牲的队列的研究中被掩盖的见解。由于其非侵入性，小鼠超声在子宫癌或卵巢癌的研究中具有许多潜在的应用。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢NCI卵巢癌孢子计划P50CA228991，博士后培训计划5T32OD011089和约翰霍普金斯大学Richard W. TeLinde捐赠基金的资助。该项目的部分资金还来自日本私立学校促进和互助公司对私立高等教育机构的经常性支出补贴。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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