Summary

Non-chirurgicale instillation intratrachéale de souris avec analyse des poumons et les ganglions lymphatiques drainant poumon par cytométrie en flux

Published: May 02, 2011
doi:

Summary

Nous illustrons non-chirurgical de livraison du matériel de test dans les poumons des souris anesthésiées par la trachée. Cette méthode permet l'exposition des poumons à des agents pathogènes bactériens et viraux, les cytokines, des anticorps, des perles, des produits chimiques, ou des colorants. En outre, nous décrivent la récolte et la transformation des poumons et les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) pour la cytométrie de flux.

Abstract

Les cellules phagocytaires telles que les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques pulmonaires (PMA) en continu de l'échantillon les antigènes des espaces alvéolaires dans les poumons. PMA, en particulier, sont connus pour migrer vers les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) où ils présentent les antigènes aux cellules T inhalé initier une réponse immunitaire appropriée à une variété d'immunogènes 1,2. Pour le modèle des interactions entre les poumons et les antigènes en suspension dans les souris, les antigènes peuvent être administrés par voie intranasale 1,3,4, intratrachéale 5 ou 6 sous forme d'aérosols. Livraison par chaque itinéraire implique distinctes des compétences techniques et des limitations qui doivent être considérés avant de concevoir une expérience. Par exemple, l'exposition intranasale et sous forme d'aérosol fournit des antigènes à la fois dans les poumons et les voies respiratoires supérieures. Ainsi antigènes peuvent accéder le tissu lymphoïde associé nasales (NALT) 7, potentiellement compliquer l'interprétation des résultats. En outre, la déglutition, l'éternuement et la fréquence respiratoire de la souris peut aussi conduire à des incohérences dans les doses délivrées. Bien que l'implication des voies respiratoires supérieures peut être préférable pour certaines études, cela peut compliquer les expériences portant sur des événements spécifiquement initiée dans les poumons. Dans ce cadre, le intratrachéale (it) la route est préférable car elle offre le matériel de test directement dans les poumons et contourne le NALT. De nombreux protocoles d'injection l'impliquer intubation soit aveugles de la trachée à travers la cavité buccale ou de l'exposition chirurgicale de la trachée d'accéder à des poumons. Nous décrivons ici un simple, cohérente et non-chirurgical méthode pour qu'il l'instillation. L'ouverture de la trachée est visualisée à l'aide d'un laryngoscope et une aiguille tordue gavage est ensuite inséré directement dans la trachée pour livrer l'inoculum. Nous avons également décrire les procédures de récolte et de transformation des LDLNs et des poumons pour l'analyse du trafic de l'antigène par cytométrie en flux.

Protocol

1. Avant le processus, de préparer et de rassembler les éléments suivants S'il vous plaît se référer à l'image de la figure 1a) et 1b) pour la construction d'une plateforme en bois pour retenir la souris durant la procédure. Mélange de digestion des ganglions lymphatiques – HBSS + 1.25mg/ml collagénase TypeIV ou 2,5 mg / ml de collagénase D Mélange de digestion des poumons – HBSS + 1 mg / ml de collagénase Diluer billes de latex (1:20) dans du PBS pour l&…

Discussion

Nous avons utilisé ce protocole pour étudier le trafic de spores de Bacillus anthracis à partir des poumons vers le LDLNs. Pour des applications similaires, le nombre de particules délivré aux poumons doivent être soigneusement choisis de sorte que le matériau injecté peut être détecté dans le LDLNs par cytométrie en flux. Nous avons également utilisé avec succès cette méthode pour le transfert adoptif de cellules et d'étiquetage des populations spécifiques de cellules pulmonaires en utili…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
70μm Cell stariner BD    
Aniline Blue Fisher A967-25  
Animal Feeding needle Popper and Sons Inc 7920  
Collagenase Sigma C2139  
Collagenase TypeIV Worthington    
Collagenase D Roche 11088974103  
DPBS Invitrogen 14190  
Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) Polysciences, Inc 17152  
HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride Invitrogen 14170  
Ketamine HCl  (100mg/ml) Hospira Inc    
Laryngoscope Blade PennCentury, Inc For Model LS-1 Refer to www.penncentury.com
Lightweight Fiber Optic Laryngoscope WelchAllyn 80814  
Red Fluorescent Beads (0.5μm) Invitrogen F8812 For i.p injection
Xylazine (100mg/ml) Lloyd Laboratories    

References

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Cite This Article
Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702, doi:10.3791/2702 (2011).

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