Summary
Este protocolo describe un método para monitorear la progresión de los cambios morfológicos a lo largo del tiempo en el útero en un modelo de ratón inducible de cáncer de endometrio utilizando imágenes de ultrasonido con correlación con cambios macroscópicos e histológicos.
Abstract
Los cánceres uterinos se pueden estudiar en ratones debido a la facilidad de manejo y manipulación genética en estos modelos. Sin embargo, estos estudios a menudo se limitan a evaluar la patología post mortem en animales sacrificados en múltiples puntos de tiempo en diferentes cohortes, lo que aumenta el número de ratones necesarios para un estudio. Las imágenes de ratones en estudios longitudinales pueden rastrear la progresión de la enfermedad en animales individuales, reduciendo el número de ratones necesarios. Los avances en la tecnología de ultrasonido han permitido la detección de cambios a nivel micrométrico en los tejidos. El ultrasonido se ha utilizado para estudiar la maduración del folículo en los ovarios y el crecimiento del xenoinjerto, pero no se ha aplicado a los cambios morfológicos en el útero del ratón. Este protocolo examina la yuxtaposición de la patología con comparaciones de imágenes in vivo en un modelo de ratón con cáncer de endometrio inducido. Las características observadas por ultrasonido fueron consistentes con el grado de cambio observado por patología macroscópica e histología. Se encontró que el ultrasonido era altamente predictivo de la patología observada, apoyando la incorporación de la ecografía en estudios longitudinales de enfermedades uterinas como el cáncer en ratones.
Introduction
Los ratones siguen siendo uno de los modelos animales más importantes para los trastornos reproductivos 1,2,3. Hay varios modelos de roedores genéticamente modificados o inducidos de cáncer de ovario y útero. Estos estudios generalmente se basan en múltiples cohortes sacrificadas en diferentes puntos de tiempo para capturar tendencias longitudinales en cambios morfológicos y patológicos. Esto impide la capacidad de adquirir datos continuos sobre el desarrollo del cáncer en un ratón individual. Además, sin conocer el estado de progresión de la enfermedad individual en ratones, los estudios de intervención se basan en puntos de tiempo predeterminados y hallazgos promediados de cohortes anteriores en lugar de umbrales individuales para la detección de progresión en un animal específico 4,5. Por lo tanto, los enfoques de imagen que permiten la evaluación longitudinal en animales vivos son necesarios para facilitar los modelos preclínicos para probar nuevos fármacos o compuestos y acelerar la comprensión de la patobiología, al tiempo que aumentan el rigor y la reproducibilidad6.
La ecografía (ecografía) es un método atractivo para la monitorización longitudinal de la progresión del cáncer uterino de ratón porque es relativamente fácil y económico en comparación con otros métodos de imagen, es fácil de realizar y puede tener una resolución notable 6,7. Esta modalidad no invasiva puede capturar características a escala de micras en ratones despiertos o con ratones bajo sedación breve mediante un examen de 5-10 minutos. La microscopía ecográfica ha sido validada como un método para medir el desarrollo del folículo ovárico de ratón 8 y el crecimiento de neoplasia implantada o inducida 9,10,11. La ecografía de alta frecuencia también se ha utilizado para inyecciones intrauterinas percutáneas12 y para observar el cambio uterino de ratas durante el ciclo estral13. La US de alta frecuencia se puede utilizar con ratones sostenidos en plataformas estacionarias especializadas utilizando un sistema de rieles para sostener el transductor / sonda para capturar imágenes de alta resolución con posición y presión estandarizadas; Sin embargo, este equipo no está disponible en todas las instituciones. Los métodos de escaneo de transductores de mano se pueden adoptar con equipos menos dedicados y se pueden usar tanto para diagnósticos clínicos como para aplicaciones de investigación en ratones.
La pregunta sigue siendo si las imágenes estadounidenses con sondas portátiles de alta frecuencia podrían usarse para monitorear el desarrollo del cáncer uterino durante varias semanas. Similar a los intestinos, el útero de roedores es una estructura delgada y de paredes delgadas que es muy móvil dentro del abdomen y es contigua a través de múltiples profundidades de tejido, lo que hace que las imágenes sean más difíciles que con órganos relativamente inmóviles como los riñones. Este estudio buscó establecer la correlación entre los tejidos observados por ultrasonido e histopatología, definir puntos de referencia para localizar el útero de ratón y determinar la viabilidad de la evaluación longitudinal del cáncer de endometrio. Este estudio presenta datos que muestran una correspondencia cualitativa entre la aparición de úteros fotografiados por US y la histopatología, así como imágenes seriadas de ratones durante varias semanas. Estos resultados indican que la ecografía portátil se puede utilizar para monitorear el desarrollo del cáncer de endometrio en ratones, creando así una oportunidad para recopilar datos longitudinales individuales de ratón para estudiar el cáncer uterino sin la necesidad de equipos dedicados.
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Protocol
Todos los procedimientos y experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. Para todos los procedimientos, se usó EPP apropiado, incluidos guantes y batas de aislamiento desechables. Se tomaron precauciones al manipular objetos punzantes, que se desecharon adecuadamente en contenedores de objetos punzantes de caja roja inmediatamente después de su uso. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Inducción de cáncer de endometrio en ratones iPAD (Pten inducible , Arid1a doble deleción) con doxiciclina
- Mantener 10 ratones transgénicos de doble deleción Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) (Figura 1) sobre un fondo genético mixto (129S, BALB/C, C57BL/6), como se describió anteriormente14.
- Recopile imágenes de ultrasonido de referencia (2D) de los ovarios, el oviducto y el útero de cada ratón antes del tratamiento con doxiciclina.
- Proporcionar exclusivamente dietas de comida de ratón que contengan doxiciclina (hiclato de doxiciclina a 625 mg / kg de alimento) a los ratones iPAD hembra durante un mínimo de 2 semanas a partir de las 7-8 semanas de edad para inducir la eliminación del gen.
2. Configuración del equipo
- Encienda la almohadilla térmica y cúbrala con una almohadilla absorbente limpia (temperatura objetivo: 38 °C).
- Confirme que el vaporizador de isoflurano y el tanque deO2 estén adecuadamente llenos. Rellene y reemplace si el contenido es bajo.
- Conecte la cámara de inducción, el cono nasal y el sistema de barrido al vaporizador.
- Configure la máquina de ultrasonido.
- Seleccione un transductor (sonda) con un rango de 32-56 MHz o hasta 70 MHz para obtener imágenes del útero o el ovario, respectivamente.
- Conecte la sonda y encienda la máquina.
- Después del arranque del sistema, utilice el panel de control para iniciar sesión con las credenciales de usuario y acceder a la pantalla de inicio.
- En la pantalla de inicio, vaya a la pestaña Aplicaciones y seleccione Modo de abdomen del ratón (pequeño).
- Haga clic en Escanear para volver a la pantalla de inicio y espere a que se muestre una imagen en vivo.
- Seleccione B-Mode en las opciones de la barra de herramientas izquierda.
- Haga clic en Más controles para ver herramientas adicionales para el refinamiento de la imagen, como la ganancia y la profundidad de la imagen, o para ajustar la configuración de adquisición de clips, como el número de fotogramas por segundo.
- Una vez que se selecciona la configuración de la imagen, vuelva a la pantalla de inicio haciendo clic en Escanear.
- Encienda el tanque deO2 , dirija el flujo a la cámara de inducción y ajuste el caudal a 1 L / min.
3. Preparación de ratones para el examen de ultrasonido, incluida la depilación
- Coloque un ratón en la cámara de inducción. Ajuste el vaporizador de isoflurano a 2% -3% vol/vol para la inducción de la anestesia.
- Determine la profundidad apropiada de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y una frecuencia respiratoria de alrededor de 1-2 respiraciones / s.
- Aplique lubricante oftálmico estéril en cada ojo. Retire el pelaje del dorso y el ventro entre la última costilla y la pelvis con cortapelos del tamaño adecuado.
- Aplique una capa delgada de crema depilatoria en las regiones ventral y dorsal para obtener imágenes (si es necesario).
- Coloque el ratón de nuevo en la cámara de inducción durante aproximadamente 3-5 minutos para mantener la profundidad adecuada de la anestesia mientras la crema depilatoria trabaja para eliminar el vello. Después de ≤4 minutos, limpie suavemente la crema con una toalla de papel húmeda y limpia.
NOTA: La exposición prolongada a la crema depilatoria es irritante y puede causar lesiones en la piel.
4. Inyección intraperitoneal de líquido para aumentar el contraste entre órganos
- Caliente una jeringa de 3-10 ml llena de solución fluida isotónica estéril (por ejemplo, solución estéril de NaCl al 0,9% o Ringers lactato) a 35-40 °C colocándola entre una almohadilla térmica y una almohadilla absorbente durante varios minutos. Coloque una botella de gel de ultrasonido en la almohadilla térmica si la máquina no tiene un calentador.
- Para un ratón de 20-25 g, inyecte 1-2 ml de solución en la cavidad peritoneal.
- Asegure el mouse con la espuma en una mano, exponiendo el ventrum.
- Sostenga el ratón en un ángulo de ~ 20 °, con la nariz apuntando al suelo para dirigir los órganos cranealmente debido a la gravedad.
- Con una aguja de calibre pequeño (25 G, 5/8 de longitud, jeringa de tuberculina), punción a través de la piel y la pared abdominal del cuadrante caudal derecho del abdomen.
- Antes de la inyección de líquidos, para evitar la inyección en la vasculatura o el tracto gastrointestinal, tire hacia atrás con una presión mínima. Si entra sangre u otro material en la jeringa, retire la aguja. Use una aguja y una jeringa nuevas, y vuelva a intentarlo en una posición ligeramente diferente.
- Si el ratón se despierta durante las inyecciones, colóquelo de nuevo en la pequeña cámara de inducción para anestesia con 2% -3% vol/vol isoflurano.
5. Imágenes ecográficas desde un enfoque dorsal
- Coloque el ratón en reclinación ventral sobre la almohadilla absorbente sobre una almohadilla térmica (Figura 2A-C).
- Coloque un cono de nariz de roedor de forma segura sobre la nariz y el hocico del ratón. Mantener la profundidad anestésica con isoflurano administrado a través del cono nasal al 1%-2% vol/vol en 100%O2. Aplique lubricante oftálmico estéril, según sea necesario, en cada ojo.
- Controle al ratón para una frecuencia respiratoria regular (1-2/s) y una falta de respuesta de pellizco del dedo del pie para indicar si es necesario ajustar la anestesia.
- Coloque una pequeña cantidad (~0.5-1 ml) de gel de ultrasonido precalentado abaxial (lateral) a la columna vertebral a cada lado del ratón anestesiado, entre la última costilla y la pelvis.
- Ponga una pequeña cantidad de gel en la sonda de ultrasonido.
- Coloque la sonda paralela a las vértebras con la parte frontal de la sonda en el lado craneal. Una marca indicadora está presente en el cabezal de la sonda para indicar la orientación correcta de la sonda. Registre el día, la hora, la identificación del animal, la orientación de la sonda y el lado del animal (derecha, izquierda, dorsal, ventral) para cada nuevo conjunto de imágenes que se recopilen.
- Con un ratón en decúbito ventral (piel dorsal tocando la sonda), escanee lentamente el área en busca del punto de referencia del riñón (Figura 2B y Figura 3). Con el riñón a la vista, tire de la sonda caudal para encontrar el ovario, una estructura ovalada a redonda ligeramente hiperecoica (Figura 4A, B) dentro de una almohadilla de grasa ovárica muy hiperecoica que está bordeada cráneo-ventralmente por el riñón y dorso-lateralmente por la pared abdominal dorsal.
NOTA: La presión caudal y lateral al ovario puede dirigir el ovario más cerca de la pared abdominal y lejos de los asas del intestino. El ovario se coloca anatómicamente contra la pared abdominal dorsal, solo ventral y lateral a los músculos epaxiales y caudal al riñón. - Ajuste la ganancia de señal usando el control deslizante en la parte inferior de la pantalla de control para mejorar el contraste de la imagen.
- Para mejorar la obtención de imágenes del riñón, aplique presión con un dedo en el abdomen contralateral. Varíe la presión y el ángulo de directamente paralelo a la columna vertebral a ~ 20 ° ventral.
- Una vez que el órgano de interés esté a la vista, recopile un video haciendo clic en Guardar clip o Iniciar grabación y luego Detener grabación cuando haya terminado para conservar las imágenes en un número preestablecido de cuadros.
- Guarde fotogramas individuales de una imagen en vivo o de una grabación con el botón Guardar fotograma .
- Para obtener imágenes del útero, tire de la sonda caudalmente hasta que el ovario esté en el aspecto más craneal del campo de visión. Varíe la presión y el ángulo de la sonda hasta que el útero esté a la vista.
- Repita la colección de vídeo y fotogramas para cada órgano de interés.
- Encuentre el útero corriendo longitudinalmente a lo largo de la pared abdominal dorsal con la musculatura lateral de la pierna también a la vista (Figura 4B).
NOTA: El tamaño del útero y el diámetro de la luz pueden variar con la fase de estro y el estado de la enfermedad. - Controle el tejido en busca de movimiento peristáltico para diferenciar los asas intestinales de los cuernos estacionarios uterinos.
6. Recopila imágenes desde un enfoque ventral
- Coloque el ratón en decúbito dorsal y compruebe que la lubricación ocular es suficiente y que el hocico está firmemente en el cono de la nariz (Figura 2A).
- Aplique una pequeña cantidad (~0.5-1 ml) de gel de ultrasonido precalentado en el abdomen ventral y aplique la sonda en la línea media justo craneal del pubis para localizar la vejiga como un punto de referencia hipoecoico (Figura 5).
NOTA: Si la vejiga es demasiado grande y oscurece las imágenes del útero, se puede ejercer una presión suave en la parte inferior del abdomen para extraer la orina. - Tire de la sonda lateral a la vejiga para encontrar los cuernos uterinos. Aplique una ligera presión digital desde uno o ambos lados del ratón para llevar las bocinas al campo de visión. Sostenga la sonda perpendicular al ratón y escanee ambos lados del abdomen para capturar vistas transversales (secciones transversales) de ambos cuernos. Gire la sonda para capturar vistas sagitales.
- Después del ultrasonido, limpie el mouse limpio de gel con una toalla de papel y devuélvalo a su jaula para recuperarse. Los ratones están completamente despiertos en 2-5 minutos. Una vez que esté completamente despierto y ambulatorio, devuelva el ratón a la habitación del animal.
NOTA: Se puede colocar una almohadilla térmica a fuego lento debajo de la jaula para calentar la jaula y recuperarla. - En el punto final experimental o humano, eutanasia al ratón. Lo ideal es sacrificar al ratón en la jaula de la casa para reducir el estrés; Alternativamente, coloque el mouse en una cámara limpia. SuministreCO2 presurizado a una velocidad de desplazamiento del 10% -30% del volumen de la cámara por minuto. Después de aproximadamente 5 minutos sin respiración visible, verifique la muerte por luxación cervical. Proceder con la necropsia abdominal para la recolección del tumor.
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Representative Results
Los ratones transgénicos de doble deleción Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) se mantuvieron en un fondo genético mixto (129S, BALB/C, C57BL/6), como se describió anteriormente14. Todos los ratones fueron alimentados con un alimento con doxiciclina durante 2 semanas para inducir Cre recombinasa. En trabajos previos de nuestro grupo, la doxiciclina fue dosificada por sonda14; Sin embargo, en este estudio actual, el método de inducción de alimentación de doxiciclina funcionó de manera eficiente y redujo el estrés de la sonda nasogástrica para los ratones. Es importante comprobar que el método de administración de doxiciclina es adecuado para inducir la expresión de Cre recombinasa necesaria para extirpar el ADN de supresores tumorales (Arid1a y Pten) en células que expresan Pax8, como el útero. Se utilizó inmunohistoquímica con anticuerpos dirigidos contra ARID1a y pTEN14 para verificar si se lograba una pérdida adecuada de proteínas supresoras de tumores en las células epiteliales uterinas en comparación con el tejido estromal vecino, como se ve en la Figura 6. El esquema del modelo de ratón y la regulación de la expresión del supresor tumoral se presenta en la Figura 1.
Después de 2 semanas de doxiciclina, el útero no cambió significativamente en tamaño en comparación con los controles o el mismo ratón fotografiado antes de la administración de doxiciclina. Sin embargo, durante las siguientes 2-6 semanas después de la doxiciclina, el ultrasonido mostró que los ratones desarrollaron una variedad de patologías uterinas, comenzando con hiperplasia y progresando a adenocarcinoma. La Figura 7A,B muestra imágenes estadounidenses de un útero de ratón con cambios patológicos tempranos observados después de 3 semanas de tratamiento con doxiciclina. La Figura 7C,D muestra la patología macroscópica y la histopatología del mismo útero fotografiada en la Figura 7A,B después de que el ratón fue sacrificado inmediatamente después de la obtención de imágenes a las 3 semanas. Se puede observar el útero de paredes delgadas más pequeño (pero dilatado) y la hiperplasia endometrial temprana con preservación de la luz distinta (líquido uterino hiperecoico central). En ratones sacrificados en momentos posteriores, el útero era mucho más grande, tenía una luz más pequeña y tenía una pared engrosada (Figura 8 y Figura 9). Los ejemplos de lúmenes dilatados y cambios sutiles en el endometrio hiperplásico se comparan con el tejido denso y el crecimiento del cáncer nodular en el útero en la Figura 8 y la Figura 9. El ultrasonido y las imágenes gruesas fueron altamente consistentes entre sí para todos los ratones representados. La Figura 9 presenta múltiples imágenes del útero del mismo ratón en un estudio de curso temporal y demuestra los cambios morfológicos observados durante 6 semanas a medida que se desarrollaba el adenocarcinoma. La figura 5 presenta un abordaje ventral con secciones transversales de los cuernos uterinos adyacentes a la vejiga hipoecoica.
Para mejorar el contraste en el abdomen, la inyección de solución salina en la cavidad abdominal directamente antes de la obtención de imágenes mejoró la visualización de los órganos abdominales, incluidos el útero y los ovarios. La Figura 3 muestra comparaciones de ultrasonido del mismo ratón antes y después de la inyección de 1 ml de solución salina. Con la solución salina, hubo un aumento del espacio hipoecoico (negro) entre los órganos que permitió que el riñón, la almohadilla de grasa, el ovario, los cuernos uterinos, los intestinos y el bazo se individualizaran más fácilmente entre sí. En todas las otras figuras presentadas aquí, se realizaron inyecciones de solución salina antes de la obtención de imágenes para mejorar la claridad de la imagen.
En conjunto, este protocolo muestra que este modelo de ratón inducible desarrolla adenocarcinoma durante un período de 6 semanas y puede ser monitoreado con ultrasonido para establecer una línea de base y observar cambios morfológicos en el útero a medida que se desarrolla el cáncer. Aquí, se demuestra que el ultrasonido no invasivo permite que los cuernos uterinos en un ratón se evalúen en serie durante varias semanas con imágenes que son predictivas de los cambios patológicos uterinos reales.
Figura 1: Estrategia para la generación de ratones transgénicos doble KO inducibles por Pax8-Cre. (A) La producción constitutiva de un transactivador controlado por tetraciclina inversa (rtTA) en células epiteliales uterinas que expresan Pax8 da como resultado la activación inducible de Cre recombinasa en presencia de tetraciclina, o su análogo doxiciclina, mediante la unión a elementos de respuesta de tetraciclina (TRE). Los sitios flox ubicados aguas arriba y aguas abajo del exón 8 (Arid1a) y el exón 5 (Pten) son el objetivo de la recombinasa Cre. La deleción dirigida a Cre del exón 8 en Arid1a da como resultado una mutación de cambio de marco y un codón de parada temprana (p.Gly809Hisfs*6). La deleción dirigida a Cre del exón 5 en Pten da como resultado una mutación de cambio de marco (p.Val85Glyfs*14). (B) El ratón Pax8-rtTA expresa un transactivador controlado por tetraciclina inversa (rtTA) bajo el control del promotor Pax8. Este ratón se cruza con el ratón TetO-Cre que expresa Cre recombinasa de una manera dependiente de tetraciclina. La progenie de este cruce expresa una recombinasa Cre activada por tetraciclina (o doxiciclina) específica para las células epiteliales uterinas que expresan Pax8 (transactivador Pax8-Cre). (C) Los ratones Arid1a flox/flox en el fondo 129S1 se cruzaron con Pten flox/flox en el fondo BALB/C (cepa C;129S4-Ptentm1Hwu/J) para generar el ratón transresponder Arid1a flox/flox/Pten flox/flox. (D) El ratón transactivador Pax8-Cre se cruza con un ratón Transresponder Arid1a flox/flox/Pten flox/flox. La progenie de este cruce da como resultado un modelo murino transgénico con una deleción de Arid1a y Pten inducible por doxiciclina (iPAD) específica para las células epiteliales uterinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de imagen . (A) Un ratón anestesiado con el pelaje abdominal y dorsal eliminado con un cortapelos y crema depilatoria. El ratón se mantiene con anestesia con isoflurano inhalante a través de un cono nasal y se coloca en una almohadilla térmica cubierta con una almohadilla absorbente. (B) Se coloca una pequeña cantidad de gel de ultrasonido precalentado sobre la región de interés en el ratón y en la sonda. Aquí, el ratón está en reclinación ventral, y la sonda se coloca correctamente para localizar el riñón, el punto de referencia anatómico directamente craneal al ovario. (C) En la decúbito dorsal, la sonda se puede manipular manualmente para encontrar primero puntos de referencia como la vejiga con el fin de encontrar la ubicación aproximada de los cuernos uterinos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mejora de la visibilidad y definición del órgano mediante la inyección de solución salina. (A) Imagen de un riñón y asas del tracto gastrointestinal (abajo a la izquierda) antes de la inyección IP de 1,5 ml de solución salina estéril calentada. El lado izquierdo de la imagen es craneal al riñón. (B) Imagen del riñón después de la inyección de solución salina, mostrando aumento (espacio hipoecoico, negro) entre los órganos. Para ambas imágenes, en términos de orientación, el ratón es la superficie dorsal hacia arriba, y craneal a caudal es de izquierda a derecha. (C,D) La sección roja resaltada muestra puntos de referencia renales en las imágenes 2D presentadas en A y B. Las imágenes fueron tomadas usando un transductor MS550. Barras de escala = 2 mm en cada imagen. Abreviaturas: tracto gastrointestinal = tracto gastrointestinal; IP = intraperitoneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tracto reproductivo con puntos de referencia . (A) El ovario (flecha) se encuentra inmediatamente caudal a polo caudal del riñón. (B) El cuerno uterino (flecha estrecha) es profundo y comienza craneal a los músculos dorsales de la extremidad posterior proximal (punta de flecha), con el ovario también a la vista (flecha más grande). Barras de escala = 2 mm. Para todas las imágenes, en términos de orientación, el ratón es dorsal de la superficie hacia arriba, y de cráneo a caudal es de izquierda a derecha. Las imágenes fueron tomadas usando un transductor MS550. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuernos uterinos y vejiga fotografiados de la decúbito dorsal. Imágenes de ultrasonido de dos ratones antes de la inducción del cáncer. (A) La luz de la vejiga es visible como una estructura hipoecoica, ovoide con una mucosa hiperecoica. Ambos cuernos uterinos son visibles juntos, con los límites de cada uno trazados en azul claro. (B) La misma vista en otro ratón con una vejiga mucho más llena. Para ambas imágenes, en términos de orientación, el ratón es la superficie ventral hacia arriba, y la imagen izquierda es el ratón hacia la izquierda. Los límites de cada cuerno uterino se dibujan en azul claro, con áreas dadas en los cuadros de texto vecinos (transductor MS550). Barras de escala = 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplos de H&E e inmunohistoquímica de secciones de útero a las 6 semanas después de la inducción en un ratón iPAD. (A) H y E representativo del tejido uterino del ratón iPAD. (B) Inmunohistoquímica representativa ARID1a. La tinción muestra una pérdida de Arid1a específica de los núcleos de las células epiteliales uterinas que expresan Pax8 (flecha negra), con la retención de Arid1a en los núcleos de las células del estroma uterino (flecha blanca). (C) Inmunohistoquímica pTEN representativa. La tinción muestra una pérdida de pTEN en el citoplasma de las células epiteliales uterinas que expresan Pax 8 (flecha negra), con la retención de pTEN en el citoplasma de las células del estroma uterino (flecha blanca). Los métodos detallados de IHQ han sido publicados anteriormente14. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: iPAD = pten inducible, Arid1a doble eliminación; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Ejemplos de imágenes de ultrasonido de ratones con cambios tempranos en la patología. (A, B) Imagen de ultrasonido antemortem de un útero lleno de líquido uterino que es naturalmente hiperecoico Las flechas estrechas indican la luz hipoecoica y dilatada del útero. La punta de flecha indica el área engrosada de la pared uterina. (C) Imagen macroscópica de todo el útero del ratón fotografiado en B. El asterisco blanco está aproximadamente en la misma ubicación que el que se muestra en A. (D) En este mismo ratón, el útero fue procesado y teñido con H&E. La sección histológica muestra engrosamiento de la pared uterina debido a hiperplasia endometrial; La región de ejemplo se indica con una punta de flecha. Para todas las imágenes de EE.UU., en términos de orientación, el ratón es la superficie dorsal hacia arriba, y de cráneo a caudal es de izquierda a derecha (transductor MS550). Barras de escala = (A,B) 3 mm; D) 500 μm. Abreviaturas: US = ultrasonido; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Diversidad de patología uterina visible por ultrasonido . (A) Un útero con hiperplasia y distensión de líquidos que causa dilatación luminal a un diámetro de ~2.5 mm. (B) Un segundo útero con hiperplasia que se distiende en mayor grado. (C) Un útero que está dilatado y lleno de una masa de tejido blando. Barras de escala = 3 mm. Para todas las imágenes, las flechas están en el lado ventral del cuerno uterino, y en términos de la orientación de la imagen, el ratón está en la superficie dorsal hacia arriba, y de cráneo a caudal es de izquierda a derecha (transductor MS550). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Cambios en el desarrollo neoplásico del útero a lo largo del tiempo en un ratón. (A) Imagen de ultrasonido de un ratón iPAD que muestra el riñón (flecha más ancha), el ovario (caudal a riñón) y el útero (flecha estrecha), con el músculo de la pierna también visible (punta de flecha), capturada en tres puntos de tiempo: después de que el ratón comenzó una dieta con doxiciclina (semana 0), y luego nuevamente después de 5 semanas y 6 semanas. La doxiciclina indujo la expresión de Cre con pérdida de supresores tumorales, que promueve el cáncer de endometrio con el tiempo. (B) Las mismas imágenes de ultrasonido que A pero con el cuerno uterino resaltado en rojo. (C) Imágenes macroscópicas del útero in situ (flecha estrecha) desde el punto de tiempo de 6 semanas; El tejido se observa desde la superficie ventral. (D) El mismo útero que en C disecado ex vivo; El tejido se observa desde la superficie ventral. (E) Histología de la masa uterina (tinción H&E), indicando adenocarcinoma a partir de este ejemplo. Para A y B, en términos de orientación, el ratón está en la superficie dorsal hacia arriba, y de cráneo a caudal es de izquierda a derecha (transductor MS550). Barras de escala = (A, B, dos primeras imágenes en cada fila) 1 mm; (A,B, tercera imagen) 2 mm; (E) 500 μm. Abreviaturas: iPAD = pten inducible, Arid1a doble eliminación; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo examina la utilidad del ultrasonido para evaluar los cambios morfológicos uterinos en la progresión del adenocarcinoma en el útero en ratones. En este estudio, al seguir longitudinalmente la inducción del cáncer de endometrio en ratones, se encontró que los detalles anatómicos detectados por ultrasonido eran indicadores de patología macroscópica e histológica. Esto abre la puerta para el uso de estudios longitudinales con un número menor de ratones monitoreados por ultrasonido en múltiples puntos de tiempo para seguir la progresión de los cánceres uterinos en ratones. Esta detección longitudinal se logró mediante el uso de una sonda de mano y sin el uso de equipos de ultrasonido del sistema ferroviario. Las sondas de alta frecuencia (transductores) utilizadas están ampliamente disponibles, lo que hace que este enfoque sea reproducible en múltiples instituciones en todo el mundo. Los pasos críticos en el protocolo incluyen el uso de la sonda correcta para el nivel de resolución requerido para el experimento y la preparación del ratón para la obtención de imágenes antes de la ecografía.
Los pasos críticos en la preparación del ratón son eliminar todo el pelo de las áreas de estudio e inyectar líquido en la cavidad peritoneal. El pelaje que queda en la piel puede llevar a la captura de burbujas en el gel de ultrasonido, que puede producir artefactos en las imágenes; Por lo tanto, se debe tener cuidado de eliminar el vello de manera uniforme sobre el área de estudio. La crema depilatoria fue elegida como el método para la depilación, ya que elimina el pelaje de manera uniforme a través de la piel. La lesión de la piel puede ocurrir si la crema se deja en la piel durante un tiempo excesivo (>3-4 min). En ratones más sensibles a la crema depilatoria, la crema solo debe dejarse sobre la piel durante 1-2 minutos para eliminar el vello. A continuación, el ratón debe limpiarse con una serie de toallas de papel húmedas para eliminar completamente la crema. Después de que todo el cabello se ha eliminado del área de estudio, se inyectan fluidos isotónicos estériles y calientes en la cavidad intraperitoneal para aumentar el contraste y ayudar a definir los límites de los órganos abdominales. En este estudio, inyectar 1-2 ml de líquido fue suficiente para diferenciar el ovario, el oviducto y los cuernos uterinos. El líquido se absorbe gradualmente, y es mejor inyectarlo inmediatamente antes de la toma de imágenes. Los ratones se vuelven hipotérmicos rápidamente bajo anestesia con isoflurano. Esto se puede prevenir inyectando solución salina tibia (almacenada en jeringas en una almohadilla térmica) y también colocando el mouse en una almohadilla térmica y precalentando el gel de ultrasonido cuando sea posible. Las sesiones de imagen con ecografistas experimentados se ejecutan a 5-10 min / ratón, y con este corto tiempo, no se produjo hipotermia significativa. Si es necesario, se pueden inyectar hasta 2 ml adicionales de solución salina en el abdomen para una mayor separación de los órganos.
Los métodos descritos aquí están destinados a ser fácilmente reproducibles sin equipo especializado más allá de la máquina de ultrasonido y la (sonda (s). En el método presentado, la sonda se manipula manualmente sin la ayuda de un sistema ferroviario. Este método manual es más rápido y proporciona una gran flexibilidad en los ángulos y la presión aplicada para resaltar pequeñas características. La dirección manual de las sondas sobre el abdomen y el uso de transductores de menor resolución podrían limitar la calidad de cualquier imagen individual adquirida en comparación con las imágenes de un transductor fijado en el sistema de rieles4. Un sistema de rieles sería útil para inyecciones en el útero (en fetos) o inyecciones intracardíacas cuando se necesita más estabilidad. Sin embargo, existe una compensación con respecto al tiempo mínimo de manipulación y una mayor accesibilidad para la amplia gama de instituciones que carecen de instalaciones especializadas de ultrasonido. El éxito de este método simplificado ejemplifica cómo se puede utilizar el ultrasonido para una variedad de estudios. El método propuesto es muy adecuado para capturar cambios longitudinales en el tejido en modelos de cáncer uterino sin la necesidad de equipo dedicado y podría aplicarse a otros modelos de enfermedad progresiva. La manipulación manual de los ratones durante la obtención de imágenes puede aumentar la variabilidad en la profundidad y ubicación exactas del tejido, pero para los estudios que no dependen de estos factores, la calidad de la imagen es suficiente para detectar cambios patológicos.
Es importante guardar videos durante la creación de imágenes; Más tarde, en la estación de trabajo del usuario, los videos se pueden detener en cualquier fotograma que sea representativo de la anatomía que necesita ser capturada y medida. Se pueden medir imágenes de los órganos (diámetro, circunferencia o longitud) (Figura 5, sección transversal del cuerno uterino medida) y se puede calcular el área del tumor. Los vídeos, más que los fotogramas individuales, facilitan la identificación de órganos en un contexto anatómico mayor. Los videos también son útiles para determinar el movimiento de los intestinos delgado y grueso, lo que puede ayudar a diferenciar los intestinos del útero. La obtención de imágenes de alta calidad también depende de la familiaridad con la anatomía del ratón. Para obtener imágenes del útero móvil en lugar de obtener imágenes de más tejidos estacionarios (p. ej., un tumor de xenoinjerto implantado, ovarios), el uso del método manual tiene la ventaja de escanear y seguir los cuernos uterinos de proximal a distal. Durante el escaneo, se puede usar un ajuste gradual de los ángulos de la mano para seguir la bocina. La sonda MS550 se utilizó para todas las imágenes en este estudio y es preferible para el útero en comparación con la sonda MS700 de mayor resolución, que es mejor para los ovarios. Recientemente se ha publicado un trabajo con el MS700 para obtener imágenes de la tiroides del ratón, que muestra la alta resolución que es posible en otros tejidos15. Las imágenes de sonda de mano son útiles debido a los diversos grados de profundidad del tejido del útero entre el ovario y la vejiga. En este trabajo, moverse entre puntos de referencia anatómicos fácilmente reconocibles, como el riñón y la anatomía proximal de las extremidades posteriores, ayudó a capturar imágenes comparables en los diferentes puntos de tiempo al obtener imágenes del útero desde el aspecto dorsal del cuerpo.
Este método de ultrasonido de alta resolución para seguir los cambios anatómicos en el útero a lo largo del tiempo durante la tumorigénesis es superior a los métodos actuales que implican la eutanasia de animales de múltiples cohortes en diferentes puntos de tiempo. El ultrasonido refina el modelo y reduce el número de ratones necesarios para el experimento, reduciendo así los costos y el tiempo. Es importante destacar que este método permite seguir la progresión de la enfermedad a nivel individual, lo que puede conducir a ideas que se enmascaran en estudios que dependen de cohortes sacrificadas por punto de tiempo en lugar de etapa de la enfermedad. Debido a su naturaleza no invasiva, el ultrasonido de ratón tiene muchas aplicaciones potenciales para la investigación en cáncer uterino u ovárico.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos los fondos del Programa SPORE de Cáncer de Ovario del NCI P50CA228991, el programa de capacitación postdoctoral 5T32OD011089 y la Fundación Richard W. TeLinde, Universidad Johns Hopkins. El proyecto también fue financiado en parte por los subsidios para gastos corrientes a instituciones privadas de educación superior de la Corporación de Promoción y Ayuda Mutua para Escuelas Privadas de Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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