Summary
यह प्रोटोकॉल सकल और हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों के सहसंबंध के साथ अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग करके एंडोमेट्रियल कैंसर के इंड्यूसेबल माउस मॉडल में गर्भाशय में समय के साथ रूपात्मक परिवर्तनों की प्रगति की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
इन मॉडलों में हैंडलिंग और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी के कारण चूहों में गर्भाशय के कैंसर का अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, ये अध्ययन अक्सर विभिन्न समूहों में कई समय बिंदुओं पर इच्छामृत्यु वाले जानवरों में पैथोलॉजी पोस्ट-मॉर्टम का आकलन करने तक सीमित होते हैं, जिससे अध्ययन के लिए आवश्यक चूहों की संख्या बढ़ जाती है। अनुदैर्ध्य अध्ययन में इमेजिंग चूहे व्यक्तिगत जानवरों में बीमारी की प्रगति को ट्रैक कर सकते हैं, जिससे चूहों की संख्या कम हो सकती है। अल्ट्रासाउंड प्रौद्योगिकी में प्रगति ने ऊतकों में माइक्रोमीटर-स्तर के परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति दी है। अल्ट्रासाउंड का उपयोग अंडाशय में कूप परिपक्वता और जेनोग्राफ्ट विकास का अध्ययन करने के लिए किया गया है, लेकिन माउस गर्भाशय में रूपात्मक परिवर्तनों पर लागू नहीं किया गया है। यह प्रोटोकॉल एक प्रेरित एंडोमेट्रियल कैंसर माउस मॉडल में विवो इमेजिंग तुलना के साथ पैथोलॉजी के जुड़ाव की जांच करता है। अल्ट्रासाउंड द्वारा देखी गई विशेषताएं सकल पैथोलॉजी और हिस्टोलॉजी द्वारा देखे गए परिवर्तन की डिग्री के अनुरूप थीं। अल्ट्रासाउंड को देखे गए पैथोलॉजी का अत्यधिक पूर्वानुमान लगाने वाला पाया गया, जो चूहों में कैंसर जैसे गर्भाशय रोगों के अनुदैर्ध्य अध्ययन में अल्ट्रासोनोग्राफी को शामिल करने का समर्थन करता है।
Introduction
चूहे प्रजनन संबंधी विकारों के लिए सबसे महत्वपूर्ण पशु मॉडल में से एक बने हुएहैं 1,2,3. डिम्बग्रंथि और गर्भाशय के कैंसर के कई आनुवंशिक रूप से संशोधित या प्रेरित कृंतक मॉडल हैं। ये अध्ययन आम तौर पर आकृति विज्ञान और पैथोलॉजिकल परिवर्तनों में अनुदैर्ध्य रुझानों को पकड़ने के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर इच्छामृत्यु के कई समूहों पर भरोसा करते हैं। यह एक व्यक्तिगत माउस में कैंसर के विकास पर निरंतर डेटा प्राप्त करने की क्षमता को रोकता है। इसके अतिरिक्त, व्यक्तिगत माउस रोग की प्रगति की स्थिति को जानने के बिना, हस्तक्षेप अध्ययन पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर आधारित होते हैं और एक विशिष्ट जानवर 4,5 में प्रगति का पता लगाने के लिए व्यक्तिगत थ्रेसहोल्ड के बजाय पिछले समूहों के औसत निष्कर्ष होते हैं। इसलिए, इमेजिंग दृष्टिकोण जो जीवित जानवरों में अनुदैर्ध्य मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, नई दवाओं या यौगिकों के परीक्षण के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल की सुविधा के लिए आवश्यक हैं और कठोरता और प्रजनन क्षमता को बढ़ाते हुए पैथोबायोलॉजी की समझ में तेजी लातेहैं।
अल्ट्रासाउंड इमेजिंग (यूएस) माउस गर्भाशय कैंसर की प्रगति की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए एक आकर्षक विधि है क्योंकि यह अन्य इमेजिंग विधियों की तुलना में अपेक्षाकृत आसान और सस्ती है, प्रदर्शन करना आसान है, और उल्लेखनीय संकल्प 6,7 हो सकता है। यह गैर-इनवेसिव साधन जागृत चूहों में माइक्रोन स्केल पर या 5-10 मिनट की परीक्षा का उपयोग करके संक्षिप्त बेहोशी के तहत चूहों के साथ सुविधाओं को पकड़ सकता है। अल्ट्रासाउंड माइक्रोस्कोपी को माउस डिम्बग्रंथि कूप विकास 8 और प्रत्यारोपित या प्रेरित नियोप्लासिया 9,10,11 के विकास को मापने के लिए एक विधि के रूप में मान्य किया गया है। उच्च आवृत्ति वाले यूएस का उपयोग पर्क्यूटेनियस अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन12 और एस्ट्रस चक्र13 में चूहे के गर्भाशय के परिवर्तन को देखने के लिए भी किया गया है। उच्च-आवृत्ति यूएस का उपयोग विशेष स्थिर प्लेटफार्मों पर चूहों के साथ किया जा सकता है जो मानकीकृत स्थिति और दबाव के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर करने के लिए ट्रांसड्यूसर / प्रोब को पकड़ने के लिए रेल प्रणाली का उपयोग करते हैं; हालांकि, यह उपकरण सभी संस्थानों में उपलब्ध नहीं है। हैंड-हेल्ड ट्रांसड्यूसर स्कैनिंग विधियों को कम समर्पित उपकरणों के साथ अपनाया जा सकता है और चूहों में नैदानिक निदान और अनुसंधान अनुप्रयोगों दोनों के लिए उपयोग किया जा सकता है।
सवाल यह है कि क्या कई हफ्तों में गर्भाशय के कैंसर के विकास की निगरानी के लिए हैंड-हेल्ड, उच्च-आवृत्ति जांच के साथ यूएस इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है। आंतों के समान, कृंतक गर्भाशय एक पतली दीवार वाली, पतली संरचना है जो पेट के भीतर बहुत गतिशील है और कई ऊतक गहराई के माध्यम से सन्निहित है, जिससे गुर्दे जैसे अपेक्षाकृत गतिहीन अंगों की तुलना में इमेजिंग अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाती है। इस अध्ययन ने अल्ट्रासाउंड और हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा देखे गए ऊतकों के बीच सहसंबंध स्थापित करने, माउस गर्भाशय का पता लगाने के लिए स्थलों को परिभाषित करने और एंडोमेट्रियल कैंसर के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन की व्यवहार्यता निर्धारित करने की मांग की। यह अध्ययन यूएस और हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा चित्रित यूटेरी की उपस्थिति के साथ-साथ कई हफ्तों में चूहों की सीरियल इमेजिंग के बीच गुणात्मक पत्राचार दिखाने वाले डेटा प्रस्तुत करता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि चूहों में एंडोमेट्रियल कैंसर के विकास की निगरानी के लिए हाथ से पकड़े गए यूएस का उपयोग किया जा सकता है, इस प्रकार समर्पित उपकरणों की आवश्यकता के बिना गर्भाशय के कैंसर का अध्ययन करने के लिए व्यक्तिगत माउस अनुदैर्ध्य डेटा एकत्र करने का अवसर पैदा होता है।
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Protocol
जॉन्स हॉपकिंस पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं और प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया था। सभी प्रक्रियाओं के लिए, उचित पीपीई पहना गया था, जिसमें दस्ताने और डिस्पोजेबल आइसोलेशन गाउन शामिल थे। शार्प्स को संभालते समय सावधानी बरती गई, जिन्हें उपयोग के तुरंत बाद लाल बॉक्स शार्प कंटेनरों में ठीक से निपटाया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. डॉक्सीसाइक्लिन के साथ आईपीएडी (इंड्यूसेबल पीटीएन, एरिड 1 ए डबल विलोपन) चूहों में एंडोमेट्रियल कैंसर का प्रेरण
- मिश्रित आनुवंशिक पृष्ठभूमि (129 S, BALB/C, C57BL/6) पर 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten डबल विलोपन (iPAD) ट्रांसजेनिक चूहों (चित्रा 1) को बनाए रखें, जैसा कि पहले वर्णित14 है।
- डॉक्सीसाइक्लिन उपचार से पहले प्रत्येक माउस के अंडाशय, डिंबवाहिनी और गर्भाशय की बेसलाइन अल्ट्रासाउंड (2 डी) छवियां एकत्र करें।
- जीन विलोपन को प्रेरित करने के लिए 7-8 सप्ताह की उम्र से शुरू होने वाले कम से कम 2 सप्ताह के लिए मादा आईपीएडी चूहों को विशेष रूप से डॉक्सीसाइक्लिन युक्त माउस चाउ आहार (625 मिलीग्राम / किग्रा फ़ीड पर डॉक्सीसाइक्लिन हाइक्लेट) प्रदान करें।
2. उपकरण सेटअप
- हीटिंग पैड चालू करें, और एक साफ शोषक पैड (लक्ष्य तापमान: 38 डिग्री सेल्सियस) के साथ कवर करें।
- पुष्टि करें कि आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र और ओ2 टैंक पर्याप्त रूप से भरे हुए हैं। यदि सामग्री कम है तो रिफिल करें और बदलें।
- प्रेरण कक्ष, नाक शंकु और मैला ढोने की प्रणाली को वेपोराइज़र से कनेक्ट करें।
- अल्ट्रासाउंड मशीन स्थापित करें।
- गर्भाशय या अंडाशय की इमेजिंग के लिए क्रमशः 32-56 मेगाहर्ट्ज या 70 मेगाहर्ट्ज तक की सीमा के साथ ट्रांसड्यूसर (जांच) का चयन करें।
- मशीन पर जांच, और शक्ति संलग्न करें।
- सिस्टम बूट-अप के बाद, उपयोगकर्ता क्रेडेंशियल्स के साथ लॉग इन करने और होम स्क्रीन तक पहुंचने के लिए नियंत्रण कक्ष का उपयोग करें।
- होम स्क्रीन से, एप्लिकेशन टैब पर जाएं, और माउस (छोटा) पेट मोड का चयन करें।
- होम स्क्रीन पर लौटने के लिए स्कैन पर क्लिक करें, और लाइव छवि प्रदर्शित होने की प्रतीक्षा करें।
- बाएं उपकरण पट्टी पर विकल्पों से बी-मोड का चयन करें।
- छवि शोधन के लिए अतिरिक्त उपकरण देखने के लिए अधिक नियंत्रण पर क्लिक करें, जैसे छवि लाभ और गहराई, या क्लिप अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए, जैसे कि प्रति सेकंड फ्रेम की संख्या।
- एक बार छवि सेटिंग्स का चयन करने के बाद, स्कैन पर क्लिक करके होम स्क्रीन पर लौटें।
- ओ2 टैंक चालू करें, प्रवाह को प्रेरण कक्ष में निर्देशित करें, और प्रवाह दर को 1 एल / मिनट पर सेट करें।
3. बालों को हटाने सहित अल्ट्रासाउंड स्क्रीनिंग के लिए चूहों की तैयारी
- प्रेरण कक्ष में एक माउस रखें। संज्ञाहरण के प्रेरण के लिए आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र को 2% -3% वॉल्यूम / वॉल्यूम पर सेट करें।
- पैर की अंगुली की चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी और 1-2 सांस / सेकंड के आसपास श्वसन दर द्वारा संज्ञाहरण की उचित गहराई निर्धारित करें।
- प्रत्येक आंख पर बाँझ नेत्र स्नेहक लागू करें। उचित आकार के क्लिपर्स के साथ अंतिम पसली और श्रोणि के बीच डोरसम और वेंट्रम से फर निकालें।
- छवि बनाने के लिए उदर और पृष्ठीय क्षेत्रों में डिपिलेटरी क्रीम की एक पतली परत लागू करें (यदि आवश्यक हो)।
- एनेस्थीसिया की उचित गहराई बनाए रखने के लिए माउस को लगभग 3-5 मिनट के लिए प्रेरण कक्ष में वापस रखें, जबकि डिपिलेटरी क्रीम बालों को हटाने के लिए काम करती है। ≤4 मिनट के बाद, धीरे से क्रीम को एक साफ नम पेपर तौलिया से पोंछ लें।
नोट: डेपिलेटरी क्रीम के लंबे समय तक संपर्क परेशान करने वाला होता है और त्वचा के घावों का कारण बन सकता है।
4. अंगों के बीच अंतर बढ़ाने के लिए तरल पदार्थ का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन
- बाँझ आइसोटोनिक द्रव समाधान (जैसे, बाँझ 0.9% NaCl या लैक्टेटेड रिंगर्स समाधान) से भरे 3-10 मिलीलीटर सिरिंज को हीटिंग पैड और अवशोषक पैड के बीच कई मिनट तक रखकर 35-40 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। यदि मशीन में वार्मर नहीं है तो हीटिंग पैड पर अल्ट्रासाउंड जेल की एक बोतल रखें।
- 20-25 ग्राम माउस के लिए, पेरिटोनियल गुहा में 1-2 एमएल घोल इंजेक्ट करें।
- वेंट्रम को उजागर करते हुए, माउस को एक हाथ में पकड़कर सुरक्षित करें।
- माउस को ~ 20 ° कोण पर पकड़ें, नाक को गुरुत्वाकर्षण के कारण अंगों को कपाल रूप से निर्देशित करने के लिए फर्श की ओर इशारा करें।
- एक छोटी गेज सुई (25 ग्राम, लंबाई में 5/8, ट्यूबरकुलिन सिरिंज) का उपयोग करके, पेट के पुच्छल दाएं चतुर्थांश की त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से पंचर करें।
- तरल पदार्थों के इंजेक्शन से पहले, वाहिका या जीआई पथ में इंजेक्शन से बचने के लिए, न्यूनतम दबाव के साथ वापस खींचें। यदि रक्त या अन्य सामग्री सिरिंज में प्रवेश करती है, तो सुई को हटा दें। एक नई सुई और सिरिंज का उपयोग करें, और थोड़ी अलग स्थिति में फिर से प्रयास करें।
- यदि इंजेक्शन के दौरान माउस जाग जाता है, तो इसे 2% -3% वॉल्यूम / वॉल्यूम आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण के लिए छोटे प्रेरण कक्ष में वापस रखें।
5. एक पृष्ठीय दृष्टिकोण से अल्ट्रासाउंड इमेजिंग।
- माउस को एक हीटिंग पैड (चित्रा 2 ए-सी) पर शोषक पैड पर वेंट्रल रिकंबेंसी में रखें।
- माउस की नाक और थूथन के ऊपर एक कृंतक नाक शंकु सुरक्षित रूप से रखें। 100% ओ 2 में 1% -2% वॉल्यूम / वॉल्यूम पर नाक शंकु के माध्यम से वितरित आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटिक गहराई बनाए रखें। प्रत्येक आंख पर आवश्यकतानुसार बाँझ नेत्र स्नेहक लागू करें।
- एक नियमित श्वसन दर (1-2 / एस) के लिए माउस की निगरानी करें और यह इंगित करने के लिए पैर की अंगुली पिंच प्रतिक्रिया की कमी है कि क्या संज्ञाहरण को समायोजित करने की आवश्यकता है।
- अंतिम पसली और श्रोणि के बीच, एनेस्थेटाइज्ड माउस के दोनों ओर रीढ़ की हड्डी में प्रीवार्म्ड अल्ट्रासाउंड जेल अबअक्षीय (पार्श्व) की एक छोटी मात्रा (~ 0.5-1 एमएल) रखें।
- अल्ट्रासाउंड जांच पर थोड़ी मात्रा में जेल डालें।
- प्रोब को रीढ़ की हड्डी के समानांतर कपाल की तरफ प्रोब के सामने रखें। उचित जांच अभिविन्यास को इंगित करने के लिए जांच सिर पर एक संकेतक चिह्न मौजूद है। एकत्र की जा रही छवियों के प्रत्येक नए सेट के लिए दिन, समय, पशु आईडी, जांच अभिविन्यास और पशु पक्ष (दाएं, बाएं, पृष्ठीय, उदर) रिकॉर्ड करें।
- वेंट्रल रिकंबेंसी में एक माउस के साथ (डोरसम त्वचा जांच को छूती है), धीरे-धीरे किडनी लैंडमार्क (चित्रा 2 बी और चित्रा 3) के लिए क्षेत्र को स्कैन करें। गुर्दे को ध्यान में रखते हुए, अंडाशय को खोजने के लिए जांच पुच्छल खींचें- एक बहुत ही हाइपरइकोइक अंडाकार से गोल संरचना (चित्रा 4 ए, बी) एक बहुत ही हाइपरकोइक डिम्बग्रंथि वसा पैड के भीतर जो गुर्दे द्वारा क्रानियो-उदर और पृष्ठीय पेट की दीवार से घिरा हुआ है।
नोट: अंडाशय के लिए दबाव पुच्छल और पार्श्व अंडाशय को पेट की दीवार के करीब और आंत के छोरों से दूर निर्देशित कर सकता है। अंडाशय शारीरिक रूप से पृष्ठीय पेट की दीवार के खिलाफ स्थित होता है, बस एपिक्सियल मांसपेशियों के लिए उदर और पार्श्व और गुर्दे के पुच्छल तक। - छवि कंट्रास्ट को बेहतर बनाने के लिए नियंत्रण स्क्रीन के निचले भाग में स्लाइडर का उपयोग करके सिग्नल गेन को समायोजित करें।
- गुर्दे की इमेजिंग में सुधार करने के लिए, विपरीत पेट पर उंगली से दबाव लागू करें। दबाव और कोण को सीधे रीढ़ के समानांतर ~ 20 ° वेंट्रल तक बदलें।
- एक बार रुचि का अंग देखने के बाद, सेव क्लिप या स्टार्ट रिकॉर्डिंग पर क्लिक करके एक वीडियो एकत्र करें और फिर फ्रेम की पूर्व निर्धारित संख्या पर छवियों को बनाए रखने के लिए रिकॉर्डिंग बंद करें।
- एकल फ्रेम को लाइव छवि से सहेजें या फ्रेम सहेजें बटन के साथ रिकॉर्डिंग करें।
- गर्भाशय की छवि बनाने के लिए, जांच को पुच्छल रूप से खींचें जब तक कि अंडाशय दृश्य के क्षेत्र के सबसे कपाल पहलू में न हो। जब तक गर्भाशय दिखाई न दे तब तक जांच दबाव और कोण को बदलें।
- रुचि के प्रत्येक अंग के लिए वीडियो और फ्रेम संग्रह दोहराएं।
- पृष्ठीय पेट की दीवार के साथ अनुदैर्ध्य रूप से चलने वाले गर्भाशय का पता लगाएं, जिसमें पार्श्व पैर की मांसलता भी दिखाई दे (चित्र 4बी)।
नोट: गर्भाशय का आकार और लुमेन व्यास एस्ट्रस और रोग की स्थिति के चरण के साथ भिन्न हो सकता है। - गर्भाशय के स्थिर सींगों से आंतों के लूप को अलग करने के लिए पेरिस्टाल्टिक गति के लिए ऊतक की निगरानी करें।
6. एक उदर दृष्टिकोण से छवियों को एकत्र करें
- माउस को पृष्ठीय पुनरावृत्ति में रखें, और जांचें कि आंख स्नेहन पर्याप्त है और थूथन नाक शंकु में सुरक्षित रूप से है (चित्रा 2 ए)।
- उदर पेट पर प्रीवार्मअल्ट्रासाउंड जेल की एक छोटी मात्रा (~ 0.5-1 एमएल) लागू करें, और मूत्राशय को हाइपोइकोइक लैंडमार्क के रूप में खोजने के लिए प्यूबिस के मध्य रेखा पर जांच लागू करें (चित्रा 5)।
नोट: यदि मूत्राशय बहुत बड़ा है और गर्भाशय इमेजिंग को अस्पष्ट करता है, तो मूत्र व्यक्त करने के लिए निचले पेट पर कोमल दबाव रखा जा सकता है। - गर्भाशय के सींग ों को खोजने के लिए मूत्राशय के पार्श्व में जांच खींचें। सींग को दृश्य के क्षेत्र में लाने के लिए माउस के दोनों किनारों से हल्का डिजिटल दबाव लागू करें। माउस के लंबवत जांच पकड़ें, और दोनों सींगों के अनुप्रस्थ दृश्यों (क्रॉस-सेक्शन) को पकड़ने के लिए पेट के दोनों किनारों को स्कैन करें। धनु दृश्यों को कैप्चर करने के लिए प्रोब को घुमाएं।
- अल्ट्रासाउंड के बाद, एक पेपर टॉवल के साथ जेल के माउस को साफ करें, और इसे ठीक करने के लिए अपने पिंजरे में वापस कर दें। चूहे 2-5 मिनट में पूरी तरह जाग जाते हैं। एक बार जब यह पूरी तरह से जागृत और एम्बुलेटरी हो जाता है, तो माउस को पशु के कमरे में वापस कर दें।
नोट: वसूली के लिए पिंजरे को गर्म करने के लिए कम गर्मी पर एक हीटिंग पैड को पिंजरे के नीचे रखा जा सकता है। - प्रयोगात्मक या मानवीय समापन बिंदु पर, माउस को इच्छामृत्यु दें। आदर्श रूप से, तनाव को कम करने के लिए घर के पिंजरे में माउस को इच्छामृत्यु करें; वैकल्पिक रूप से, माउस को एक साफ कक्ष में रखें। प्रति मिनट कक्ष की मात्रा के 10% -30% की विस्थापन दर पर दबाव वाले सीओ2 वितरित करें। लगभग 5 मिनट के बिना कोई श्वसन दिखाई देने के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मृत्यु की पुष्टि करें। ट्यूमर की फसल के लिए पेट की नेक्रोपसी के साथ आगे बढ़ें।
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Representative Results
पैक्स 8-क्रे-एरिड1ए-पीटीएन डबल विलोपन (आईपैड) ट्रांसजेनिक चूहों को मिश्रित आनुवंशिक पृष्ठभूमि (129 एस, बीएएलबी / सी, सी 57 बीएल / 6) पर बनाए रखा गया था, जैसा कि पहले वर्णित14 था। चूहों को क्रे रिकोम्बिनेस को प्रेरित करने के लिए 2 सप्ताह के लिए डॉक्सीसाइक्लिन फ़ीड खिलाया गया था। हमारे समूह द्वारा पिछले काम में, डॉक्सीसाइक्लिन को गैवेज14 द्वारा खुराक दी गई थी; हालांकि, इस वर्तमान अध्ययन में, डॉक्सीसाइक्लिन फ़ीड प्रेरण विधि ने कुशलता से काम किया और चूहों के लिए गैवेज के तनाव को कम किया। यह जांचना महत्वपूर्ण है कि डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन विधि पैक्स 8-व्यक्त कोशिकाओं जैसे गर्भाशय में ट्यूमर सप्रेसर्स (एरिड 1 ए और पीटीईएन) के लिए डीएनए को बढ़ाने के लिए आवश्यक क्रे रिकोम्बिनेस अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। एआरआईडी 1 ए और पीटीईएन14 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया था कि पड़ोसी स्ट्रोमल ऊतक की तुलना में गर्भाशय उपकला कोशिकाओं में पर्याप्त ट्यूमर शमन प्रोटीन हानि पूरी हुई थी या नहीं, जैसा कि चित्रा 6 में देखा गया है। माउस मॉडल और ट्यूमर शमन अभिव्यक्ति विनियमन का योजनाबद्ध चित्र 1 में प्रस्तुत किया गया है।
डॉक्सीसाइक्लिन के 2 सप्ताह के बाद, डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन से पहले नियंत्रण या एक ही माउस की छवि की तुलना में गर्भाशय आकार में काफी बदलाव नहीं हुआ। फिर भी, डॉक्सीसाइक्लिन के बाद अगले 2-6 हफ्तों में, अल्ट्रासाउंड से पता चला कि चूहों ने गर्भाशय विकृति की एक श्रृंखला विकसित की, जो हाइपरप्लासिया से शुरू हुई और एडेनोकार्सिनोमा में प्रगति हुई। चित्रा 7 ए, बी डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के 3 सप्ताह के बाद देखे गए शुरुआती विकृति परिवर्तनों के साथ माउस गर्भाशय की अमेरिकी छवियों को दर्शाता है। चित्रा 7 सी, डी चित्र 7 ए, बी में चित्रित एक ही गर्भाशय की सकल विकृति और हिस्टोपैथोलॉजी को दर्शाता है जब माउस को 3 सप्ताह में इमेजिंग के तुरंत बाद इच्छामृत्यु दी गई थी। छोटे (लेकिन पतले) पतली-दीवार वाले गर्भाशय और प्रारंभिक एंडोमेट्रियल हाइपरप्लासिया को अलग-अलग लुमेन (केंद्रीय हाइपरोइक गर्भाशय द्रव) के संरक्षण के साथ देखा जा सकता है। बाद के समय में इच्छामृत्यु किए गए चूहों में, गर्भाशय बहुत बड़ा था, एक छोटा लुमेन था, और एक मोटी दीवार थी (चित्रा 8 और चित्रा 9)। हाइपरप्लास्टिक एंडोमेट्रियम में पतला लुमेन और सूक्ष्म परिवर्तन के उदाहरणों की तुलना चित्र 8 और चित्रा 9 में गर्भाशय में घने ऊतक और गांठदार कैंसर के विकास से की जाती है। अल्ट्रासाउंड और सकल छवियां सभी प्रतिनिधित्व वाले चूहों के लिए एक दूसरे के साथ अत्यधिक सुसंगत थीं। चित्रा 9 एक समय पाठ्यक्रम अध्ययन में एक ही माउस से कई गर्भाशय छवियों को प्रस्तुत करता है और एडेनोकार्सिनोमा विकसित होने के रूप में 6 सप्ताह में देखे गए रूपात्मक परिवर्तनों को दर्शाता है। चित्रा 5 हाइपोइकोइक मूत्राशय से सटे गर्भाशय के सींगों के क्रॉस-सेक्शन के साथ एक उदर दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है।
पेट में कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए, इमेजिंग से पहले सीधे पेट की गुहा में खारा इंजेक्ट करने से गर्भाशय और अंडाशय सहित पेट के अंगों के विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार हुआ। चित्रा 3 1 एमएल खारा के इंजेक्शन से पहले और बाद में एक ही माउस से अल्ट्रासाउंड तुलना दिखाता है। खारा के साथ, अंगों के बीच एक बढ़ी हुई हाइपोइकोइक स्पेस (काला) था जो गुर्दे, वसा पैड, अंडाशय, गर्भाशय के सींग, आंतों और प्लीहा को एक दूसरे से अधिक आसानी से व्यक्तिगत होने की अनुमति देता था। यहां प्रस्तुत अन्य सभी आंकड़ों में, छवि स्पष्टता में सुधार के लिए इमेजिंग से पहले खारा इंजेक्शन किया गया था।
एक साथ लिया गया, इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि यह इंड्यूसेबल माउस मॉडल 6 सप्ताह की अवधि में एडेनोकार्सिनोमा विकसित करता है और बेसलाइन स्थापित करने और कैंसर विकसित होने पर गर्भाशय में रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए अल्ट्रासाउंड के साथ निगरानी की जा सकती है। यहां, यह प्रदर्शित किया गया है कि गैर-इनवेसिव अल्ट्रासाउंड एक माउस में गर्भाशय के सींगों को कई हफ्तों में उन छवियों के साथ क्रमिक रूप से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है जो वास्तविक गर्भाशय रोग संबंधी परिवर्तनों की भविष्यवाणी करते हैं।
चित्रा 1: पैक्स 8-क्रे इंड्यूसेबल डबल केओ ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी के लिए रणनीति। (ए) पैक्स 8-व्यक्त गर्भाशय उपकला कोशिकाओं में रिवर्स टेट्रासाइक्लिन-नियंत्रित ट्रांसएक्टिवेटर (आरटीटीए) के संवैधानिक उत्पादन के परिणामस्वरूप टेट्रासाइक्लिन, या इसके एनालॉग डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में क्रे रिकोम्बिनेस का इंड्यूसेबल सक्रियण होता है, जो टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्वों (टीआरई) से बंधकर होता है। एक्सॉन 8 (एरिड 1 ए) और एक्सॉन 5 (पीटीईएन) के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में स्थित फ्लोक्स साइटों को क्रे रिकॉम्बिनेस द्वारा लक्षित किया जाता है। एरिड 1 ए में एक्सॉन 8 के सीआरई-लक्षित विलोपन के परिणामस्वरूप एक फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन और एक प्रारंभिक स्टॉप कोडन (p.Gly809Hisfs * 6) होता है। Pten में एक्सॉन 5 के क्रे-लक्षित विलोपन के परिणामस्वरूप एक फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन (p.Val85Glyfs * 14) होता है। (बी) पैक्स 8-आरटीटीए माउस पैक्स 8 प्रमोटर के नियंत्रण में एक रिवर्स टेट्रासाइक्लिन-नियंत्रित ट्रांसएक्टिवेटर (आरटीटीए) व्यक्त करता है। इस माउस को टेटो-क्रे माउस के साथ पार किया जाता है जो टेट्रासाइक्लिन-निर्भर तरीके से क्रे रेकोम्बिनेस को व्यक्त करता है। इस क्रॉसिंग से संतान एक टेट्रासाइक्लिन (या डॉक्सीसाइक्लिन) -सक्रिय क्रे रिकोम्बिनेस को व्यक्त करती है जो पैक्स 8-व्यक्त गर्भाशय उपकला कोशिकाओं (पैक्स 8-क्रे ट्रांसएक्टिवेटर) के लिए विशिष्ट है। (ग) 129एस1 पृष्ठभूमि पर एरिड1ए फ्लोक्स/फ्लोक्स चूहों को बीएएलबी/सी पृष्ठभूमि (स्ट्रेन सी;129एस4-पीटीईएनटीएम1एचडब्ल्यूयू/जे) पर प्टेन फ्लोक्स/फ्लोक्स के साथ पार किया गया ताकि एरिड1ए फ्लोक्स/फ्लोक्स/प्टेनफ्लोक्स/फ्लोक्स ट्रांसरेस्पोन्डर माउस उत्पन्न किया जा सके। (डी) पैक्स 8-क्रे ट्रांसएक्टिवेटर माउस को एरिड 1 ए फ्लोक्स / फ्लोक्स / प्टेनफ्लोक्स / फ्लोक्स ट्रांसरेस्पोन्डर माउस के साथ पार किया जाता है। इस क्रॉसिंग से संतान के परिणामस्वरूप एक ट्रांसजेनिक मुराइन मॉडल होता है जिसमें गर्भाशय उपकला कोशिकाओं के लिए विशिष्ट डॉक्सीसाइक्लिन इंड्यूसेबल एरिड 1 ए और पीटीएन विलोपन (आईपैड) होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: इमेजिंग प्रक्रिया । (ए) पेट और पृष्ठीय फर के साथ एक एनेस्थेटाइज्ड माउस को क्लिपर और डिपिलेटरी क्रीम के साथ हटा दिया जाता है। माउस को नाक शंकु के माध्यम से इनहेलेंट आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया पर बनाए रखा जाता है और एक शोषक पैड के साथ कवर किए गए हीट पैड पर रखा जाता है। (बी) माउस पर और जांच पर रुचि के क्षेत्र में प्रीवार्मअल्ट्रासाउंड जेल की एक छोटी मात्रा रखी जाती है। यहां, माउस वेंट्रल रिकंबेंसी में है, और गुर्दे का पता लगाने के लिए जांच को सही ढंग से रखा गया है, शारीरिक मील का पत्थर सीधे अंडाशय के लिए कपाल है। (सी) पृष्ठीय पुनरावृत्ति में, गर्भाशय के सींगों के अनुमानित स्थान का पता लगाने के लिए पहले मूत्राशय जैसे स्थलों को खोजने के लिए जांच को मैन्युअल रूप से हेरफेर किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: खारा के इंजेक्शन द्वारा दृश्यता और अंग परिभाषा में सुधार। (ए) गर्म, बाँझ खारा के 1.5 एमएल के आईपी इंजेक्शन से पहले एक गुर्दे और जीआई पथ (नीचे बाएं) के लूप की छवि। छवि का बाईं ओर गुर्दे के लिए कपाल है। (बी) खारा इंजेक्शन के बाद गुर्दे की छवि, अंगों के बीच बढ़ी हुई (हाइपोइकोइक स्थान, काला) दिखाती है। दोनों छवियों के लिए, अभिविन्यास के संदर्भ में, माउस पृष्ठीय सतह ऊपर है, और कपाल से पुच्छल बाएं से दाएं है। (C, D) हाइलाइट किए गए लाल खंड में ए और बी में प्रस्तुत 2 डी छवियों में गुर्दे के स्थलों को दिखाया गया है। तस्वीरें MS550 ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके ली गई थीं। स्केल बार = प्रत्येक छवि में 2 मिमी। संक्षेप: जीआई पथ = जठरांत्र संबंधी मार्ग; आईपी = इंट्रापरिटोनियल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: स्थलों के साथ प्रजनन पथ । (ए) अंडाशय (तीर) गुर्दे के पुच्छल ध्रुव के तुरंत पुच्छल पर स्थित होता है। (बी) गर्भाशय का सींग (संकीर्ण तीर) गहरा होता है और समीपस्थ हिंदलिम्ब (तीर) की पृष्ठीय मांसपेशियों के लिए कपाल शुरू होता है, अंडाशय भी देखने में (बड़ा तीर) होता है। स्केल बार = 2 मिमी। सभी छवियों के लिए, अभिविन्यास के संदर्भ में, माउस पृष्ठीय सतह ऊपर है, और कपाल से पुच्छल बाएं से दाएं है। तस्वीरें MS550 ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके ली गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: गर्भाशय के सींग और मूत्राशय पृष्ठीय पुनरावृत्ति से चित्रित। कैंसर प्रेरण से पहले दो चूहों से अल्ट्रासाउंड छवियां। (ए) मूत्राशय लुमेन एक हाइपरइकोइक म्यूकोसा के साथ एक हाइपोइकोइक, ओवॉइड संरचना के रूप में दिखाई देता है। दोनों गर्भाशय के सींग एक साथ दिखाई देते हैं, जिनमें से प्रत्येक की सीमाएं हल्के नीले रंग में होती हैं। (बी) एक बहुत पूर्ण मूत्राशय के साथ एक और माउस में एक ही दृश्य। दोनों छवियों के लिए, अभिविन्यास के संदर्भ में, माउस उदर सतह ऊपर है, और बाईं ओर की छवि माउस बाईं ओर है। प्रत्येक गर्भाशय सींग की सीमाएं हल्के नीले रंग में खींची जाती हैं, जिसमें पड़ोसी टेक्स्ट बॉक्स (एमएस 550 ट्रांसड्यूसर) में दिए गए क्षेत्र होते हैं। स्केल बार = 3 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: एक आईपीएडी माउस में प्रेरण के 6 सप्ताह बाद गर्भाशय के वर्गों के एच एंड ई और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के उदाहरण। (ए) आईपीएडी माउस गर्भाशय ऊतक के प्रतिनिधि एच एंड ई। (बी) प्रतिनिधि एआरआईडी 1 ए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। धुंधलापन गर्भाशय स्ट्रोमल कोशिकाओं (सफेद तीर) के नाभिक में एरिड 1 ए के प्रतिधारण के साथ पैक्स 8-व्यक्त गर्भाशय उपकला कोशिकाओं (काला तीर) के नाभिक के लिए विशिष्ट एरिड 1 ए के नुकसान को दर्शाता है। (सी) प्रतिनिधि पीटीईएन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। धुंधलापन पैक्स 8-व्यक्त गर्भाशय उपकला कोशिकाओं (काला तीर) के साइटोप्लाज्म में पीटीईएन के नुकसान को दर्शाता है, गर्भाशय स्ट्रोमल कोशिकाओं (सफेद तीर) के साइटोप्लाज्म में पीटीईएन के प्रतिधारण के साथ। विस्तृत आईएचसी विधियों को पहले प्रकाशित किया गयाहै 14. स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: iPad = इंड्यूसेबल Pten, Arid1a डबल विलोपन; एच एंड ई = हेमटोक्सीलिन और ईओसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: पैथोलॉजी में शुरुआती परिवर्तन के साथ चूहों से अल्ट्रासाउंड छवियों के उदाहरण। (ए, बी) गर्भाशय के तरल पदार्थ से भरे गर्भाशय की एंटीमॉर्टम अल्ट्रासाउंड छवि जो स्वाभाविक रूप से हाइपरइकोइक है संकीर्ण तीर गर्भाशय के हाइपोइकोइक, पतला लुमेन का संकेत देते हैं। तीर गर्भाशय की दीवार के मोटे क्षेत्र को इंगित करता है। (सी) बी में चित्रित माउस से पूरे गर्भाशय की सकल छवि। सफेद तारांकन मोटे तौर पर उसी स्थान पर है जैसा कि ए में चित्रित किया गया है। (D) इसी माउस में, गर्भाशय को संसाधित किया गया और H & E से दाग दिया गया। हिस्टोलॉजी अनुभाग एंडोमेट्रियल हाइपरप्लासिया के कारण गर्भाशय की दीवार का मोटा होना दिखाता है; उदाहरण क्षेत्र को तीर के साथ इंगित किया गया है। सभी अमेरिकी छवियों के लिए, अभिविन्यास के संदर्भ में, माउस पृष्ठीय सतह ऊपर है, और कपाल से पुच्छल बाएं से दाएं (एमएस 550 ट्रांसड्यूसर) है। स्केल बार = (ए, बी) 3 मिमी; (डी) 500 μm. संक्षेप: यूएस = अल्ट्रासाउंड; एच एंड ई = हेमटोक्सीलिन और ईओसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 8: अल्ट्रासाउंड द्वारा दिखाई देने वाले गर्भाशय विकृति की विविधता । (ए) हाइपरप्लासिया और द्रव विघटन के साथ एक गर्भाशय जो ल्यूमिनल फैलाव को ~ 2.5 मिमी के व्यास तक ले जाता है। (बी) हाइपरप्लासिया के साथ एक दूसरा गर्भाशय जो अधिक डिग्री तक विकृत हो जाता है। (सी) एक गर्भाशय जो पतला और नरम ऊतक द्रव्यमान से भरा होता है। स्केल बार = 3 मिमी। सभी छवियों के लिए, तीर गर्भाशय के सींग के उदर पक्ष में होते हैं, और छवि अभिविन्यास के संदर्भ में, माउस पृष्ठीय सतह ऊपर होता है, और कपाल से पुच्छल बाएं से दाएं (एमएस 550 ट्रांसड्यूसर) होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 9: एक माउस में समय के साथ गर्भाशय के नियोप्लास्टिक विकास में परिवर्तन। (ए) एक आईपीएडी माउस की अल्ट्रासाउंड छवि जिसमें गुर्दे (व्यापक तीर), अंडाशय (पुच्छल से गुर्दे), और गर्भाशय (संकीर्ण तीर), जिसमें पैर की मांसपेशी भी दिखाई देती है (तीर), तीन समय बिंदुओं पर कैप्चर की गई: माउस को डॉक्सीसाइक्लिन आहार (सप्ताह 0) पर शुरू करने के बाद, और फिर 5 सप्ताह और 6 सप्ताह के बाद। डॉक्सीसाइक्लिन ने ट्यूमर शमन हानि के साथ सीआरई अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, जो समय के साथ एंडोमेट्रियल कैंसर को बढ़ावा देता है। (बी) ए के समान अल्ट्रासाउंड छवियां लेकिन गर्भाशय के सींग के साथ लाल रंग में हाइलाइट की गई हैं। (सी) 6 सप्ताह के समय बिंदु से सीटू (संकीर्ण तीर) में गर्भाशय की सकल छवियां; ऊतक को उदर सतह से देखा जाता है। (डी) सी में विच्छेदित पूर्व विवो के समान गर्भाशय; ऊतक को उदर सतह से देखा जाता है। (ई) गर्भाशय द्रव्यमान (एच एंड ई दाग) की हिस्टोलॉजी, इस उदाहरण से एडेनोकार्सिनोमा का संकेत देती है। ए और बी के लिए, अभिविन्यास के संदर्भ में, माउस पृष्ठीय सतह ऊपर है, और कपाल से पुच्छल बाएं से दाएं (एमएस 550 ट्रांसड्यूसर) है। स्केल बार = (ए, बी, प्रत्येक पंक्ति में पहली दो छवियां) 1 मिमी; (ए, बी, तीसरी छवि) 2 मिमी; (ई) 500 μm. संक्षेप: iPad = इंड्यूसेबल Pten, Arid1a डबल विलोपन; एच एंड ई = हेमटोक्सीलिन और ईओसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल चूहों में गर्भाशय में एडेनोकार्सिनोमा की प्रगति में गर्भाशय रूपात्मक परिवर्तनों का आकलन करने के लिए अल्ट्रासाउंड की उपयोगिता की जांच करता है। इस अध्ययन में, चूहों में अनुदैर्ध्य रूप से एंडोमेट्रियल कैंसर के प्रेरण का पालन करके, अल्ट्रासाउंड द्वारा पता लगाए गए शारीरिक विवरण सकल और हिस्टोलॉजिकल पैथोलॉजी के संकेतक पाए गए। यह चूहों में गर्भाशय के कैंसर की प्रगति का पालन करने के लिए कई समय बिंदुओं पर अल्ट्रासाउंड द्वारा निगरानी किए गए चूहों की छोटी संख्या के साथ अनुदैर्ध्य अध्ययन के उपयोग के लिए दरवाजा खोलता है। यह अनुदैर्ध्य पता एक हाथ से पकड़े गए जांच का उपयोग करके और रेल प्रणाली अल्ट्रासाउंड उपकरण के उपयोग के बिना पूरा किया गया था। उपयोग किए जाने वाले उच्च आवृत्ति जांच (ट्रांसड्यूसर) व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, जिससे यह दृष्टिकोण दुनिया भर के कई संस्थानों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में प्रयोग के लिए आवश्यक रिज़ॉल्यूशन के स्तर के लिए सही जांच का उपयोग करना और अल्ट्रासाउंड से पहले इमेजिंग के लिए माउस तैयार करना शामिल है।
माउस तैयार करने में महत्वपूर्ण कदम अध्ययन क्षेत्रों से सभी बालों को हटा रहे हैं और पेरिटोनियल गुहा में तरल पदार्थ इंजेक्ट कर रहे हैं। त्वचा पर छोड़े गए फर से अल्ट्रासाउंड जेल में बुलबुले फंस सकते हैं, जो छवियों में कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं; इसलिए, अध्ययन क्षेत्र में समान रूप से बालों को हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। बालों को हटाने के लिए डेपिलेटरी क्रीम को विधि के रूप में चुना गया था क्योंकि यह त्वचा में समान रूप से फर को हटा देता है। त्वचा को चोट लग सकती है यदि क्रीम को अत्यधिक समय (>3-4 मिनट) के लिए त्वचा पर छोड़ दिया जाता है। डिपिलेटरी क्रीम के प्रति अधिक संवेदनशील चूहों में, बालों को हटाने के लिए क्रीम को केवल 1-2 मिनट के लिए त्वचा पर छोड़ दिया जाना चाहिए। इसके बाद, क्रीम को पूरी तरह से हटाने के लिए माउस को गीले पेपर तौलिए की एक श्रृंखला से पोंछा जाना चाहिए। अध्ययन क्षेत्र से सभी बालों को हटा दिए जाने के बाद, बाँझ, गर्म आइसोटोनिक तरल पदार्थ इंट्रापरिटोनियल गुहा में इंजेक्ट किए जाते हैं ताकि कंट्रास्ट को बढ़ाया जा सके और पेट के अंगों की सीमाओं को परिभाषित करने में सहायता मिल सके। इस अध्ययन में, 1-2 एमएल तरल पदार्थ इंजेक्ट करना अंडाशय, डिंबवाहिनी और गर्भाशय के सींगों को अलग करने के लिए पर्याप्त था। द्रव धीरे-धीरे अवशोषित होता है, और इमेजिंग से तुरंत पहले इंजेक्शन लगाना सबसे अच्छा है। चूहे आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत तेजी से हाइपोथर्मिक हो जाते हैं। इसे गर्म खारा इंजेक्ट करके (हीटिंग पैड पर सिरिंज में संग्रहीत) और माउस को हीटिंग पैड पर रखकर और संभव होने पर अल्ट्रासाउंड जेल को प्रीवार्मिंग करके रोका जा सकता है। अनुभवी सोनोग्राफरों के साथ इमेजिंग सत्र 5-10 मिनट / माउस पर चलते हैं, और इस कम समय के साथ, महत्वपूर्ण हाइपोथर्मिया नहीं हुआ। यदि आवश्यक हो, तो अंगों के अधिक पृथक्करण के लिए पेट में अतिरिक्त 2 मिलीलीटर तक खारा इंजेक्ट किया जा सकता है।
यहां वर्णित विधियों का उद्देश्य अल्ट्रासाउंड मशीन और जांच (ओं) से परे विशेष उपकरणों के बिना आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना है। प्रस्तुत विधि में, जांच को रेल प्रणाली से सहायता के बिना मैन्युअल रूप से हेरफेर किया जाता है। यह मैनुअल विधि तेज है और छोटी विशेषताओं को उजागर करने के लिए लागू कोणों और दबाव में बहुत लचीलापन प्रदान करती है। पेट पर जांच को मैन्युअल रूप से निर्देशित करना और कम-रिज़ॉल्यूशन ट्रांसड्यूसर का उपयोग रेल सिस्टम4 पर तय ट्रांसड्यूसर से छवियों की तुलना में प्राप्त किसी भी व्यक्तिगत छवियों की गुणवत्ता को सीमित कर सकता है। एक रेल प्रणाली गर्भाशय (भ्रूण में) या इंट्राकार्डियक इंजेक्शन में इंजेक्शन के लिए उपयोगी होगी जब अधिक स्थिरता की आवश्यकता होती है। हालांकि, विशेष अल्ट्रासाउंड सुविधाओं की कमी वाले संस्थानों की विस्तृत श्रृंखला के लिए न्यूनतम हेरफेर समय और बढ़ी हुई पहुंच के बारे में एक व्यापार-बंद है। इस सरलीकृत विधि की सफलता इस बात का उदाहरण है कि अल्ट्रासाउंड का उपयोग कई अध्ययनों के लिए कैसे किया जा सकता है। प्रस्तावित विधि समर्पित उपकरणों की आवश्यकता के बिना गर्भाशय के कैंसर मॉडल में अनुदैर्ध्य ऊतक परिवर्तनों को पकड़ने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और इसे अन्य प्रगतिशील रोग मॉडल पर लागू किया जा सकता है। इमेजिंग के दौरान चूहों के मैनुअल हेरफेर सटीक ऊतक गहराई और स्थान में परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैं, लेकिन इन कारकों पर भरोसा नहीं करने वाले अध्ययनों के लिए, छवि की गुणवत्ता पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त है।
इमेजिंग के दौरान वीडियो को सहेजना महत्वपूर्ण है; बाद में उपयोगकर्ता के वर्कस्टेशन पर, वीडियो को किसी भी फ्रेम पर रोका जा सकता है जो शरीर रचना का प्रतिनिधि है जिसे कैप्चर और मापने की आवश्यकता है। अंगों की छवियों को मापा जा सकता है (व्यास, परिधि, या लंबाई) (चित्रा 5, गर्भाशय सींग क्रॉस-सेक्शन मापा जाता है), और ट्यूमर क्षेत्र की गणना की जा सकती है। वीडियो, एकल फ्रेम से अधिक, अधिक शारीरिक संदर्भ में अंगों की पहचान की सुविधा प्रदान करते हैं। वीडियो छोटी और बड़ी आंतों की गति को निर्धारित करने के लिए भी उपयोगी हैं, जो आंतों को गर्भाशय से अलग करने में मदद कर सकते हैं। उच्च गुणवत्ता वाली छवियां प्राप्त करना माउस शरीर रचना विज्ञान के साथ परिचितता पर भी निर्भर करता है। मूवेबल गर्भाशय बनाम इमेजिंग के लिए अधिक स्थिर ऊतकों (जैसे, एक प्रत्यारोपित जेनोग्राफ्ट ट्यूमर, अंडाशय), मैनुअल विधि का उपयोग करके समीपस्थ से डिस्टल तक गर्भाशय के सींगों को स्कैन करने और उनका पालन करने का लाभ होता है। स्कैनिंग के दौरान, सींग का पालन करने के लिए हाथ के कोणों के क्रमिक समायोजन का उपयोग किया जा सकता है। एमएस 550 जांच का उपयोग इस अध्ययन में सभी इमेजिंग के लिए किया गया था और उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस 700 जांच की तुलना में गर्भाशय के लिए बेहतर है, जो अंडाशय के लिए बेहतर है। माउस थायरॉयड की छवि बनाने के लिए एमएस 700 का उपयोग करने का काम हाल ही में प्रकाशित किया गया है, जो अन्य ऊतकों में संभव उच्च रिज़ॉल्यूशन को दर्शाताहै। अंडाशय और मूत्राशय के बीच गर्भाशय की ऊतक गहराई की अलग-अलग डिग्री के कारण हैंड-हेल्ड प्रोब इमेजिंग सहायक होती है। इस काम में, आसानी से पहचाने जाने वाले शारीरिक स्थलों, जैसे कि गुर्दे और समीपस्थ हिंद-अंग शरीर रचना विज्ञान के बीच आगे बढ़ने से शरीर पर पृष्ठीय पहलू से गर्भाशय की इमेजिंग करते समय विभिन्न समय बिंदुओं पर तुलनीय छवियों को कैप्चर करने में सहायता मिली।
ट्यूमरजेनिसिस के दौरान समय के साथ गर्भाशय में शारीरिक परिवर्तनों का पालन करने के लिए यह उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रासाउंड विधि वर्तमान तरीकों से बेहतर है जिसमें अलग-अलग समय बिंदुओं पर कई समूहों से जानवरों को यूथेनाइज़ करना शामिल है। अल्ट्रासाउंड मॉडल को परिष्कृत करता है और प्रयोग के लिए आवश्यक चूहों की संख्या को कम करता है, इस प्रकार लागत और समय को कम करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि व्यक्तिगत स्तर पर रोग की प्रगति का पालन करने की अनुमति देती है, जिससे अंतर्दृष्टि हो सकती है जो रोग के चरण के बजाय समय बिंदु द्वारा बलिदान किए गए समूहों पर निर्भर अध्ययनों में छिपी हुई है। इसकी गैर-आक्रामक प्रकृति के कारण, माउस अल्ट्रासाउंड में गर्भाशय या डिम्बग्रंथि के कैंसर में अनुसंधान के लिए कई संभावित अनुप्रयोग हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम एनसीआई डिम्बग्रंथि के कैंसर बीजाणु कार्यक्रम पी 50 सीए 228 9 9 1, पोस्ट-डॉक्टरेट प्रशिक्षण कार्यक्रम 5 टी 32 ओडी 011089 और रिचर्ड डब्ल्यू टेलिंडे एंडोमेंट, जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय से वित्त पोषण के लिए आभारी हैं। परियोजना को आंशिक रूप से जापान के निजी स्कूलों के लिए संवर्धन और पारस्परिक सहायता निगम से उच्च शिक्षा के निजी संस्थानों को वर्तमान व्यय के लिए सब्सिडी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
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- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
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- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
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