Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung des Fortschreitens morphologischer Veränderungen im Laufe der Zeit im Uterus in einem induzierbaren Mausmodell des Endometriumkarzinoms mittels Ultraschallbildgebung mit Korrelation zu groben und histologischen Veränderungen.
Abstract
Gebärmutterkrebs kann aufgrund der einfachen Handhabung und genetischen Manipulation in diesen Modellen an Mäusen untersucht werden. Diese Studien beschränken sich jedoch oft auf die postmortale Beurteilung der Pathologie bei Tieren, die zu mehreren Zeitpunkten in verschiedenen Kohorten eingeschläfert wurden, was die Anzahl der für eine Studie benötigten Mäuse erhöht. Die Bildgebung von Mäusen in Längsschnittstudien kann das Fortschreiten der Krankheit bei einzelnen Tieren verfolgen und so die Anzahl der benötigten Mäuse reduzieren. Fortschritte in der Ultraschalltechnologie haben es ermöglicht, Veränderungen im Mikrometerbereich in Geweben zu erkennen. Ultraschall wurde verwendet, um die Follikelreifung in den Eierstöcken und das Wachstum von Xenotransplantaten zu untersuchen, aber nicht auf morphologische Veränderungen in der Gebärmutter der Maus. Dieses Protokoll untersucht die Gegenüberstellung von Pathologie und In-vivo-Bildgebungsvergleichen in einem Mausmodell für induziertes Endometriumkarzinom. Die im Ultraschall beobachteten Merkmale stimmten mit dem Grad der Veränderung überein, der in der groben Pathologie und Histologie beobachtet wurde. Es wurde festgestellt, dass Ultraschall die beobachtete Pathologie in hohem Maße prädiktiv darstellt und die Einbeziehung der Ultraschalluntersuchung in Längsschnittstudien von Gebärmuttererkrankungen wie Krebs bei Mäusen unterstützt.
Introduction
Mäuse sind nach wie vor eines der wichtigsten Tiermodelle für Fortpflanzungsstörungen 1,2,3. Es gibt mehrere genetisch veränderte oder induzierte Nagetiermodelle für Eierstock- und Gebärmutterkrebs. Diese Studien stützen sich in der Regel auf mehrere Kohorten, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten euthanasiert wurden, um longitudinale Trends in morphologischen und pathologischen Veränderungen zu erfassen. Dadurch wird verhindert, dass kontinuierlich Daten über die Krebsentwicklung einer einzelnen Maus gewonnen werden können. Darüber hinaus basieren Interventionsstudien ohne Kenntnis des individuellen Krankheitsverlaufs der Maus auf vorgegebenen Zeitpunkten und gemittelten Ergebnissen früherer Kohorten und nicht auf individuellen Schwellenwerten für den Nachweis der Progression bei einem bestimmten Tier 4,5. Daher sind bildgebende Ansätze erforderlich, die eine longitudinale Beurteilung in lebenden Tieren ermöglichen, um präklinische Modelle für die Erprobung neuer Medikamente oder Wirkstoffe zu erleichtern und das Verständnis der Pathobiologie zu beschleunigen und gleichzeitig die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen6.
Die Ultraschallbildgebung (US) ist eine attraktive Methode für die longitudinale Überwachung der Progression von Gebärmutterkrebs bei Mäusen, da sie im Vergleich zu anderen bildgebenden Verfahren relativ einfach und kostengünstig ist, einfach durchzuführen ist und eine bemerkenswerte Auflösung aufweisen kann 6,7. Diese nicht-invasive Modalität kann Merkmale im Mikrometerbereich bei wachen Mäusen oder bei Mäusen unter kurzer Sedierung mit einer 5-10-minütigen Untersuchung erfassen. Die Ultraschallmikroskopie wurde als Methode zur Messung der Entwicklung der Ovarialfollikel der Maus 8 und des Wachstums von implantierten oder induzierten Neoplasienvalidiert 9,10,11. Hochfrequenz-US wurde auch für perkutane intrauterine Injektionen12 und die Beobachtung der Uterusveränderung von Ratten während des Brunstzyklus13 verwendet. Hochfrequenz-US kann mit Mäusen verwendet werden, die auf speziellen stationären Plattformen gehalten werden, wobei ein Schienensystem verwendet wird, um den Wandler/die Sonde zu halten, um hochauflösende Bilder mit standardisierter Position und Druck aufzunehmen. Diese Geräte sind jedoch nicht an allen Einrichtungen verfügbar. Tragbare Schallkopf-Scanmethoden können mit weniger speziellen Geräten übernommen und sowohl für die klinische Diagnostik als auch für Forschungsanwendungen an Mäusen verwendet werden.
Es bleibt die Frage, ob die US-Bildgebung mit tragbaren Hochfrequenzsonden verwendet werden könnte, um die Entwicklung von Gebärmutterkrebs über mehrere Wochen zu überwachen. Ähnlich wie der Darm ist der Uterus von Nagetieren eine dünnwandige, schlanke Struktur, die innerhalb des Bauches sehr beweglich ist und durch mehrere Gewebetiefen angrenzt, was die Bildgebung schwieriger macht als bei relativ unbeweglichen Organen wie den Nieren. Ziel dieser Studie war es, die Korrelation zwischen dem mittels Ultraschall beobachteten Gewebe und der Histopathologie herzustellen, Orientierungspunkte für die Lokalisierung des Uterus der Maus zu definieren und die Durchführbarkeit der longitudinalen Beurteilung von Endometriumkarzinomen zu bestimmen. In dieser Studie werden Daten präsentiert, die eine qualitative Übereinstimmung zwischen dem Erscheinungsbild der Uteri in den USA und der Histopathologie sowie der seriellen Bildgebung von Mäusen über mehrere Wochen zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass tragbare US zur Überwachung der Entwicklung von Endometriumkrebs bei Mäusen verwendet werden kann, wodurch die Möglichkeit geschaffen wird, individuelle Längsschnittdaten von Mäusen zu sammeln, um Gebärmutterkrebs zu untersuchen, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind.
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Protocol
Alle Verfahren und Experimente mit Mäusen wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt wurden. Für alle Eingriffe wurde geeignete PSA getragen, einschließlich Handschuhen und Einweg-Isolationskitteln. Beim Umgang mit scharfen und scharfen Gegenständen wurden Vorsichtsmaßnahmen getroffen, die sofort nach Gebrauch ordnungsgemäß in Behältern für scharfe Gegenstände entsorgt wurden. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Induktion von Endometriumkarzinom bei iPAD-Mäusen (induzierbares Pten, Arid1a-Doppeldeletion ) mit Doxycyclin
- 10 transgene Pax8-Cre-Arid1a-Pten-Mäuse mit doppelter Deletion (iPAD) (Abbildung 1) auf einem gemischten genetischen Hintergrund (129S, BALB/C, C57BL/6), wie zuvor beschrieben14.
- Erfassen Sie vor der Behandlung mit Doxycyclin Basis-Ultraschallbilder (2D) der Eierstöcke, des Eileiters und der Gebärmutter jeder Maus.
- Den weiblichen iPAD-Mäusen wird ab einem Alter von 7-8 Wochen für mindestens 2 Wochen ausschließlich Doxycyclin-haltiges Mäusefutter (Doxycyclin-Hyclat mit 625 mg/kg Futter) verabreicht, um eine Gendeletion zu induzieren.
2. Einrichten der Ausrüstung
- Schalten Sie das Heizkissen ein und decken Sie es mit einem sauberen, saugfähigen Pad ab (Zieltemperatur: 38 °C).
- Vergewissern Sie sich, dass der Isofluran-Verdampfer und derO2-Tank ausreichend gefüllt sind. Nachfüllen und ersetzen, wenn der Inhalt niedrig ist.
- Schließe die Induktionskammer, den Nasenkegel und das Spülsystem an den Vaporizer an.
- Stellen Sie das Ultraschallgerät auf.
- Wählen Sie einen Schallkopf (Sonde) mit einem Bereich von 32-56 MHz bzw. bis zu 70 MHz für die Bildgebung der Gebärmutter bzw. des Eierstocks.
- Schließen Sie die Sonde an und schalten Sie die Maschine ein.
- Verwenden Sie nach dem Systemstart die Systemsteuerung, um sich mit den Benutzeranmeldeinformationen anzumelden und auf den Startbildschirm zuzugreifen.
- Gehen Sie auf dem Startbildschirm zur Registerkarte Anwendungen und wählen Sie Mausmodus (klein) Bauch.
- Klicken Sie auf Scannen , um zum Startbildschirm zurückzukehren, und warten Sie, bis ein Live-Bild angezeigt wird.
- Wählen Sie B-Modus aus den Optionen in der linken Symbolleiste.
- Klicken Sie auf Weitere Steuerelemente , um zusätzliche Werkzeuge zur Bildverfeinerung anzuzeigen, z. B. Bildverstärkung und -tiefe, oder um die Einstellungen für die Clip-Aufnahme anzupassen, z. B. die Anzahl der Bilder pro Sekunde.
- Sobald Sie die Bildeinstellungen ausgewählt haben, kehren Sie zum Startbildschirm zurück, indem Sie auf Scannen klicken.
- Schalten Sie den O2-Tank ein, leiten Sie den Durchfluss in die Induktionskammer und stellen Sie die Durchflussmenge auf 1 l/min ein.
3. Vorbereitung von Mäusen für das Ultraschall-Screening, einschließlich Haarentfernung
- Legen Sie eine Maus in die Induktionskammer. Stellen Sie den Isofluran-Verdampfer für die Anästhesieeinleitung auf 2%-3% vol/vol ein.
- Bestimmen Sie die angemessene Anästhesietiefe durch mangelnde Reaktion auf Zehenkneifen und eine Atemfrequenz von etwa 1-2 Atemzügen/s.
- Tragen Sie steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf jedes Auge auf. Entfernen Sie das Fell vom Rücken und Bauchmuskel zwischen der letzten Rippe und dem Becken mit einer Haarschneidemaschine in geeigneter Größe.
- Tragen Sie eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die abzubildenden ventralen und dorsalen Regionen auf (falls erforderlich).
- Legen Sie die Maus für ca. 3-5 Minuten wieder in die Induktionskammer, um die angemessene Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten, während die Enthaarungscreme die Haare entfernt. Wischen Sie die Creme nach ≤4 Minuten vorsichtig mit einem sauberen, feuchten Papiertuch ab.
Anmerkungen: Längerer Kontakt mit Enthaarungscreme ist reizend und kann Hautläsionen verursachen.
4. Intraperitoneale Injektion von Flüssigkeit zur Erhöhung des Kontrasts zwischen den Organen
- Erwärmen Sie eine 3-10-ml-Spritze, die mit steriler isotonischer Flüssigkeitslösung (z. B. sterile 0,9%ige NaCl- oder Laktatringerlösung) gefüllt ist, auf 35-40 °C, indem Sie sie einige Minuten lang zwischen ein Heizkissen und ein saugfähiges Pad legen. Stellen Sie eine Flasche Ultraschallgel auf das Heizkissen, wenn das Gerät keinen Wärmer hat.
- Bei einer 20-25 g schweren Maus werden 1-2 ml Lösung in die Bauchhöhle injiziert.
- Befestigen Sie die Maus am Genick in einer Hand und legen Sie das Ventrum frei.
- Halten Sie die Maus in einem Winkel von ~20°, wobei die Nase auf den Boden zeigt, um die Organe aufgrund der Schwerkraft kranial zu lenken.
- Mit einer kleinen Nadel (25 G, 5/8 Zoll lang, Tuberkulinspritze) durch die Haut und die Bauchdecke des kaudalen rechten Quadranten des Abdomens punktieren.
- Vor der Injektion von Flüssigkeiten mit minimalem Druck zurückziehen, um eine Injektion in die Gefäße oder den Magen-Darm-Trakt zu vermeiden. Wenn Blut oder anderes Material in die Spritze eindringt, entfernen Sie die Nadel. Verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze und versuchen Sie es erneut an einer etwas anderen Position.
- Wenn die Maus während der Injektionen aufwacht, legen Sie sie zur Narkose mit 2%-3% vol/vol Isofluran wieder in die kleine Induktionskammer.
5. Ultraschallbildgebung aus dorsalem Zugang
- Positionieren Sie die Maus ventral liegend auf dem absorbierenden Pad über einem Heizkissen (Abbildung 2A-C).
- Platzieren Sie einen Nagetiernasenkegel sicher über der Nase und der Schnauze der Maus. Halten Sie die Anästhesietiefe mit Isofluran aufrecht, das durch den Nasenkegel bei 1 % bis 2 Vol.-% in 100 %O2 abgegeben wird. Tragen Sie bei Bedarf steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf jedes Auge auf.
- Überwachen Sie die Maus auf eine regelmäßige Atemfrequenz (1-2/s) und eine fehlende Zehenkneifreaktion, um anzuzeigen, ob die Anästhesie angepasst werden muss.
- Geben Sie eine kleine Menge (~0,5-1 ml) des vorgewärmten Ultraschallgels abaxial (lateral) auf die Wirbelsäule auf beiden Seiten der anästhesierten Maus, zwischen der letzten Rippe und dem Becken.
- Geben Sie eine kleine Menge Gel auf die Ultraschallsonde.
- Platzieren Sie die Sonde parallel zu den Wirbeln mit der Vorderseite der Sonde auf der kranialen Seite. Auf dem Sondenkopf befindet sich eine Anzeigemarkierung, die die richtige Sondenausrichtung anzeigt. Notieren Sie den Tag, die Uhrzeit, die Tier-ID, die Sondenausrichtung und die Tierseite (rechts, links, dorsal, ventral) für jeden neuen Satz von Bildern, die erfasst werden.
- Scannen Sie mit einer Maus in ventraler Lage (Rückenhaut, die die Sonde berührt) langsam den Bereich nach dem Nieren-Orientierungspunkt ab (Abbildung 2B und Abbildung 3). Mit Blick auf die Niere ziehen Sie die Sonde kaudal, um den Eierstock zu finden - eine leicht echoarme ovale bis runde Struktur (Abbildung 4A, B) innerhalb eines sehr echoarmen ovariellen Fettpolsters, das kranio-ventral von der Niere und dorso-lateral von der dorsalen Bauchwand begrenzt wird.
Anmerkungen: Der Druck kaudal und seitlich des Eierstocks kann den Eierstock näher an die Bauchdecke und weg von den Darmschlingen lenken. Der Eierstock ist anatomisch an der dorsalen Bauchdecke positioniert, gerade ventral und lateral der epaxialen Muskeln und kaudal zur Niere. - Passen Sie die Signalverstärkung mit dem Schieberegler am unteren Rand des Steuerungsbildschirms an, um den Bildkontrast zu verbessern.
- Um die Darstellung der Niere zu verbessern, üben Sie mit einem Finger Druck auf den kontralateralen Bauch aus. Variieren Sie den Druck und den Winkel von direkt parallel zur Wirbelsäule bis ~20° ventral.
- Sobald das gewünschte Organ sichtbar ist, sammeln Sie ein Video, indem Sie auf "Clip speichern" oder "Aufnahme starten" und dann auf "Aufnahme stoppen" klicken, wenn Sie fertig sind, um die Bilder bei einer voreingestellten Anzahl von Bildern beizubehalten.
- Speichern Sie einzelne Frames aus einem Livebild oder einer Aufnahme mit der Schaltfläche "Frame speichern ".
- Um die Gebärmutter abzubilden, ziehen Sie die Sonde kaudal, bis sich der Eierstock im kranialsten Aspekt des Sichtfeldes befindet. Variieren Sie den Druck und den Winkel der Sonde, bis die Gebärmutter sichtbar ist.
- Wiederholen Sie die Video- und Bildsammlung für jedes Organ von Interesse.
- Der Uterus verläuft in Längsrichtung entlang der dorsalen Bauchdecke, wobei auch die seitliche Beinmuskulatur zu sehen ist (Abbildung 4B).
HINWEIS: Die Größe der Gebärmutter und der Lumendurchmesser können je nach Brunstphase und Krankheitszustand variieren. - Überwachen Sie das Gewebe auf peristaltische Bewegungen, um die Darmschlingen von den stationären Hörnern der Gebärmutter zu unterscheiden.
6. Sammeln Sie Bilder von einem ventralen Zugang
- Legen Sie die Maus in die Rückenlage und überprüfen Sie, ob die Augenbefeuchtung ausreichend ist und die Schnauze sicher im Nasenkegel sitzt (Abbildung 2A).
- Tragen Sie eine kleine Menge (~0,5-1 ml) des vorgewärmten Ultraschallgels auf den ventralen Abdomen auf und setzen Sie die Sonde an der Mittellinie direkt am Schädel des Schambeins an, um die Blase als echoarmen Orientierungspunkt zu lokalisieren (Abbildung 5).
HINWEIS: Wenn die Blase zu groß ist und die Bildgebung der Gebärmutter verdeckt, kann sanfter Druck auf den Unterbauch ausgeübt werden, um Urin abzupumpen. - Ziehen Sie die Sonde seitlich zur Blase, um die Gebärmutterhörner zu finden. Üben Sie leichten digitalen Druck von einer oder beiden Seiten der Maus aus, um die Hörner in das Sichtfeld zu bringen. Halten Sie die Sonde senkrecht zur Maus und scannen Sie beide Seiten des Bauches, um Queransichten (Querschnitte) beider Hörner zu erfassen. Drehen Sie die Sonde, um sagittale Ansichten aufzunehmen.
- Wischen Sie die Maus nach dem Ultraschall mit einem Papiertuch vom Gel ab und legen Sie sie zur Erholung in ihren Käfig zurück. Mäuse sind in 2-5 Minuten vollständig wach. Sobald sie vollständig wach und gehfähig ist, bringen Sie die Maus in den Tierraum zurück.
Anmerkungen: Ein Heizkissen bei schwacher Hitze kann unter den Käfig gelegt werden, um den Käfig für die Erholung zu erwärmen. - Am experimentellen oder humanen Endpunkt wird die Maus eingeschläfert. Idealerweise schläfern Sie die Maus im häuslichen Käfig ein, um Stress abzubauen. Alternativ können Sie die Maus auch in eine saubere Kammer legen. Fördern Sie unter Druck stehendes CO2 mit einer Verdrängungsrate von 10 % bis 30 % des Kammervolumens pro Minute. Nach ca. 5 Minuten ohne sichtbare Atmung ist der Tod durch Zervixluxation zu bestätigen. Fahren Sie mit der abdominalen Nekropsie zur Tumorentnahme fort.
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Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten double deletion (iPAD) transgene Mäuse wurden auf einem gemischten genetischen Hintergrund (129S, BALB/C, C57BL/6) gehalten, wie zuvor beschrieben14. Die Mäuse wurden alle 2 Wochen lang mit einem Doxycyclin-Futter gefüttert, um die Cre-Rekombinase zu induzieren. In früheren Arbeiten unserer Gruppe wurde Doxycyclin durch Sonde14 dosiert; In dieser aktuellen Studie funktionierte die Doxycyclin-Futterinduktionsmethode jedoch effizient und reduzierte den Sondenstress für die Mäuse. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Doxycyclin-Verabreichungsmethode ausreichend ist, um die Cre-Rekombinase-Expression zu induzieren, die erforderlich ist, um die DNA für Tumorsuppressoren (Arid1a und Pten) in Pax8-exprimierenden Zellen, wie z.B. dem Uterus, zu entfernen. Immunhistochemie mit Antikörpern, die gegen ARID1a und pTEN14 gerichtet waren, wurde verwendet, um zu überprüfen, ob in den uterinen Epithelzellen im Vergleich zum benachbarten Stromagewebe ein ausreichender Verlust des Tumorsuppressorproteins erreicht wurde, wie in Abbildung 6 zu sehen ist. Das Schema des Mausmodells und der Tumorsuppressor-Expressionsregulation ist in Abbildung 1 dargestellt.
Nach 2-wöchiger Behandlung mit Doxycyclin veränderte sich die Größe des Uterus nicht signifikant im Vergleich zu Kontrollen oder derselben Maus, die vor der Verabreichung von Doxycyclin abgebildet wurde. In den nächsten 2-6 Wochen nach der Behandlung mit Doxycyclin zeigte der Ultraschall jedoch, dass die Mäuse eine Reihe von Uteruspathologien entwickelten, die mit Hyperplasie begannen und sich zum Adenokarzinom entwickelten. Abbildung 7A,B zeigt US-Bilder eines Maus-Uterus mit frühen pathologischen Veränderungen, die nach 3-wöchiger Doxycyclin-Behandlung zu sehen sind. Abbildung 7C,D zeigt die grobe Pathologie und Histopathologie desselben Uterus, die in Abbildung 7A,B dargestellt ist, nachdem die Maus unmittelbar nach der Bildgebung nach 3 Wochen eingeschläfert wurde. Der kleinere (aber erweiterte) dünnwandige Uterus und eine frühe Endometriumhyperplasie mit Erhalt des ausgeprägten Lumens (zentrale echoarme Uterusflüssigkeit) sind zu beobachten. Bei Mäusen, die zu späteren Zeitpunkten eingeschläfert wurden, war der Uterus viel größer, hatte ein kleineres Lumen und eine verdickte Wand (Abbildung 8 und Abbildung 9). Beispiele für erweiterte Lumen und subtile Veränderungen im hyperplastischen Endometrium werden in Abbildung 8 und Abbildung 9 mit dichtem Gewebe und knotigem Krebswachstum in der Gebärmutter verglichen. Die Ultraschall- und Bruttobilder stimmten bei allen dargestellten Mäusen sehr gut überein. Abbildung 9 zeigt mehrere Uterusbilder derselben Maus in einer Zeitverlaufsstudie und zeigt die morphologischen Veränderungen, die über 6 Wochen bei der Entwicklung des Adenokarzinoms beobachtet wurden. Abbildung 5 zeigt einen ventralen Zugang mit Querschnitten der Uterushörner neben der echoarmen Blase.
Um den Kontrast im Bauchraum zu erhöhen, verbesserte die Injektion von Kochsalzlösung in die Bauchhöhle direkt vor der Bildgebung die Visualisierung der Bauchorgane, einschließlich der Gebärmutter und der Eierstöcke. Abbildung 3 zeigt Ultraschallvergleiche derselben Maus vor und nach der Injektion von 1 ml Kochsalzlösung. Bei Kochsalzlösung gab es einen vergrößerten echoarmen Raum (schwarz) zwischen den Organen, der es ermöglichte, dass Niere, Fettpolster, Eierstock, Gebärmutterhörner, Darm und Milz leichter voneinander individualisiert werden konnten. In allen anderen hier dargestellten Abbildungen wurden vor der Bildgebung Kochsalzinjektionen durchgeführt, um die Bildschärfe zu verbessern.
Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll, dass dieses induzierbare Mausmodell über einen Zeitraum von 6 Wochen ein Adenokarzinom entwickelt und mit Ultraschall überwacht werden kann, um eine Ausgangslinie zu ermitteln und morphologische Veränderungen in der Gebärmutter zu beobachten, während sich der Krebs entwickelt. Hier wird gezeigt, dass nicht-invasiver Ultraschall es ermöglicht, die Gebärmutterhörner einer Maus über mehrere Wochen seriell mit Bildern zu beurteilen, die die tatsächlichen pathologischen Veränderungen der Gebärmutter vorhersagen.
Abbildung 1: Strategie zur Generierung der Pax8-Cre induzierbaren Doppel-KO-transgenen Mäuse. (A) Die konstitutive Produktion eines reversen Tetracyclin-kontrollierten Transaktivators (rtTA) in Pax8-exprimierenden Uterusepithelzellen führt zu einer induzierbaren Aktivierung der Cre-Rekombinase in Gegenwart von Tetracyclin oder seinem Analogon Doxycyclin durch Bindung an Tetracyclin-Antwortelemente (TRE). Flox-Stellen, die stromaufwärts und stromabwärts von Exon 8 (Arid1a) und Exon 5 (Pten) liegen, werden von der Cre-Rekombinase anvisiert. Die Cre-gezielte Deletion von Exon 8 in Arid1a führt zu einer Frameshift-Mutation und einem frühen Stop-Codon (p.Gly809Hisfs*6). Die Cre-gezielte Deletion von Exon 5 in Pten führt zu einer Frameshift-Mutation (p.Val85Glyfs*14). (B) Die Pax8-rtTA-Maus exprimiert einen reversen Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator (rtTA) unter der Kontrolle des Pax8-Promotors. Diese Maus wird mit der TetO-Cre-Maus gekreuzt, die die Cre-Rekombinase in einer Tetracyclin-abhängigen Weise exprimiert. Die Nachkommen aus dieser Kreuzung exprimieren eine Tetracyclin- (oder Doxycyclin)-aktivierte Cre-Rekombinase, die spezifisch für Pax8-exprimierende Uterusepithelzellen ist (Pax8-Cre-Transaktivator). (C) Arid1a flox/flox Mäuse auf dem 129S1 Hintergrund wurden mit Pten flox/flox auf dem BALB/C Hintergrund (Stamm C;129S4-Ptentm1Hwu/J) gekreuzt, um die Arid1a flox/flox/Pten flox/flox Transrespondermaus zu erzeugen. (D) Die Pax8-Cre Transaktivator-Maus wird mit einer Arid1a flox/flox/Pten flox/flox Transresponder-Maus gekreuzt. Nachkommen aus dieser Kreuzung führen zu einem transgenen Mausmodell mit einer Doxycyclin-induzierbaren Arid1a- und Pten-Deletion (iPAD), die spezifisch für uterine Epithelzellen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bildgebendes Verfahren . (A) Eine betäubte Maus, bei der das Bauch- und Rückenfell mit einer Haarschneidemaschine und einer Enthaarungscreme entfernt wurde. Die Maus wird über einen Nasenkegel in einer inhalativen Isofluran-Anästhesie gehalten und auf ein Wärmekissen gelegt, das mit einem absorbierenden Pad bedeckt ist. (B) Eine kleine Menge des vorgewärmten Ultraschallgels wird über den interessierenden Bereich der Maus und auf die Sonde aufgetragen. Hier befindet sich die Maus in ventraler Liegeposition und die Sonde ist richtig platziert, um die Niere, den anatomischen Orientierungspunkt direkt kranial des Eierstocks, zu lokalisieren. (C) In dorsaler Liegeposition kann die Sonde manuell manipuliert werden, um zunächst Orientierungspunkte wie die Blase zu finden, um die ungefähre Position der Gebärmutterhörner zu finden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Verbesserung der Sichtbarkeit und Organdefinition durch die Injektion von Kochsalzlösung. (A) Aufnahme einer Niere und Schleifen des Magen-Darm-Traktes (unten links) vor der IP-Injektion von 1,5 ml erwärmter, steriler Kochsalzlösung. Die linke Seite des Bildes ist kranial zur Niere. (B) Bild der Niere nach der Kochsalzinjektion, das einen vergrößerten (echoarmen Raum, schwarz) zwischen den Organen zeigt. Bei beiden Bildern befindet sich die Maus in Bezug auf die Ausrichtung auf der dorsalen Oberfläche nach oben und kranial bis kaudal von links nach rechts. (C,D) Der rot hervorgehobene Bereich zeigt die Orientierungspunkte der Nieren in den 2D-Bildern, die in A und B dargestellt sind. Die Bilder wurden mit einem MS550-Schallkopf aufgenommen. Maßstabsbalken = 2 mm in jedem Bild. Abkürzungen: GI-Trakt = Magen-Darm-Trakt; IP = intraperitoneal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Fortpflanzungstrakt mit Orientierungspunkten . (A) Der Eierstock (Pfeil) befindet sich unmittelbar kaudal zum kaudalen Pol der Niere. (B) Das Uterushorn (schmaler Pfeil) ist tief und beginnt kranial zu den dorsalen Muskeln der proximalen Hintergliedmaße (Pfeilspitze), wobei auch der Eierstock sichtbar ist (größerer Pfeil). Maßstabsbalken = 2 mm. Bei allen Bildern ist die Maus in Bezug auf die Ausrichtung auf der dorsalen Oberfläche nach oben und kranial bis kaudal von links nach rechts. Die Bilder wurden mit einem MS550-Schallkopf aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Uterushörner und Blase aus dorsaler Lage. Ultraschallbilder von zwei Mäusen vor der Krebsinduktion. (A) Das Blasenlumen ist als echoarme, eiförmige Struktur mit echoreicher Schleimhaut sichtbar. Beide Gebärmutterhörner sind zusammen sichtbar, wobei die Grenzen der einzelnen Hörner hellblau nachgezeichnet sind. (B) Die gleiche Ansicht in einer anderen Maus mit einer viel volleren Blase. Bei beiden Bildern befindet sich die Maus in Bezug auf die Ausrichtung auf der ventralen Oberfläche nach oben, und das Bild links ist die Maus links. Die Grenzen jedes Gebärmutterhorns sind hellblau eingezeichnet, wobei die Bereiche in den benachbarten Textfeldern (MS550-Schallkopf) angegeben sind. Maßstabsbalken = 3 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Beispiele für H&E und Immunhistochemie von Uterusabschnitten 6 Wochen nach der Induktion in einer iPAD-Maus. (A) Repräsentative H&E des Uterusgewebes der iPAD-Maus. (B) Repräsentative ARID1a-Immunhistochemie. Die Färbung zeigt einen Verlust von Arid1a, der spezifisch für die Zellkerne von Pax8-exprimierenden Uterusepithelzellen ist (schwarzer Pfeil), wobei Arid1a in den Kernen der uterinen Stromazellen zurückbleibt (weißer Pfeil). (C) Repräsentative pTEN-Immunhistochemie. Die Färbung zeigt einen Verlust von pTEN im Zytoplasma von Pax 8-exprimierenden uterinen Epithelzellen (schwarzer Pfeil) und die Retention von pTEN im Zytoplasma der uterinen Stromazellen (weißer Pfeil). Detaillierte IHC-Methoden wurden bereits veröffentlicht14. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: iPAD = induzierbares Pten, Arid1a Doppeldeletion; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Beispiele für Ultraschallbilder von Mäusen mit frühen Veränderungen in der Pathologie. (A,B) Antemortem-Ultraschallbild einer Gebärmutter, die mit Uterusflüssigkeit gefüllt ist, die von Natur aus echoarm ist Die schmalen Pfeile zeigen das echoarme, erweiterte Lumen des Uterus an. Die Pfeilspitze zeigt den verdickten Bereich der Gebärmutterwand an. (C) Bruttobild der gesamten Gebärmutter von der Maus, die in B abgebildet ist. Das weiße Sternchen befindet sich ungefähr an der gleichen Stelle wie das in A abgebildete. (D) Bei derselben Maus wurde der Uterus bearbeitet und mit H&E gefärbt. Der histologische Schnitt zeigt eine Verdickung der Gebärmutterwand aufgrund einer Endometriumhyperplasie; Der Beispielbereich ist mit einer Pfeilspitze gekennzeichnet. Bei allen US-Bildern befindet sich die Maus in Bezug auf die Ausrichtung auf der dorsalen Oberfläche nach oben und kranial bis kaudal von links nach rechts (MS550-Schallkopf). Maßstabsbalken = (A,B) 3 mm; (D) 500 μm. Abkürzungen: US = Ultraschall; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Diversität der Uteruspathologie, sichtbar durch Ultraschall . (A) Ein Uterus mit Hyperplasie und Flüssigkeitsaufblähung, die eine luminale Dilatation auf einen Durchmesser von ~2,5 mm verursacht. (B) Ein zweiter Uterus mit Hyperplasie, der stärker aufgebläht ist. (C) Eine Gebärmutter, die sowohl erweitert als auch mit einer Weichteilmasse gefüllt ist. Maßstabsbalken = 3 mm. Bei allen Bildern befinden sich die Pfeile auf der ventralen Seite des Gebärmutterhorns, und in Bezug auf die Bildausrichtung befindet sich die Maus auf der dorsalen Oberfläche nach oben und kranial bis kaudal von links nach rechts (MS550-Schallkopf). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Veränderungen in der neoplastischen Entwicklung des Uterus im Laufe der Zeit bei einer Maus. (A) Ultraschallbild einer iPAD-Maus, die die Niere (breiterer Pfeil), den Eierstock (kaudal zur Niere) und den Uterus (schmaler Pfeil) zeigt, wobei auch der Beinmuskel sichtbar ist (Pfeilspitze), aufgenommen zu drei Zeitpunkten: nachdem die Maus mit einer Doxycyclin-Diät begonnen wurde (Woche 0), und dann wieder nach 5 Wochen und 6 Wochen. Doxycyclin induzierte Cre-Expression mit Verlust des Tumorsuppressors, was im Laufe der Zeit den Endometriumkrebs fördert. (B) Die gleichen Ultraschallbilder wie A, aber mit rot hervorgehobenem Gebärmutterhorn. (C) Bruttobilder des Uterus in situ (schmaler Pfeil) ab dem 6. Wochenzeitpunkt; Das Gewebe wird von der ventralen Oberfläche aus betrachtet. (D) Derselbe Uterus wie bei C ex vivo präpariert; Das Gewebe wird von der ventralen Oberfläche aus betrachtet. (E) Histologie der Uterusmasse (H&E-Färbung), die auf ein Adenokarzinom aus diesem Beispiel hinweist. Bei A und B ist die Maus in Bezug auf die Orientierung auf der dorsalen Oberfläche nach oben und kranial bis kaudal von links nach rechts (MS550-Schallkopf). Maßstabsbalken = (A,B, die ersten beiden Bilder in jeder Reihe) 1 mm; (A,B, drittes Bild) 2 mm; (E) 500 μm. Abkürzungen: iPAD = induzierbares Pten, Arid1a Doppeldeletion; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll untersucht den Nutzen von Ultraschall zur Beurteilung der morphologischen Veränderungen der Gebärmutter bei der Progression eines Adenokarzinoms in der Gebärmutter bei Mäusen. In dieser Studie wurden durch die Verfolgung der Induktion von Endometriumkarzinomen bei Mäusen in Längsrichtung die durch Ultraschall erfassten anatomischen Details als Indikatoren für grobe und histologische Pathologie identifiziert. Dies öffnet die Tür für den Einsatz von Längsschnittstudien mit einer kleineren Anzahl von Mäusen, die zu mehreren Zeitpunkten per Ultraschall überwacht werden, um das Fortschreiten von Gebärmutterkrebs bei Mäusen zu verfolgen. Diese Längsdetektion wurde mit einer Handsonde und ohne den Einsatz von Schienensystem-Ultraschallgeräten durchgeführt. Die verwendeten Hochfrequenzsonden (Wandler) sind weit verbreitet, so dass dieser Ansatz an mehreren Institutionen weltweit reproduzierbar ist. Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die Verwendung der richtigen Sonde für die für das Experiment erforderliche Auflösung und die Vorbereitung der Maus auf die Bildgebung vor dem Ultraschall.
Kritische Schritte bei der Vorbereitung der Maus sind das Entfernen aller Haare aus den Untersuchungsbereichen und das Injizieren von Flüssigkeit in die Bauchhöhle. Fell, das auf der Haut verbleibt, kann dazu führen, dass Blasen im Ultraschallgel eingeschlossen werden, was zu Artefakten in den Bildern führen kann. Daher sollte darauf geachtet werden, die Haare gleichmäßig über den Untersuchungsbereich zu entfernen. Als Methode zur Haarentfernung wurde eine Enthaarungscreme gewählt, da sie das Fell gleichmäßig auf der Haut entfernt. Hautverletzungen können auftreten, wenn die Creme über einen längeren Zeitraum (>3-4 Minuten) auf der Haut belassen wird. Bei Mäusen, die empfindlicher auf Enthaarungscreme reagieren, sollte die Creme nur 1-2 Minuten auf der Haut belassen werden, um die Haare zu entfernen. Als nächstes sollte die Maus mit einer Reihe von feuchten Papiertüchern abgewischt werden, um die Creme vollständig zu entfernen. Nachdem alle Haare aus dem Untersuchungsbereich entfernt wurden, werden sterile, warme isotonische Flüssigkeiten in die intraperitoneale Höhle injiziert, um den Kontrast zu erhöhen und die Grenzen der Bauchorgane zu definieren. In dieser Studie reichte die Injektion von 1-2 ml Flüssigkeit aus, um den Eierstock, den Eileiter und die Gebärmutterhörner zu unterscheiden. Die Flüssigkeit wird allmählich absorbiert, und es ist am besten, unmittelbar vor der Bildgebung zu injizieren. Mäuse werden unter Isofluran-Anästhesie schnell unterkühlt. Dies kann verhindert werden, indem warme Kochsalzlösung injiziert wird (in Spritzen auf einem Heizkissen aufbewahrt) und die Maus auch auf einem Heizkissen positioniert und das Ultraschallgel nach Möglichkeit vorwärmt. Die Bildgebungssitzungen mit erfahrenen Sonographen dauern 5-10 Minuten/Maus, und in dieser kurzen Zeit trat keine signifikante Unterkühlung auf. Bei Bedarf können zusätzlich bis zu 2 ml Kochsalzlösung in den Bauchraum injiziert werden, um eine bessere Trennung der Organe zu erreichen.
Die hier beschriebenen Methoden sollen ohne spezielle Geräte, die über das Ultraschallgerät und die Sonde(n) hinausgehen, leicht reproduzierbar sein. Bei dem vorgestellten Verfahren wird die Sonde durchgehend manuell ohne Hilfe eines Schienensystems manipuliert. Diese manuelle Methode ist schneller und bietet eine große Flexibilität bei den Winkeln und dem Druck, der zum Hervorheben kleiner Merkmale ausgeübt wird. Die manuelle Ausrichtung der Sonden über den Abdomen und die Verwendung von Schallköpfen mit niedrigerer Auflösung könnten die Qualität der aufgenommenen Einzelbilder im Vergleich zu Bildern von einem am Schienensystem4 befestigten Schallkopf einschränken. Ein Schienensystem wäre nützlich für Injektionen in die Gebärmutter (in Föten) oder intrakardiale Injektionen, wenn mehr Stabilität erforderlich ist. Es gibt jedoch einen Kompromiss in Bezug auf minimale Manipulationszeit und verbesserte Zugänglichkeit für die breite Palette von Einrichtungen, die keine spezialisierten Ultraschallgeräte haben. Der Erfolg dieser vereinfachten Methode ist ein Beispiel dafür, wie Ultraschall für eine Reihe von Studien eingesetzt werden kann. Die vorgeschlagene Methode eignet sich gut für die Erfassung longitudinaler Gewebeveränderungen in Gebärmutterkrebsmodellen, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind, und könnte auf andere progressive Krankheitsmodelle angewendet werden. Die manuelle Manipulation der Mäuse während der Bildgebung kann die Variabilität in der genauen Gewebetiefe und -lage erhöhen, aber für Studien, die sich nicht auf diese Faktoren stützen, ist die Bildqualität ausreichend, um pathologische Veränderungen zu erkennen.
Es ist wichtig, Videos während der Bildgebung zu speichern. Später am Arbeitsplatz des Benutzers können die Videos an jedem Bild gestoppt werden, das für die Anatomie repräsentativ ist, die erfasst und gemessen werden soll. Es können Bilder der Organe (Durchmesser, Umfang oder Länge) gemessen werden (Abbildung 5, Uterushornquerschnitt gemessen) und das Tumorareal berechnet werden. Videos, mehr noch als Einzelbilder, erleichtern die Identifizierung von Organen in einem größeren anatomischen Kontext. Videos sind auch nützlich, um die Bewegung des Dünn- und Dickdarms zu bestimmen, was helfen kann, den Darm von der Gebärmutter zu unterscheiden. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, hängt es auch von der Vertrautheit mit der Anatomie der Maus ab. Für die Darstellung der beweglichen Gebärmutter im Vergleich zur Darstellung von stationärerem Gewebe (z. B. einem implantierten Xenotransplantat-Tumor, Eierstöcken) hat die manuelle Methode den Vorteil, dass die Gebärmutterhörner von proximal nach distal gescannt und verfolgt werden können. Während des Scannens können die Handwinkel schrittweise angepasst werden, um dem Horn zu folgen. Die MS550-Sonde wurde für die gesamte Bildgebung in dieser Studie verwendet und ist für die Gebärmutter im Vergleich zur höher auflösenden MS700-Sonde, die besser für Eierstöcke geeignet ist, vorzuziehen. Eine Arbeit, in der der MS700 zur Abbildung der Schilddrüse der Maus verwendet wurde, wurde kürzlich veröffentlicht und zeigt die hohe Auflösung, die in anderen Geweben möglich ist15. Die Bildgebung der Handsonde ist aufgrund der unterschiedlichen Gewebetiefe der Gebärmutter zwischen Eierstock und Blase hilfreich. In dieser Arbeit trug der Wechsel zwischen leicht erkennbaren anatomischen Orientierungspunkten wie der Niere und der proximalen Anatomie der Hintergliedmaßen dazu bei, vergleichbare Bilder über die verschiedenen Zeitpunkte hinweg aufzunehmen, wenn die Gebärmutter von der dorsalen Seite des Körpers aus abgebildet wurde.
Diese hochauflösende Ultraschallmethode, um die anatomischen Veränderungen der Gebärmutter im Laufe der Zeit während der Tumorentstehung zu verfolgen, ist den derzeitigen Methoden überlegen, bei denen Tiere aus mehreren Kohorten zu unterschiedlichen Zeitpunkten eingeschläfert werden. Ultraschall verfeinert das Modell und reduziert die Anzahl der Mäuse, die für das Experiment benötigt werden, wodurch Kosten und Zeit reduziert werden. Wichtig ist, dass diese Methode es ermöglicht, das Fortschreiten der Krankheit auf individueller Ebene zu verfolgen, was zu Erkenntnissen führen kann, die in Studien maskiert werden, die von Kohorten abhängen, die eher nach Zeitpunkt als nach Krankheitsstadium geopfert werden. Aufgrund seines nicht-invasiven Charakters hat der Ultraschall der Maus viele potenzielle Anwendungen für die Erforschung von Gebärmutter- oder Eierstockkrebs.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Förderung durch das NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, das Postdoktoranden-Trainingsprogramm 5T32OD011089 und die Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Das Projekt wurde auch teilweise durch die Subventionen für laufende Ausgaben an private Hochschulen von der Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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