Summary
Bu protokol, endometriyal kanserin indüklenebilir bir fare modelinde, brüt ve histolojik değişikliklerle korelasyonlu ultrason görüntüleme kullanarak uterusta morfolojik değişikliklerin zaman içindeki ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır.
Abstract
Rahim kanserleri, bu modellerde kullanım kolaylığı ve genetik manipülasyon nedeniyle farelerde incelenebilir. Bununla birlikte, bu çalışmalar genellikle farklı kohortlarda birden fazla zaman noktasında ötenazi yapılan hayvanlarda ölüm sonrası patolojiyi değerlendirmekle sınırlıdır, bu da bir çalışma için gereken fare sayısını arttırır. Uzunlamasına çalışmalarda fareleri görüntülemek, bireysel hayvanlarda hastalığın ilerlemesini izleyebilir ve ihtiyaç duyulan fare sayısını azaltabilir. Ultrason teknolojisindeki ilerlemeler, dokulardaki mikrometre seviyesindeki değişikliklerin tespit edilmesini sağlamıştır. Ultrason, yumurtalıklarda folikül olgunlaşmasını ve ksenogreft büyümesini incelemek için kullanılmıştır, ancak fare uterusundaki morfolojik değişikliklere uygulanmamıştır. Bu protokol, indüklenmiş endometriyal kanser fare modelinde patolojinin in vivo görüntüleme karşılaştırmaları ile yan yana gelmesini inceler. Ultrason ile gözlenen özellikler, brüt patoloji ve histoloji tarafından görülen değişim derecesi ile tutarlıydı. Ultrasonografinin, gözlenen patolojinin oldukça prediktif olduğu ve ultrasonografinin farelerde kanser gibi uterus hastalıklarının uzunlamasına çalışmalarına dahil edilmesini desteklediği bulunmuştur.
Introduction
Fareler üreme bozuklukları için en önemli hayvan modellerinden biri olmaya devam etmektedir 1,2,3. Yumurtalık ve rahim kanserlerinin genetiği değiştirilmiş veya indüklenmiş birkaç kemirgen modeli vardır. Bu çalışmalar tipik olarak, morfolojik ve patolojik değişikliklerdeki uzunlamasına eğilimleri yakalamak için farklı zaman noktalarında ötenazi yapılan çoklu kohortlara dayanmaktadır. Bu, tek bir farede kanser gelişimi hakkında sürekli veri elde etme yeteneğini önler. Ek olarak, bireysel fare hastalığı ilerleme durumunu bilmeden, müdahale çalışmaları, belirli bir hayvanda ilerlemenin tespiti için bireysel eşiklerden ziyade, önceden belirlenmiş zaman noktalarına ve önceki kohortların ortalama bulgularına dayanmaktadır 4,5. Bu nedenle, canlı hayvanlarda uzunlamasına değerlendirmeye izin veren görüntüleme yaklaşımları, yeni ilaçların veya bileşiklerin test edilmesi için preklinik modelleri kolaylaştırmak ve patobiyolojinin anlaşılmasını hızlandırmak ve aynı zamanda titizliği ve tekrarlanabilirliği arttırmak için gereklidir6.
Ultrason görüntüleme (US), fare rahim kanseri progresyonunun uzunlamasına izlenmesi için çekici bir yöntemdir, çünkü diğer görüntüleme yöntemlerine kıyasla nispeten kolay ve ucuzdur, gerçekleştirilmesi kolaydır ve dikkate değer bir çözünürlüğe sahip olabilir 6,7. Bu non-invaziv modalite, uyanık farelerde veya 5-10 dakikalık bir muayene kullanarak kısa sedasyon altındaki farelerde mikron ölçeğindeki özellikleri yakalayabilir. Ultrason mikroskopisi, fare yumurtalık folikülü gelişimini ölçmek için bir yöntem olarak doğrulanmıştır 8 ve implante edilmiş veya indüklenmiş neoplazinin büyümesi 9,10,11. Yüksek frekanslı US ayrıca perkütan intrauterin enjeksiyonlar12 ve östrus döngüsü13 boyunca sıçan uterus değişimini gözlemlemek için de kullanılmıştır. Yüksek frekanslı US, standartlaştırılmış konum ve basınçla yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalamak için dönüştürücüyü/probu tutmak için bir ray sistemi kullanan özel sabit platformlarda tutulan farelerle kullanılabilir; ancak, bu ekipman tüm kurumlarda mevcut değildir. El tipi transdüser tarama yöntemleri, daha az özel ekipmanla benimsenebilir ve farelerde hem klinik teşhis hem de araştırma uygulamaları için kullanılabilir.
Soru, elde tutulan, yüksek frekanslı problarla ABD görüntülemenin birkaç hafta boyunca uterus kanseri gelişimini izlemek için kullanılıp kullanılamayacağı sorusudur. Bağırsaklara benzer şekilde, kemirgen uterusu, karın içinde çok hareketli olan ve çoklu doku derinlikleri boyunca bitişik olan ince duvarlı, ince bir yapıdır ve görüntülemeyi böbrekler gibi nispeten hareketsiz organlardan daha zor hale getirir. Bu çalışma, ultrason ve histopatoloji ile gözlenen dokular arasındaki korelasyonu belirlemeyi, fare rahminin yerini belirlemek için işaretleri tanımlamayı ve endometriyal kanserin uzunlamasına değerlendirmesinin fizibilitesini belirlemeyi amaçlamıştır. Bu çalışma, US tarafından görüntülenen uterusun görünümü ile histopatoloji arasında kalitatif bir yazışma olduğunu gösteren verilerin yanı sıra farelerin birkaç hafta boyunca seri görüntülemesini sunmaktadır. Bu sonuçlar, elde tutulan US'nin farelerde endometriyal kanser gelişimini izlemek için kullanılabileceğini ve böylece özel ekipmana ihtiyaç duymadan rahim kanserini incelemek için bireysel fare uzunlamasına verilerini toplamak için bir fırsat yarattığını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareleri içeren tüm prosedürler ve deneyler, Johns Hopkins Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi. Tüm prosedürler için, eldivenler ve tek kullanımlık izolasyon önlükleri de dahil olmak üzere uygun KKD giyildi. Kullanımdan hemen sonra kırmızı kutu keskin kaplara uygun şekilde atılan keskinleri kullanırken önlemler alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.
1. Doksisiklin ile iPAD (indüklenebilir Pten, Arid1a çift delesyon) farelerde endometriyal kanserin indüksiyonu
- Daha önce tarif edildiği gibi karışık bir genetik arka plan (129S, BALB / C, C57BL / 6) üzerinde 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten çift delesyonlu (iPAD) transgenik fareyi (Şekil 1) koruyun14.
- Doksisiklin tedavisinden önce her farenin yumurtalıklarının, yumurtalıklarının ve uteruslarının temel ultrason (2D) görüntülerini toplayın.
- Gen delesyonunu indüklemek için dişi iPAD farelerine 7-8 haftalıktan başlayarak en az 2 hafta boyunca sadece doksisiklin içeren fare chow diyetleri (625 mg / kg yemde doksisiklin hiplat) sağlayın.
2. Ekipman kurulumu
- Isıtma yastığını açın ve temiz bir emici ped ile örtün (hedef sıcaklık: 38 ° C).
- İzofluran buharlaştırıcının veO2 tankının yeterince doldurulduğunu onaylayın. İçeriği düşükse yeniden doldurun ve değiştirin.
- İndüksiyon odasını, burun konisini ve süpürme sistemini buharlaştırıcıya bağlayın.
- Ultrason makinesini kurun.
- Rahim veya yumurtalık görüntülemesi için sırasıyla 32-56 MHz veya 70 MHz'e kadar aralıkta bir dönüştürücü (prob) seçin.
- Probu takın ve makineyi açın.
- Sistem önyüklendikten sonra, kullanıcı kimlik bilgileriyle oturum açmak ve giriş ekranına erişmek için kontrol panelini kullanın.
- Ana ekrandan, Uygulamalar sekmesine gidin ve Fare (küçük) karın modunu seçin.
- Ana ekrana dönmek için Tara'ya tıklayın ve canlı bir görüntünün görüntülenmesini bekleyin.
- Sol araç çubuğundaki seçeneklerden B-Modu'nu seçin.
- Görüntü kazancı ve derinliği gibi görüntü iyileştirmeye yönelik ek araçları görüntülemek veya saniyedeki kare sayısı gibi klip alma ayarlarını yapmak için Diğer Denetimler'e tıklayın.
- Görüntü ayarları seçildikten sonra, Tara'ya tıklayarak ana ekrana dönün.
- O2 tankını açın, akışı indüksiyon odasına yönlendirin ve akış hızını 1 L / dak olarak ayarlayın.
3. Epilasyon da dahil olmak üzere ultrason taraması için farelerin hazırlanması
- İndüksiyon odasına bir fare yerleştirin. Anestezi indüksiyonu için izofluran buharlaştırıcıyı %2-3 vol/vol değerine ayarlayın.
- Uygun anestezi derinliğini, ayak parmağının sıkışmasına yanıt eksikliği ve 1-2 nefes / s civarında bir solunum hızı ile belirleyin.
- Her göze steril oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın. Kürkü dorsumdan çıkarın ve son kaburga ile pelvis arasındaki ventrumu uygun boyutta makaslarla çıkarın.
- Görüntülenecek ventral ve dorsal bölgelere ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın (gerekirse).
- Uygun anestezi derinliğini korumak için fareyi yaklaşık 3-5 dakika boyunca indüksiyon odasına geri yerleştirin, tüy dökücü krem saçları çıkarmak için çalışır. ≤4 dakika sonra, kremayı temiz ve nemli bir kağıt havluyla nazikçe silin.
NOT: Tüy dökücü kremaya daha uzun süre maruz kalmak tahriş edicidir ve cilt lezyonlarına neden olabilir.
4. Organlar arasındaki kontrastı arttırmak için intraperitoneal sıvı enjeksiyonu
- Steril izotonik sıvı çözeltisi (örneğin, steril% 0.9 NaCl veya Laktasyonlu Zil Çözeltisi) ile doldurulmuş 3-10 mL'lik bir şırıngayı, birkaç dakika boyunca bir ısıtma yastığı ile emici bir ped arasına yerleştirerek 35-40 ° C'ye ısıtın. Makinenin ısıtıcısı yoksa, ısıtma yastığına bir şişe ultrason jeli yerleştirin.
- 20-25 g'lık bir fare için, periton boşluğuna 1-2 mL çözelti enjekte edin.
- Fareyi bir elinizle tırnağıyla sabitleyerek ventrumu açığa çıkarın.
- Fareyi ~ 20 ° 'lik bir açıyla tutun, burun yerçekimi nedeniyle organları kafatasına yönlendirmek için yere işaret etti.
- Küçük bir ölçü iğnesi (25 G, 5/8 uzunluğunda, tüberkülin şırıngası) kullanarak, karın kaudal sağ kadranının derisinden ve karın duvarından delin.
- Sıvı enjeksiyonundan önce, vaskülatür veya GI kanalına enjeksiyondan kaçınmak için, minimum basınçla geri çekin. Şırıngaya kan veya başka bir malzeme girerse, iğneyi çıkarın. Yeni bir iğne ve şırınga kullanın ve biraz farklı bir pozisyonda tekrar deneyin.
- Fare enjeksiyonlar sırasında uyanırsa,% 2 -% 3 hacim / hacim izofluran ile anestezi için küçük indüksiyon odasına geri yerleştirin.
5. Dorsal yaklaşımdan ultrason görüntüleme
- Fareyi ventral yatışta emici ped üzerinde bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin (Şekil 2A-C).
- Bir kemirgen burun konisini farenin burnuna ve namlusuna güvenli bir şekilde yerleştirin. Burun konisinden verilen izofluran ile anestezik derinliği %100O2'de %1-%2 vol/vol aralığında koruyun. Her göze gerektiğinde steril oftalmik yağlayıcı uygulayın.
- Anestezinin ayarlanması gerekip gerekmediğini belirtmek için fareyi düzenli bir solunum hızı (1-2 / s) ve ayak parmağı sıkışma yanıtı eksikliği açısından izleyin.
- Anestezi uygulanan farenin her iki tarafındaki omurgaya, son kaburga ve pelvis arasına az miktarda (~ 0.5-1 mL) önceden ısıtılmış ultrason jeli abaksiyel (lateral) yerleştirin.
- Ultrason probu üzerine az miktarda jel koyun.
- Probu omurlara paralel olarak, probun önü kraniyal tarafa gelecek şekilde yerleştirin. Doğru prob yönünü göstermek için prob kafasında bir gösterge işareti bulunur. Toplanan her yeni görüntü kümesi için günü, saati, hayvan kimliğini, prob yönünü ve hayvan tarafını (sağ, sol, dorsal, ventral) kaydedin.
- Ventral yatışta bir fare ile (dorsum derisi proba dokunuyor), böbrek dönüm noktası için bölgeyi yavaşça tarayın (Şekil 2B ve Şekil 3). Böbrek görünürken, böbrek tarafından kraniyo-ventral olarak ve dorso-lateral olarak dorsal karın duvarı tarafından sınırlanan çok hiperekoik bir yumurtalık yağ yastığı içinde yumurtalık - hafif hiperekoik oval ila yuvarlak bir yapıyı (Şekil 4A, B) bulmak için prob kaudalını çekin.
NOT: Yumurtalık kaudal ve lateral basınç, yumurtalığı karın duvarına yaklaştırabilir ve bağırsağın halkalarından uzağa yönlendirebilir. Yumurtalık anatomik olarak dorsal karın duvarına karşı, sadece ventral ve lateral epaxial kaslara ve kaudal böbreğe doğru konumlandırılmıştır. - Görüntü kontrastını iyileştirmek için kontrol ekranının altındaki kaydırıcıyı kullanarak sinyal kazancını ayarlayın.
- Böbreğin görüntülenmesini iyileştirmek için, kontralateral karın bölgesine parmağınızla basınç uygulayın. Basıncı ve açıyı omurgaya doğrudan paralelden ~ 20 ° ventral'e değiştirin.
- İlgilendiğiniz organ görüntülendikten sonra, Klibi Kaydet veya Kaydı Başlat'a tıklayarak bir video toplayın ve ardından görüntüleri önceden ayarlanmış sayıda karede tutmak için bittiğinde Kaydı Durdurun .
- Canlı bir görüntüden veya kayıttan tek kareleri Kareyi Kaydet düğmesiyle kaydedin.
- Uterusu görüntülemek için, yumurtalık görüş alanının en kafatası yönünde olana kadar probu kaudal olarak çekin. Rahim görünene kadar prob basıncını ve açısını değiştirin.
- İlgilendiğiniz her organ için video ve kare koleksiyonunu tekrarlayın.
- Dorsal karın duvarı boyunca uzunlamasına uzanan uterusu, lateral bacak kas sistemi de görünümde olacak şekilde bulun (Şekil 4B).
NOT: Rahim büyüklüğü ve lümen çapı östrusun evresine ve hastalık durumuna göre değişebilir. - Bağırsak halkalarını uterus sabit boynuzlarından ayırt etmek için dokuyu peristaltik hareket için izleyin.
6. Ventral yaklaşımdan görüntüler toplayın
- Fareyi sırt yassılığına yerleştirin ve göz yağlamasının yeterli olduğunu ve namlunun burun konisinde güvenli bir şekilde durduğunu kontrol edin (Şekil 2A).
- Ventral karın bölgesine az miktarda (~ 0.5-1 mL) önceden ısıtılmış ultrason jeli uygulayın ve mesaneyi hipoekoik bir dönüm noktası olarak bulmak için probu pubisin sadece kraniyalinin orta hattına uygulayın (Şekil 5).
NOT: Mesane çok büyükse ve uterus görüntülemesini gizliyorsa, idrarı ifade etmek için alt karın bölgesine hafif basınç uygulanabilir. - Uterus boynuzlarını bulmak için probu lateral mesaneye çekin. Boynuzları görüş alanına getirmek için farenin her iki tarafından veya her iki tarafından hafif dijital basınç uygulayın. Probu fareye dik tutun ve her iki boynuzun enine görünümlerini (enine kesitleri) yakalamak için karnın her iki tarafını tarayın. Sagital görünümleri yakalamak için probu döndürün.
- Ultrasondan sonra, fareyi bir kağıt havluyla jelden temizleyin ve iyileşmek için kafesine geri koyun. Fareler 2-5 dakika içinde tamamen uyanıktır. Tamamen uyanık ve ayakta durduğunda, fareyi hayvan odasına geri getirin.
NOT: Geri kazanım için kafesi ısıtmak üzere kafesin altına düşük ısıda bir ısıtma yastığı yerleştirilebilir. - Deneysel veya insancıl bitiş noktasında, fareyi ötenazi yapın. İdeal olarak, stresi azaltmak için fareyi ev kafesinde ötenazi yapın; Alternatif olarak, fareyi temiz bir odaya yerleştirin. Basınçlı CO2'yi , dakikada oda hacminin% 10-30'u arasında bir yer değiştirme hızında teslim edin. Görünür solunum olmadan yaklaşık 5 dakika sonra, servikal çıkık ile ölümü doğrulayın. Tümör hasadı için abdominal nekropsi ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten çift delesyonlu (iPAD) transgenik fareler, daha önce tarif edildiği gibi karışık bir genetik arka plan (129S, BALB / C, C57BL / 6) üzerinde tutuldu14. Farelerin hepsi, Cre rekombinazını indüklemek için 2 hafta boyunca bir doksisiklin yemi ile beslendi. Grubumuz tarafından yapılan önceki çalışmalarda, doksisiklin gavage14 ile dozlandı; Bununla birlikte, bu güncel çalışmada, doksisiklin yem indüksiyon yöntemi verimli bir şekilde çalıştı ve fareler için gavaj stresini azalttı. Doksisiklin uygulama yönteminin, uterus gibi Pax8 eksprese eden hücrelerde tümör baskılayıcılar (Arid1a ve Pten) için DNA'yı eksize etmek için gereken Cre rekombinaz ekspresyonunu indüklemek için yeterli olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Şekil 6'da görüldüğü gibi, uterus epitel hücrelerinde komşu stromal dokuya kıyasla yeterli tümör baskılayıcı protein kaybının sağlanıp sağlanmadığını kontrol etmek için ARID1a ve pTEN14'e yönelik antikorlarla immünohistokimya kullanıldı. Fare modelinin şeması ve tümör baskılayıcı ekspresyon regülasyonu Şekil 1'de sunulmuştur.
2 haftalık doksisiklin tedavisinden sonra uterus, kontrollere veya doksisiklin uygulamasından önce görüntülenen aynı fareye kıyasla boyut olarak önemli ölçüde değişmedi. Yine de, doksisiklin sonrası önümüzdeki 2-6 hafta boyunca, ultrason, farelerin hiperplazi ile başlayan ve adenokarsinoma ilerleyen bir dizi uterus patolojisi geliştirdiğini gösterdi. Şekil 7A, B, 3 haftalık doksisiklin tedavisinden sonra görülen erken patoloji değişiklikleri ile bir fare uterusunun US görüntülerini göstermektedir. Şekil 7C,D, fare 3 haftada görüntülemeden hemen sonra ötenazi yapıldıktan sonra Şekil 7A,B'de görüntülenen aynı uterusun brüt patolojisini ve histopatolojisini göstermektedir. Daha küçük (ancak genişlemiş) ince duvarlı uterus ve belirgin lümenin (merkezi hiperekoik uterus sıvısı) korunmasıyla erken endometrial hiperplazi gözlenebilir. Daha sonraki zaman noktalarında ötenazi yapılan farelerde, uterus çok daha büyüktü, daha küçük bir lümeni vardı ve kalınlaşmış bir duvarı vardı (Şekil 8 ve Şekil 9). Dilate lümen örnekleri ve hiperplastik endometriyumdaki ince değişiklikler Şekil 8 ve Şekil 9'da uterustaki yoğun doku ve nodüler kanser büyümesi ile karşılaştırılmıştır. Ultrason ve brüt görüntüler, temsil edilen tüm fareler için birbirleriyle oldukça tutarlıydı. Şekil 9, bir zaman kursu çalışmasında aynı fareden birden fazla uterus görüntüsü sunmakta ve adenokarsinom geliştikçe 6 hafta boyunca gözlenen morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Şekil 5, hipoekoik mesaneye bitişik uterus boynuzlarının kesitleri ile ventral bir yaklaşım sunmaktadır.
Karındaki kontrastı arttırmak için, görüntülemeden hemen önce karın boşluğuna salin enjekte etmek, rahim ve yumurtalıklar da dahil olmak üzere karın organlarının görselleştirilmesini iyileştirdi. Şekil 3 , 1 mL salin enjeksiyonundan önce ve sonra aynı fareden ultrason karşılaştırmalarını göstermektedir. Salin ile, organlar arasında böbrek, yağ yastığı, yumurtalık, uterus boynuzları, bağırsaklar ve dalağın birbirinden daha kolay bireyselleştirilmesine izin veren artmış bir hipoekoik boşluk (siyah) vardı. Burada sunulan diğer tüm şekillerde, görüntü netliğini artırmak için görüntülemeden önce salin enjeksiyonları yapılmıştır.
Birlikte ele alındığında, bu protokol, bu indüklenebilir fare modelinin 6 haftalık bir süre boyunca adenokarsinom geliştirdiğini ve bir taban çizgisi oluşturmak ve kanser geliştikçe uterustaki morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için ultrasonla izlenebileceğini göstermektedir. Burada, non-invaziv ultrasonun, bir faredeki uterus boynuzlarının, gerçek uterus patolojik değişikliklerini öngören görüntülerle birkaç hafta boyunca seri olarak değerlendirilmesine izin verdiği gösterilmiştir.
Şekil 1: Pax8-Cre ile indüklenebilir çift KO transgenik farelerin üretimi için strateji. (A) Pax8 eksprese eden uterus epitel hücrelerinde ters tetrasiklin kontrollü bir transaktivatörün (rtTA) yapısal üretimi, tetrasiklin yanıt elemanlarına (TRE) bağlanarak tetrasiklin veya analog doksisiklin varlığında Cre rekombinazın indüklenebilir aktivasyonu ile sonuçlanır. Ekzon 8 (Arid1a) ve ekzon 5'in (Pten) yukarı ve aşağı akımında bulunan floks bölgeleri Cre rekombinaz tarafından hedeflenir. Arid1a'da ekzon 8'in kre hedefli delesyonu, bir çerçeve kayması mutasyonu ve erken durdurma kodonu ile sonuçlanır (p.Gly809Hisfs * 6). Pten'de ekzon 5'in cre hedefli delesyonu, bir frameshift mutasyonu ile sonuçlanır (p.Val85Glyfs * 14). (B) Pax8-rtTA faresi, Pax8 promotörünün kontrolü altındaki ters tetrasiklin kontrollü bir transaktivatörü (rtTA) ifade eder. Bu fare, Cre rekombinazını tetrasikline bağımlı bir şekilde ifade eden TetO-Cre faresi ile çaprazlanır. Bu geçişten elde edilen soy, Pax8 eksprese eden uterus epitel hücrelerine (Pax8-Cre transaktivatör) özgü tetrasiklin (veya doksisiklin) ile aktive edilmiş bir Cre rekombinazını ifade eder. (C) 129S1 arka planındaki Arid1a flox/flox fareleri, Arid1a flox/flox/Pten flox/flox transresponder fareyi üretmek için BALB/C arka planında Ptenflox/flox ile çaprazlandı (Suş C;129S4-Ptentm1Hwu/J). (D) Pax8-Cre transaktivatör fare, bir Arid1a flox/flox/Ptenflox/flox Transresponder fare ile çaprazlanır. Bu geçişten elde edilen soy, uterus epitel hücrelerine özgü doksisiklin indüklenebilir Arid1a ve Pten delesyonu (iPAD) ile transgenik bir murin modeli ile sonuçlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görüntüleme prosedürü . (A) Karın ve sırt kürkü bir kesme makinesi ve tüy dökücü krem ile çıkarılmış anestezi uygulanmış bir fare. Fare, bir burun konisi aracılığıyla inhalan izofluran anestezisi üzerinde tutulur ve emici bir ped ile kaplı bir ısı yastığı üzerine yerleştirilir. (B) Az miktarda önceden ısıtılmış ultrason jeli, farenin ve probun üzerindeki ilgili bölgeye yerleştirilir. Burada, fare ventral yatışma içindedir ve prob, anatomik dönüm noktası olan böbreği doğrudan yumurtalığa yerleştirmek için doğru şekilde yerleştirilir. (C) Dorsal yatışta, prob, uterus boynuzlarının yaklaşık yerini bulmak için mesane gibi işaretleri bulmak için manuel olarak manipüle edilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Salin enjeksiyonu ile görünürlüğün ve organ tanımının iyileştirilmesi. (A) 1.5 mL ısıtılmış, steril salinin IP enjeksiyonundan önce bir böbreğin ve GI yolunun halkalarının (sol altta) görüntüsü. Görüntünün sol tarafı böbreğe kranial olarak verilir. (B) Tuzlu su enjeksiyonundan sonra böbreğin görüntüsü, organlar arasında artmış (hipoekoik boşluk, siyah) gösterir. Her iki görüntü için, oryantasyon açısından, fare dorsal yüzey yukarıdadır ve kraniyal ila kaudal soldan sağa doğrudur. (C,D) Vurgulanan kırmızı bölüm, A ve B'de sunulan 2D görüntülerdeki böbrek işaretlerini gösterir. Görüntüler bir MS550 dönüştürücü kullanılarak çekilmiştir. Ölçek çubukları = her görüntüde 2 mm. Kısaltmalar: GI yolu = gastrointestinal sistem; IP = intraperitoneal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Yer işaretleri olan üreme yolu . (A) Yumurtalık (ok) hemen kaudal olarak böbreğin kaudal kutbuna yerleştirilir. (B) Rahim boynuzu (dar ok) derindir ve proksimal arka bacağın (ok ucu) dorsal kaslarına kranial olarak başlar, yumurtalık da görünürde (daha büyük ok). Ölçek çubukları = 2 mm. Tüm görüntüler için, oryantasyon açısından, fare dorsal yüzeye çıkar ve kraniyal ila kaudal soldan sağa doğrudur. Görüntüler bir MS550 dönüştürücü kullanılarak çekilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Uterus boynuzları ve mesane, dorsal yatışmadan görüntülendi. Kanser indüksiyonundan önce iki fareden ultrason görüntüleri. (A) Mesane lümeni, hiperekoik mukozalı hipoekoik, oval bir yapı olarak görülebilir. Her iki rahim boynuzu da birlikte görülebilir ve her birinin sınırları açık mavi renkte izlenir. (B) Çok daha dolgun bir mesanesi olan başka bir farede aynı görünüm. Her iki görüntü için, oryantasyon açısından, fare ventral yüzey yukarıdadır ve soldaki görüntü farenin soludur. Her rahim boynuzunun sınırları, komşu metin kutularında (MS550 dönüştürücü) verilen alanlarla birlikte açık mavi renkte çizilir. Ölçek çubukları = 3 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bir iPAD faresinde indüksiyondan 6 hafta sonra uterus kesitlerinin H&E ve immünohistokimya örnekleri . (A) iPAD fare uterus dokusunun H&E temsilcisi. (B) Temsili ARID1a immünohistokimyası. Boyama, Pax8 eksprese eden uterus epitel hücrelerinin (siyah ok) çekirdeklerine özgü Arid1a kaybını ve Arid1a'nın uterus stromal hücrelerinin çekirdeklerinde (beyaz ok) tutulmasını gösterir. (C) Temsili pTEN immünohistokimyası. Boyama, Pax 8 eksprese eden uterus epitel hücrelerinin sitoplazmasında (siyah ok) pTEN kaybını ve uterus stromal hücrelerinin sitoplazmasında pTEN'in tutulmasını gösterir (beyaz ok). Ayrıntılı IHC yöntemleri daha önce yayınlanmış14. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: iPAD = indüklenebilir Pten, Arid1a çift silme; H&E = hematoksilin ve eozin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Patolojide erken değişiklikler olan farelerden alınan ultrason görüntülerine örnekler. (A,B) Doğal olarak hiperekoik olan uterus sıvısı ile dolu bir uterusun antemortem ultrason görüntüsü Dar oklar uterusun hipoekoik, genişlemiş lümenini gösterir. Ok ucu, uterus duvarının kalınlaşmış alanını gösterir. (C) B'de görüntülenen fareden tüm uterusun brüt görüntüsü. Beyaz yıldız işareti, A'da gösterilenle kabaca aynı konumdadır. (D) Aynı farede, rahim H&E ile işlendi ve boyandı. Histoloji bölümü, endometrial hiperplaziye bağlı olarak uterus duvarının kalınlaşmasını gösterir; Örnek bölge bir ok ucuyla gösterilir. Tüm ABD görüntüleri için, yönlendirme açısından, fare dorsal yüzeyi yukarıdadır ve kraniyal ila kaudal soldan sağa doğrudur (MS550 dönüştürücü). Ölçek çubukları = (A,B) 3 mm; (D) 500 μm. Kısaltmalar: US = ultrason; H&E = hematoksilin ve eozin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Ultrason ile görülebilen uterus patolojisinin çeşitliliği . (A) ~2.5 mm çapında luminal dilatasyona neden olan hiperplazi ve sıvı distansiyonu olan bir uterus. (B) Daha büyük derecede şişmiş hiperplazili ikinci bir uterus. (C) Hem genişlemiş hem de yumuşak doku kütlesi ile doldurulmuş bir uterus. Ölçek çubukları = 3 mm. Tüm görüntüler için, oklar uterus boynuzunun ventral tarafındadır ve görüntü oryantasyonu açısından, fare dorsal yüzeye yukarı ve kraniyal kaudal soldan sağa doğrudur (MS550 dönüştürücü). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Bir farede uterusun neoplastik gelişiminde zaman içinde meydana gelen değişiklikler. (A) Böbreği (daha geniş ok), yumurtalığı (kaudalden böbreğe doğru) ve uterusu (dar ok) gösteren, bacak kası da görünür (ok ucu) olan bir iPAD faresinin ultrason görüntüsü, üç zaman noktasında yakalanmıştır: fare bir doksisiklin diyetine başladıktan sonra (0. hafta), ve sonra tekrar 5 hafta ve 6 hafta sonra. Doksisiklin tümör baskılayıcı kaybı ile Cre ekspresyonunu indükledi ve bu da zamanla endometriyal kanseri teşvik etti. (B) A ile aynı ultrason görüntüleri, ancak uterus boynuzu kırmızı renkle vurgulanmış. (C) 6 haftalık zaman noktasından uterusun in situ (dar ok) brüt görüntüleri; Doku ventral yüzeyden görülür. (D) C disseke ex vivo ile aynı uterus; Doku ventral yüzeyden görülür. (E) Bu örnekten adenokarsinomu gösteren uterus kitlesinin histolojisi (H&E boyası). A ve B için, oryantasyon açısından, fare dorsal yüzeyi yukarıdadır ve kraniyal ila kaudal soldan sağa doğrudur (MS550 dönüştürücü). Ölçek çubukları = (A,B, her satırdaki ilk iki görüntü) 1 mm; (A,B, üçüncü görüntü) 2 mm; (E) 500 μm. Kısaltmalar: iPAD = indüklenebilir Pten, Arid1a çift silme; H&E = hematoksilin ve eozin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, farelerde uterusta adenokarsinomun ilerlemesindeki uterus morfolojik değişikliklerini değerlendirmek için ultrasonun yararlılığını incelemektedir. Bu çalışmada, farelerde endometriyal kanser indüksiyonunu uzunlamasına takip ederek, ultrasonografi ile saptanan anatomik detayların kaba ve histolojik patolojinin göstergeleri olduğu bulunmuştur. Bu, farelerde rahim kanserlerinin ilerlemesini takip etmek için birden fazla zaman noktasında ultrason tarafından izlenen daha az sayıda fare ile uzunlamasına çalışmaların kullanılması için kapıyı açar. Bu uzunlamasına tespit, elde taşınan bir prob kullanılarak ve raylı sistem ultrason ekipmanı kullanılmadan gerçekleştirildi. Kullanılan yüksek frekanslı problar (transdüserler) yaygın olarak mevcuttur ve bu yaklaşımı dünya çapında birden fazla kurumda tekrarlanabilir hale getirmektedir. Protokoldeki kritik adımlar, deney için gereken çözünürlük seviyesi için doğru probu kullanmayı ve fareyi ultrasondan önce görüntüleme için hazırlamayı içerir.
Fareyi hazırlamadaki kritik adımlar, tüm kılları çalışma alanlarından çıkarmak ve periton boşluğuna sıvı enjekte etmektir. Ciltte kalan kürk, ultrason jelinde kabarcıkların sıkışmasına neden olabilir, bu da görüntülerde eserler üretebilir; Bu nedenle, saçların çalışma alanı üzerinde eşit şekilde çıkarılmasına özen gösterilmelidir. Tüy dökücü krem, kürkü cilt boyunca eşit şekilde çıkardığı için epilasyon yöntemi olarak seçildi. Krem ciltte aşırı süre (>3-4 dakika) bırakılırsa ciltte yaralanma meydana gelebilir. Tüy dökücü kremaya karşı daha hassas farelerde, krem saçları çıkarmak için ciltte sadece 1-2 dakika bırakılmalıdır. Daha sonra, kremayı tamamen çıkarmak için fare bir dizi ıslak kağıt havlu ile silinmelidir. Tüm saçlar çalışma alanından çıkarıldıktan sonra, kontrastı arttırmak ve karın organlarının sınırlarını tanımlamaya yardımcı olmak için intraperitoneal boşluğa steril, sıcak izotonik sıvılar enjekte edilir. Bu çalışmada yumurtalık, yumurta kanalı ve uterus boynuzlarını ayırt etmek için 1-2 mL sıvı enjekte etmek yeterliydi. Sıvı yavaş yavaş emilir ve görüntülemeden hemen önce enjekte etmek en iyisidir. Fareler izofluran anestezisi altında hızla hipotermik hale gelir. Bu, ılık salin enjekte edilerek (bir ısıtma yastığı üzerindeki şırıngalarda saklanır) ve ayrıca fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirerek ve mümkün olduğunda ultrason jelini önceden ısıtarak önlenebilir. Deneyimli sonografi uzmanlarıyla yapılan görüntüleme seansları 5-10 dakika / farede çalışır ve bu kısa sürede belirgin hipotermi oluşmaz. Gerekirse, organların daha fazla ayrılması için karın içine ilave 2 mL'ye kadar salin enjekte edilebilir.
Burada açıklanan yöntemlerin, ultrason makinesi ve problarının ötesinde özel ekipman olmadan kolayca tekrarlanabilmesi amaçlanmıştır. Sunulan yöntemde, prob bir raylı sistemden yardım almadan manuel olarak manipüle edilir. Bu manuel yöntem daha hızlıdır ve küçük özellikleri vurgulamak için uygulanan açılarda ve basınçta büyük esneklik sağlar. Probların karın üzerinde manuel olarak yönlendirilmesi ve daha düşük çözünürlüklü transdüserlerin kullanılması, raylı sistem4'e sabitlenmiş bir dönüştürücüden gelen görüntülerle karşılaştırıldığında, elde edilen herhangi bir bireysel görüntünün kalitesini sınırlayabilir. Bir raylı sistem, daha fazla stabiliteye ihtiyaç duyulduğunda uterusa (fetüslere) veya intrakardiyak enjeksiyonlara enjeksiyonlar için yararlı olacaktır. Bununla birlikte, minimum manipülasyon süresi ve özel ultrason tesislerinden yoksun çok çeşitli kurumlar için artan erişilebilirlik ile ilgili bir denge vardır. Bu basitleştirilmiş yöntemin başarısı, ultrasonun bir dizi çalışma için nasıl kullanılabileceğini örneklemektedir. Önerilen yöntem, rahim kanseri modellerinde uzunlamasına doku değişikliklerini özel ekipman gerektirmeden yakalamak için çok uygundur ve diğer ilerleyici hastalık modellerine uygulanabilir. Görüntüleme sırasında farelerin manuel manipülasyonu, tam doku derinliği ve konumundaki değişkenliği artırabilir, ancak bu faktörlere dayanmayan çalışmalar için, görüntü kalitesi patolojik değişiklikleri tespit etmek için yeterlidir.
Görüntüleme sırasında videoları kaydetmek önemlidir; Daha sonra kullanıcının iş istasyonunda, videolar yakalanması ve ölçülmesi gereken anatomiyi temsil eden herhangi bir karede durdurulabilir. Organların görüntüleri ölçülebilir (çap, çevre veya uzunluk) (Şekil 5, uterus boynuzu kesiti ölçülür) ve tümör alanı hesaplanabilir. Videolar, tek karelerden daha fazlası, organların daha geniş anatomik bağlamda tanımlanmasını kolaylaştırır. Videolar, bağırsakların uterustan ayırt edilmesine yardımcı olabilecek ince ve kalın bağırsakların hareketini belirlemek için de yararlıdır. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek aynı zamanda fare anatomisine aşinalığa da bağlıdır. Hareketli uterusu görüntülemek ve daha sabit dokuları (örneğin, implante edilmiş bir ksenogreft tümörü, yumurtalıklar) görüntülemek için, manuel yöntemi kullanmak, uterus boynuzlarını proksimalden distal'e kadar tarama ve takip etme avantajına sahiptir. Tarama sırasında, kornayı takip etmek için el açılarının kademeli olarak ayarlanması kullanılabilir. MS550 probu bu bu çalışmada tüm görüntüleme için kullanılmıştır ve yumurtalıklar için daha iyi olan daha yüksek çözünürlüklü MS700 probuna kıyasla uterus için tercih edilir. Fare tiroidini görüntülemek için MS700'ü kullanan çalışma yakın zamanda yayınlanmıştır ve diğer dokularda mümkün olan yüksek çözünürlüğü sergilemektedir15. Elde tutulan prob görüntüleme, uterusun yumurtalık ve mesane arasındaki değişen doku derinliği dereceleri nedeniyle yararlıdır. Bu çalışmada, böbrek ve proksimal arka bacak anatomisi gibi kolayca tanınabilir anatomik yerler arasında hareket etmek, uterusu vücuttaki dorsal açıdan görüntülerken farklı zaman noktalarında karşılaştırılabilir görüntüler yakalamaya yardımcı oldu.
Tümörigenez sırasında uterustaki anatomik değişiklikleri zaman içinde takip etmek için kullanılan bu yüksek çözünürlüklü ultrason yöntemi, farklı zaman noktalarında birden fazla kohorttan hayvanların ötenazisini içeren mevcut yöntemlerden daha üstündür. Ultrason modeli rafine eder ve deney için gereken fare sayısını azaltır, böylece maliyetleri ve zamanı azaltır. Önemli olarak, bu yöntem hastalığın ilerlemesinin bireysel düzeyde izlenmesine izin verir, bu da hastalık evresinden ziyade zaman noktasına göre feda edilen kohortlara bağlı çalışmalarda maskelenen içgörülere yol açabilir. Non-invaziv doğası nedeniyle, fare ultrasonu rahim veya yumurtalık kanserinde araştırma için birçok potansiyel uygulamaya sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
NCI Yumurtalık Kanseri SPORE Programı P50CA228991, doktora sonrası eğitim programı 5T32OD011089 ve Richard W. TeLinde Vakfı, Johns Hopkins Üniversitesi'nden fon sağladıkları için minnettarız. Proje ayrıca kısmen Japonya Özel Okulları için Teşvik ve Karşılıklı Yardım Kurumu'ndan Özel Yüksek Öğretim Kurumlarına yapılan cari harcamalar için sübvansiyonlarla finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
